大潜力。
【附图说明】
[0035] 图1、XRCC2在不同细胞中mRNA水平的相对表达量差异结果；
[0036] 图2、由XRCC2启动子介导的GFP蛋白在不同细胞中的表达水平差异结果；
[0037] 图3、由XRCC2启动子介导的Luciferase在不同细胞中的表达水平差异结果； [003引图4、由XRCC2启动子介导的DTA蛋白表达对不同细胞的抑制作用差异结果；
[0039] 图5、含pXRCC2-Luciferase的AAV病毒颗粒在不同细胞中的表达水平差异结果；
[0040] 图6、含pXRCC2-Luciferase的化gw病毒颗粒在不同细胞中的表达水平差异结 果；
[0041] 图7、Ad2-DTA-NHEJ质粒图谱。
【具体实施方式】
[0042] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0043] W下实施例所用细胞系如下：
[0044]MJT为人皮肤成纤维细胞系，IMRT为人肺成纤维细胞系，PI、P2及P3为人原代眼 脸细胞系，HMEC1、HMEC2、HMEC3及HMEC4为人乳腺上皮细胞系，Hela为人宫颈癌细胞系， 册1080为人纤维肉瘤细胞系，1〔。-7、104-1日-231、肥(：1954及了470为人乳腺上皮癌细胞系。
[0045] 实施例1
[0046]RealTimeRT-PCR技术检测不同细胞中XRCC2mRNA水平的表达量情况
[0047] (1)细胞总RNA提取
[0048] 离屯、收集细胞后加入1mlTrizol试剂充分裂解。加入200y1氯仿剧烈振荡30 秒，置于冰浴中静置2-3分钟，4°C，12000巧m，离屯、5分钟。溶液产生分层，小屯、移取定量的 上层液体至另一个RNA酶化ee的离屯、管中，加入等体积的异丙醇，轻微振荡混匀，置于冰浴 中静置10分钟后，4°C，12000巧m，离屯、5分钟。弃上清，沉淀用75 %己醇洗漆2次。洗漆 完毕后弃去己醇溶液，挥干。用适量DEPC水溶解RNA，于65°C水浴中助溶15分钟。采用核 酸蛋白测定仪对所提取的RNA进行纯度及浓度测定。总RNA可直接进行后续实验或保存 于-80°C中备用。
[0049] 似逆转录
[0050] 根据RNA浓度，取定量RNA(l-2yg)，加入如表1中的随机引物2yl，并补加DEPC 水至10y1，于PCR仪中65°C加热变性15分钟。后于上述反应体系中加入5X逆转录缓冲 液 4y1、lOmMdNTP3y1、RNA酶抑制剂 0. 5yl、40u/y1M-MuLV逆转录酶 1y1 并用DEPC 水补齐至总反应体积为20y1，于PCR仪中按照已设定程序进行逆转录反应。
[0化1] (3)聚合酶链反应
[0化引将逆转录反应所得产物按如下反应体系进行目的片段的扩增；cDNAO. 6y1、正、反 引物各 0. 6yl、2XSYBRPremixExTaqlOyl及DEPC水 8. 2yl。扩增程序为；95°C变性 10秒后进行40次95°C，5秒；ere，20秒；72°C，30秒的循环。末次循环后测定引物的溶解 曲线。各引物序列如表1所示。
[005引表1RealTimeRT-PCR实验所用引物序列[0054]
[0化5] 参考图1，可W看出，相较于正常细胞，在不同肿瘤细胞中XRCC2蛋白的表达呈显 著上调。
[0056] 实施例2[0057] 载体克隆
[00郎](1)PXRCC2-GFP质粒的构建
[0059] WMJT细胞的基因组DNA为模板，XRCC2 5'及XRCC2 3'分别为上下游引物，PCR扩 增5'端含有EcoRI、3'端含有Agel酶切位点的XRCC2启动子（PXRCC2)序列。将pRad51C-GFP 质粒及扩增完成的PXRCC2片段用限制性内切酶EcoRI及Agel进行酶切，跑胶鉴定并回收 相应片段后进行连接反应，构建完成目标质粒。
[0060] (2)pXRCCS-Luciferase质粒的构建
[00川 WPXRCC2-GFP质粒为模板，采用上下游引物XRCC2-Luciferase5'及 XRCC2-Luciferase3'PCR扩增两端分别含有Miel及HinduI酶切位点的PXRCC2。将PXRCC2片段与pGL3-basic质粒采用Miel及Hindlll进行酶切。跑胶鉴定后，分别回收 PXRCC2片段及pGL3-basic质粒的线性化片段并进行连接反应，构建完成目标质粒。
[006引 （3)PXRCC2-DTA质粒的构建
[006引 采用上下游引物XRCC2-DTA5'及XRCC2-DTA3'，WAd2-DTA-N肥J质粒（该质粒图 谱如图7所示，其中第8558-8785位编码Ad2序列，第10058-10738位编码DTA蛋白）为模 板PCR扩增两端分别含有Agel与Notl酶切位点的DTA片段。将该DTA片段及PXRCC2-GFP 质粒分别采用Agel及Notl进行酶切。回收相应片段并进行连接反应，构建完成目标质粒。
[0064] (4)AAV-pXRCCS-Luciferase质粒的构建
[0065] 将正义链序列为CGCGTGCTAGCGAATTCGGTACCT，反义链序列为 CTAGAGGTACCGAATTCGCTAGCA的oligo进行稱火反应，并分别采用限制性内切酶Mlul及 甜al酶切经稱火完成的片段。同时将AAV-MCS质粒采用上述两个内切酶进行酶切，连接酶 切完成后的相应片段，构建完成的质粒命名为质粒1。将质粒1及pXRCC2-Luciferase质粒 采用化el及Xbal酶切后的相应产物进行连接反应，构建完成目标质粒。
[0066] (5)F'ugw-pXRCC2-Luciferase质粒的构建
[0067] 设计并合成正义链序列为TAAGCTAGCTCTAGAG，反义链序列为 TAATTCGATCGAGATCTCTTAA的01igo片段，进行稱火反应。分别采用限制性内切酶化CI 及EcoRI酶切化gw慢病毒载体，胶回收后得到线性化片段。连接该线性化片段和已稱 火的oligo片段，得到化gw-oligo载体。采用限制性内切酶化el、甜al及Sail酶切 pXRCC2-Luciferase质粒，并同时采用Miel及甜al酶切F^igw-oligo载体。跑胶鉴定后胶 回收pXRCC2-Luciferase和F^igw-oligo线性化片段并进行连接反应，构建完成目标质粒。
[0068] 表2载体克隆所用引物序列
[0069]
[0070] 实施例3
[0071] 质粒转染
[00巧 （l)pXRCC2-GFP质粒的转染
[0073] 将处于对数生长期的不同细胞采用膜酶消化，离屯、收集2XlO5细胞，加入0.5yg PXRCC2-GFP质粒及0. 005yg用作转染效率内参的化Red质粒，并用电转液补足至20y1， 使用Amaxa4D(Lonza)电转仪进行电转，不同细胞所采用的转染程序如表3所示。转染质 粒72小时后，收集细胞进行流式细胞术检测。
[0074] 表3不同细胞的转染程序
[0075]
[0076]
[0077] 由XRCC2启动子介导的GFP在不同细胞中的表达水平差异如图2所示，相较于正 常细胞，由XRCC2启动子（PXRCC2)介导的GFP能够在肿瘤细胞中特异性表达。
[0078] (2)pXRCCS-Luciferase质粒的转染
[0079] 将处于对数生长期的不同细胞采用膜酶消化，离屯、收集2X105细胞，加入0. 5yg pXRCC2-Luciferase质粒，用电转液补足至20y1，利用如表3所示的不同电转程序在Amaxa 4D(Lonza)电转仪上进行质粒转染。转染质粒72小时后，收集细胞计数并进行巧光素酶活 性检测（试剂盒购自Promega)。
[0080] 由XRCC2启动子介导的Luciferase在不同细胞中的表达水平差异如图3所示，相 较于正常细胞，由XRCC2启动子（PXRCC2)介导的Luciferase能够在肿瘤细胞中特异性表 达。
[OOW] (3)pXRCC2-DTA质粒的转染
[00間在IlOylOPTI-MBl培养基中加入3.3ylRigen6转染试剂后分别加入lyg SV40-Luciferase及0、0. 05、0. 1ygpXRCC2-DTA质粒，WpGL3-basic质粒作为阴性对照。 将上述溶液均匀混合后室温静置15分钟。将该混合物均匀加入处于对数生长期的不同细 胞中。72小时后对各实验组进行细胞计数。
[0083] 结果如图4所示，PXRCC2-DTA剂量依赖性地抑制肿瘤细胞的生长，而对正常细胞 几乎不产生生长抑制作用。基于此，我们认为由XRCC2启动子介导毒蛋白的表达能够选择 性地杀伤肿瘤细胞，是一种安全有效的肿瘤治疗方式。
[0084] (4)AAV-pXRCC2-Luciferase/GFP质粒的转染
[0085] 在1ml无抗生素无血清的DMHM培养基中加入10ygAAV-pXRCC