Xrcc2启动子、含有xrcc2启动子的载体、载体的构建及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种XRCC2启动子、含有XRCC2启动子的载体、载体的构建及应用，属 于基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是严重危害人类健康及生命的疾病之一，其死亡率高居各类疾病之首。因此， 除应用传统的手术、放疗及化疗等方式治疗肿瘤W外，不断开发全新的肿瘤治疗方式对于 缓解肿瘤给人类健康造成的巨大威胁刻不容缓。随着病理学及分子生物学等学科的不断发 展，人们逐渐意识到肿瘤是一种多因素、多步骤和多基因共同参与的"基因病"，多种原癌基 因的激活及抑癌基因的失活被认为是肿瘤发生的重要诱因。因此，W改变人遗传物质为基 础的基因治疗是针对肿瘤发生根源的本质治疗方法。由于具有针对性强及效果显著等突出 优势，基因治疗为肿瘤治疗领域带来了具有里程碑意义的一次革命。
[0003] 合理利用肿瘤基因组学的改变是肿瘤基因治疗的一种重要策略，其被证实能够特 异性祀向肿瘤细胞，而对正常组织影响有限，具有良好的可控性及祀向性。诸多研究表明运 用在肿瘤细胞中具有高活性的基因表达调控原件如启动子调控报告基因或自杀基因的表 达能够有效应用于肿瘤的诊断及治疗。例如，有研究者构建了由端粒酶催化亚基化TERT) 的启动子控制促调亡蛋白化spaseS表达的载体，体内外实验均表明其对肿瘤细胞有特异 性的杀伤作用；此外，用Rad51启动子调控巧光素酶或自杀基因DTA的表达被证实能够实现 体内肿瘤的可视化及祀向性治疗。然而，由于在肿瘤细胞及正常细胞中活性差异不够大而 使得肿瘤祀向性不高或启动子片段过长而导致难W利用传统方式将其高水平转运入肿瘤 细胞等缺陷，大大限制了已发现的在肿瘤细胞中活性较高的启动子运用于肿瘤基因治疗的 可能性。因此，寻找更多有效并具有临床应用前景的在肿瘤细胞中特异性激活的蛋白启动 子将为更好地推动肿瘤的基因治疗奠定基础。
[0004] XRCC2是DNA同源重组（HR)修复通路关键蛋白分子Rad51家族中的重要成员，其 被证实能够与其他Rad51家族蛋白结合共同参与皿修复过程或识别DNA损伤位点，募集修 复蛋白，在皿修复的早期阶段发挥重要作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种XRCC2启动子、 含有XRCC2启动子的载体、载体的构建及应用。
[0006] 本发明的目的可W通过W下技术方案来实现：
[0007] 技术方案一；
[0008] 一种XRCC2启动子，其序列如SEQIDNO. 1所示。
[0009] 技术方案二；
[0010] 一 种含有XRCC2 启动子的载体，包括PXRCC2-GFP、pXRCC2-Luciferase、 PXRCC2-DTA、pXRCC2-其他毒蛋白、AAV-pXRCC2-Luciferase及化gw-pXRCC2-Luciferase， 其中pXRCC2指代XRCC2启动子。
[0011] 所述的DTA为白喉毒素的A亚基，能够抑制细胞内多种蛋白的合成，具有很强的 细胞毒性，其序列如SEQID^.2所示；所述的其他毒蛋白包括调亡家族蛋白033口3363、 caspase6、caspase7、caspaseS等能够诱导细胞死亡的蛋白。
[0012] 技术方案
[0013] 如技术方案二所述的含有XRCC2启动子的载体的构建方法，具体如下；
[0014] (l)pXRCC2-GFP质粒的构建；
[0015] W人皮肤成纤维细胞系细胞的基因组DNA为模板，XRCC2 5'及XRCC2 3'分别 为上下游引物，PCR扩增5'端含有EcoRI、3'端含有Agel酶切位点的PXRCC2序列，将 pRad51C-GFP质粒及扩增完成的PXRCC2片段用限制性内切酶EcoRI及Agel进行酶切，跑胶 鉴定并回收相应片段后进行连接反应，构建完成PXRCC2-GFP质粒；
[0016] (2)pXRCCS-Luciferase质粒的构建；
[0017] WPXRCC2-GFP质粒为模板，采用上下游引物XRCC2-Luciferase5'及 XRCC2-Luciferase3'PCR扩增两端分别含有Miel及Hindlll酶切位点的PXRCC2， 将PXRCC2片段与pGL3-basic质粒采用Miel及Hindlll进行酶切，跑胶鉴定后，分 别回收PXRCC2片段及pGL3-basic质粒的线性化片段并进行连接反应，构建完成 pXRCC2-Luciferase质粒；
[001引 （3)pXRCC2-DTA质粒的构建；
[0019] 采用上下游引物XRCC2-DTA5' 及XRCC2-DTA3'，WAd2-DTA-N肥J质粒为模板PCR 扩增两端分别含有Agel与Notl酶切位点的DTA片段，将该DTA片段及PXRCC2-GFP质粒分 别采用Agel及Notl进行酶切，回收相应片段并进行连接反应，构建完成PXRCC2-DTA质粒；
[0020] (4)AAV-pXRCC2-Luciferase质粒的构建；
[0021] 将正义链序列为CGCGTGCTAGCGAATTCGGTACCT，反义链序列为 CTAGAGGTACCGAATTCGCTAGCA的〇1igo进行稱火反应，并分别采用限制性内切酶Mlul 及甜al酶切经稱火完成的片段，同时将AAV-MCS质粒采用限制性内切酶Mlul及甜al 酶进行酶切，连接酶切完成后的相应片段，构建完成的质粒命名为质粒1，将质粒1及 pXRCC2-Luciferase质粒采用化el及甜al酶切后的相应产物进行连接反应，构建完成 AAV-pXRCC2-Luciferase质粒；
[002引 （S^ugw-pXRCCS-Luciferase质粒的构建；
[0023] 设计并合成正义链序列为TAAGCTAGCTCTAGAG，反义链序列为 TAATTCGATCGAGATCTCTTAA的〇1igo片段，进行稱火反应，分别采用限制性内切酶化cl 及EcoRI酶切化gw慢病毒载体，胶回收后得到线性化片段，连接该线性化片段和已 稱火的〇1igo片段，得到化gw-oligo载体，采用限制性内切酶化el、甜al及Sail酶 切pXRCC2-Luciferase质粒，并同时采用Miel及甜al酶切F^igw-oligo载体，跑胶鉴 定后胶回收pXRCC2-Luciferase和F^igw-oligo线性化片段并进行连接反应，构建完成 Fugw-pXRCC2-Luciferase质粒。
[0024] 各种载体的构建过程中，引物XRCC2 5'序列如SEQIDNO. 7所示，
[0025]引物XRCC2 3' 序列如SEQIDNO. 8 所示，
[0026]引物XRCC2-Luciferase5' 序列如SEQIDNO. 9 所示，
[0027]引物XRCC2-Luciferase3'序列如SEQIDNO.10所示，
[0028]引物XRCC2-DTA5' 序列如SEQIDNO.11所示，
[0029]引物XRCC2-DTA3'序列如SEQIDNO.12所示。
[0030] 技术方案四；提供含有XRCC2启动子的载体的应用。
[0031] 由于相较于正常细胞，在不同肿瘤细胞中XRCC2蛋白的表达呈显著上调，并且由 XRCC2启动子（PXRCC2)介导的GFP及Luciferase能够在肿瘤细胞中特异性表达，因此所 述的PXRCC2-GFP与pXRCC2-Luciferase用于制备肿瘤诊断试剂。
[0032] 利用在肿瘤细胞中特异性激活的蛋白启动子及具有较强细胞毒性的蛋白实现祀 向性肿瘤治疗是肿瘤基因治疗的一种重要方式。将PXRCC2-DTA质粒转染入不同细胞并进 行细胞计数后发现，PXRCC2-DTA剂量依赖性地抑制肿瘤细胞的生长，而对正常细胞几乎不 产生生长抑制作用。基于此，认为由XRCC2启动子介导毒蛋白的表达能够选择性地杀伤肿 瘤细胞，是一种安全有效的肿瘤治疗方式。因此所述的pXRCC2-DTA、pXRCC2-其他毒蛋白用 于制备肿瘤治疗药物。
[0033] 针对肿瘤生长、侵袭、转移、信号转导及微环境中的关键标志物，应用分子成 像新方法，在活体状态下对肿瘤组织进行准确的定位，实现基于标志物的恶性肿瘤早 期、特异及准确诊断，对于肿瘤的治疗及预后具有极其重要的意义。因此，利用XRCC2 启动子活性在肿瘤细胞中显著增强该一分子特性，基于AAV-XRCC2-Luciferase及 Rigw-pXRCC2-Luciferase重组质粒的成功构建及细胞水平功能的验证，推测由XRCC2启动 子介导Luciferase在肿瘤细胞中的特异性表达能够实现在体肿瘤的可视化，推动临床肿 瘤诊断学的长足发展，因此所述的AAV-pXRCC2-Luciferase及F'ugw-pXRCC2-Luciferase用 于制备肿瘤诊断试剂。
[0034] 相较于已发现的其他肿瘤特异性启动子，XRCC2启动子具有在正常、肿瘤细胞中活 性差异大及片段长度小易于病毒载体的构建等突出优势，因此XRCC2启动子具有应用于肿 瘤基因治疗及诊断的巨