2-Luciferase/ GFPUOygRC及lOygp化Iper质粒，混匀后加入60]il转染试剂p-pei，并于室温静置20 分钟后将上述混合物加入处于对数生长期的AAV-293细胞中。常规培养3天后，采用反复 冻融法裂解细胞并收集病毒颗粒。取一定量AAV-pXRCC2-Luciferase/GFP病毒颗粒分别感 染不同细胞3天后，采用流式细胞术检测表达绿色巧光的细胞数，并同时采用巧光素酶活 性检测方法检测不同细胞内的巧光素酶活性，W巧光素酶活性/表达绿色巧光细胞数的比 值指征不同细胞中相对巧光素酶活性。
[0086] 其结果如图5所示，可W看出，AAV-pXRCC2-Luciferase/GFP质粒在肿瘤细胞中存 在特异性表达，其表达水平明显高于正常细胞，由于XRCC2启动子活性在肿瘤细胞中显著 增强该一分子特性，推测由XRCC2启动子介导Luciferase在肿瘤细胞中的特异性表达能够 实现在体肿瘤的可视化，推动临床肿瘤诊断学的长足发展。
[0087] 巧）F'ugw-pXRCC2-Luciferase质粒的转染
[008引在500y1无抗生素无血清的DMHM培养基中加入5ygRigw-pXRCC2-Luciferase/GFP、3. 75ygA8. 9及2. 5ygVSVG质粒，混匀后加入30y1p-pei转染试剂，室温静置20 分钟后将上述混合物加入处于对数生长期的293FT细胞中。3天后收集细胞上清，55000g 离屯、2. 5小时，弃上清，用一定量新鲜培养基重悬病毒颗粒。在不同处于对数生长期的细胞 中加入等量F'ugw-pXRCC2-Luciferase及病毒溶液。感染3天后，采用流式细胞 术检测表达绿色巧光的细胞数，并同时采用巧光素酶活性检测方法检测不同细胞内的巧光 素酶活性，W巧光素酶活性/表达绿色巧光细胞数的比值指征不同细胞中相对巧光素酶活 性。
[0089] 其结果如图6所示，可W看出，化gw-pXRCC2-Luciferase质粒在肿瘤细胞中存在 特异性表达，其表达水平明显高于正常细胞，由于XRCC2启动子活性在肿瘤细胞中显著增 强该一分子特性，推测由XRCC2启动子介导Luciferase在肿瘤细胞中的特异性表达能够实 现在体肿瘤的可视化，推动临床肿瘤诊断学的长足发展。
[0090] 上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。 熟悉本领域技术的人员显然可W容易地对该些实施例做出各种修改，并把在此说明的一 般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本 领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明 的保护范围之内。
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【主权项】
1. 一种XRCC2启动子，其特征在于，其序列如SEQ ID NO. 1所示。2. -种含有XRCC2启动子的载体，其特征在于，包括pXRCC2-GFP、pXRCC2-Luciferase、 PXRCC2-DTA、pXRCC2-其他毒蛋白、AAV-pXRCC2-Luciferase 及 Fugw-pXRCC2-Luciferase， 其中PXRCC2指代XRCC2启动子。3. 根据权利要求2所述的一种含有XRCC2启动子的载体，其特征在于，所述的DTA为 白喉毒素的A亚基，其序列如SEQ ID NO. 2所不；所述的其他毒蛋白包括调亡家族蛋白 caspase3、caspase6、caspase7、caspase8〇4. 一种如权利要求2所述的含有XRCC2启动子的载体的构建方法，其特征在于， (1) pXRCC2-GFP质粒的构建： 以人皮肤成纤维细胞系细胞的基因组DNA为模板，XRCC25'及XRCC23'分别为上下游 引物，PCR扩增5'端含有EcoRI、3'端含有AgeI酶切位点的pXRCC2序列，将pRad51C-GFP 质粒及扩增完成的PXRCC2片段用限制性内切酶EcoRI及AgeI进行酶切，跑胶鉴定并回收 相应片段后进行连接反应，构建完成PXRCC2-GFP质粒； (2) pXRCC2_Luciferase 质粒的构建： 以PXRCC2-GFP质粒为模板，采用上下游引物XRCC2-Luciferase 5'及 XRCC2-Luciferase 3' PCR扩增两端分别含有NheI及HindIII酶切位点的pXRCC2， 将PXRCC2片段与pGL3-basic质粒采用NheI及HindIII进行酶切，跑胶鉴定后，分 别回收PXRCC2片段及pGL3-basic质粒的线性化片段并进行连接反应，构建完成 pXRCC2_Luciferase 质粒； (3) pXRCC2-DTA质粒的构建： 采用上下游引物XRCC2-DTA 5'及XRCC2-DTA 3'，以Ad2-DTA-NHEJ质粒为模板PCR扩 增两端分别含有AgeI与NotI酶切位点的DTA片段，将该DTA片段及pXRCC2-GFP质粒分别 采用AgeI及NotI进行酶切，回收相应片段并进行连接反应，构建完成pXRCC2-DTA质粒； (4) AAV-pXRCC2_Luciferase 质粒的构建： 将正义链序列为CGCGTGCTAGCGAATTCGGTACCT，反义链序列为 CTAGAGGTACCGAATTCGCTAGCA的〇1 igo进行褪火反应，并分别采用限制性内切酶MluI 及XbaI酶切经褪火完成的片段，同时将AAV-MCS质粒采用限制性内切酶MluI及XbaI 酶进行酶切，连接酶切完成后的相应片段，构建完成的质粒命名为质粒1，将质粒1及 pXRCC2-Luciferase质粒采用NheI及XbaI酶切后的相应产物进行连接反应，构建完成 AAV-pXRCC2_Luciferase 质粒； (5) Fugw_pXRCC2_Luciferase 质粒的构建： 设计并合成正义链序列为TAAGCTAGCTCTAGAG，反义链序列为TAATTCGATCGAGATCTCTTAA 的〇I igo片段，进行褪火反应，分别采用限制性内切酶PacI及EcoRI酶切Fugw慢病毒载体， 胶回收后得到线性化片段，连接该线性化片段和已褪火的oligo片段，得到Fugw-oligo载 体，采用限制性内切酶NheI、XbaI及Sail酶切pXRCC2_Luciferase质粒，并同时采用NheI 及XbaI酶切Fugw-oligo载体，跑胶鉴定后胶回收pXRCC2_Luciferase和Fugw-oligo线性 化片段并进行连接反应，构建完成Fugw-pXRCC2-Luciferase质粒。5. 根据权利要求4所述的一种含有XRCC2启动子的载体的构建方法，其特征在于，引物 XRCC25' 序列如 SEQ ID NO. 7 所示， 引物XRCC23'序列如SEQ ID NO. 8所示， 引物 XRCC2-Luciferase 5' 序列如 SEQ ID NO. 9 所示， 引物 XRCC2-Luciferase 3' 序列如 SEQ ID NO. 10 所示， 引物 XRCC2-DTA 5' 序列如 SEQ ID NO. 11 所示， 引物 XRCC2-DTA 3' 序列如 SEQ ID NO. 12 所示。6. -种如权利要求2所述的含有XRCC2启动子的载体在制备肿瘤治疗药物或肿瘤诊断 试剂中的应用。7. 根据权利要求6所述的一种含有XRCC2启动子的载体的应用，其特征在于，所述的 PXRCC2-GFP与pXRCC2-Luciferase用于制备肿瘤诊断试剂。8. 根据权利要求6所述的一种含有XRCC2启动子的载体的应用，其特征在于，所述的 PXRCC2-DTA、pXRCC2-其他毒蛋白用于制备肿瘤治疗药物。9. 根据权利要求6所述的一种含有XRCC2启动子的载体的应用，其特征在于，所述的 AAV-pXRCC2_Luciferase 及 Fugw_pXRCC2_Luciferase 用于制备肿瘤诊断试剂。
【专利摘要】本发明涉及XRCC2启动子、含有XRCC2启动子的载体、载体的构建及应用，XRCC2启动子序列如SEQ ID NO.1所示，含有XRCC2启动子的载体包括pXRCC2-GFP、pXRCC2-Luciferase、pXRCC2-DTA、pXRCC2-其他毒蛋白、AAV-pXRCC2-Luciferase及Fugw-pXRCC2-Luciferase。含有XRCC2启动子的载体在制备肿瘤治疗药物或肿瘤诊断试剂中的应用。相较于已发现的其他肿瘤特异性启动子，XRCC2启动子具有在正常、肿瘤细胞中活性差异大及片段长度小易于病毒载体的构建等突出优势，因此XRCC2启动子具有应用于肿瘤基因治疗及诊断的巨大潜力。
【IPC分类】C12N15/66, C12Q1/66, A61K48/00, A61P35/00, C12N15/85, C12Q1/68, C12N15/113, C12Q1/02
【公开号】CN104988152
【申请号】CN201510411475
【发明人】张文俊, 李珍, 张蕾, 郭文煊, 蒋颖, 毛志勇
【申请人】同济大学
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月14日