一种果蔗芽变的分子鉴定方法及其专用引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物学分子标记领域，设及一种果庶芽变的分子鉴定方法及其专用引 物。
【背景技术】
[0002] 芽变，是植物体细胞内遗传物质发生改变，该种改变往往发生在芽的分生组织细 胞中，当芽萌发成新植株时，即表现出新个体与原类型在性状上有所不同。所W，芽变为植 物新品种选育提供了一条重要途径。
[0003]果庶在我国具有悠久的种植历史，分布范围也较广。目前我国生产上使用的果庶 品种可分为二大类，一是果庶专用型品种，二是果糖兼用型品种。其中拔地拉栽培面积最 大，W我国果庶栽培面积最大的广西为列，拔地拉种植面积占果庶种植总面积的90%W上， 地方果庶品种如青皮庶、白皮庶、黄皮果庶、福建蜡庶等的种植面积占不到总面积的10%。 拔地拉原产热带地区，对水温肥等条件要求较高，在生长过程中对环境条件比较敏感，其主 要表现是常因水肥管理偏差导致生长受抑制而出现短节现象，严重影响其商品性。为克服 此问题，目前在栽培管理过程中，庶农通过施用大量水肥及植物生长调节剂，使得果庶节间 长度达到一定长度，从而提高拔地拉的商品性。
[0004]目前果庶新品种选育主要是利用糖庶品种作为亲本进行常规杂交选育，并育成 了一批果糖兼用品种，但品质低于拔地拉。发明人经研究发现，将新型SCoT(Start codon targeted polymo巧hism)标记技术应用到果庶拔地拉及其芽变类型的分子鉴定中，虽然 PCR扩增效果非常好，但所用引物难W检测到遗传差异，不能对果庶拔地拉及其芽变类型进 行分子鉴定，如图1所示。
[0005] 因此，鉴于中国果庶品种现状及存在问题，从果庶自然突变株中系统选育果庶新 品种，W期育成高产、稳产、优质、抗病、适应性广、应用前景好的果庶新品种，是果庶生产的 当务之急。
【发明内容】
[0006] 针对W上技术问题，本发明的目的是提供一种果庶芽变的分子鉴定方法及其专用 引物，W便从果庶拔地拉自然突变株中有效、快速的鉴定出果庶芽变品种。
[0007] 对此，本发明的技术方案为；
[0008]-种果庶芽变的分子鉴定的专用引物，所述专用引物为序列表SEQIDNO: 1核巧 酸序列的引物，所述专用引物为URPOJniversal化cePrimer)标记单引物。
[0009] 所述专用引物的核巧酸序列为：
[0010]URP38F；AAGAGGCATTCTACCACCAC〇
[0011] 所述专用引物W下统称为URP38F。
[0012] 一种果庶芽变的分子鉴定方法，包括W下步骤：提取果庶亲本拔地拉及对应的疑 似芽变果庶品种的基因组DNA，用所述专用引物即URP38F分别对基因组DNA进行PCR扩增， PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳W区分亲本拔地拉及其对应的疑似芽变果庶品种，果庶 亲本拔地拉与其对应的疑似芽变果庶之间的电泳条带模式在625bp处有强度差异，疑似芽 变果庶品种为真实芽变品种。
[0013] 作为本发明的进一步地改进，所述PCR扩增的程序是；94°C预变性4min;94°C变性 30s，50°C退火Imin，72°C延伸1. 5min，其中，变性、退火、延伸S个步骤循环35次；72°C最后 一步延伸10min，10°C保存。
[0014] 作为本发明的进一步地改进，所述PCR扩增体系为20ul，包括；10XPCR含Mg"的 Buffer2.0ul，2. 5mM的dNTP0. 5ul，lOpmol/ul的URP38Flul，2. 5U/ul的Taq酶 0.加1， 50ng/ul的DM模板 1.Oul，d地2〇 补足。
[0015] 作为本发明的进一步地改进，所述果庶的基因组DM从果庶植株的嫩叶中提取。
[0016] 作为本发明的进一步地改进，所述提取果庶基因组DNA的方法，包括W下步骤：
[0017] 步骤A;取新鲜果庶嫩叶，放入研鉢中并在研鉢中加入PVP(聚己締化咯烧酬），加 入液氮，将叶片充分研磨成粉末状样品；
[0018] 步骤B;将所述粉末状样品转移到装有预热的CTAB(十六烷基=甲基漠化锭）提 取液的离屯、管中，并加入0-琉基己醇，于65°C水浴锅中温浴60min，混匀；
[001引步骤C;将步骤B的离屯、管置于4°C冷冻离屯、机中，12000巧m离屯、lOmin后，吸取 上清液，并在上清液中加入RNaseA(核糖核酸酶A)，混匀，静置5min;
[0020] 步骤D;加入与步骤C所述的上清液等体积的氯仿，抽提，混匀，静置5min，冷冻离 屯、机中12000巧m离屯、lOmin;
[0021] 步骤E;再次吸取上清液，并再次加入等体积的氯仿抽提，于冷冻离屯、机中 12000巧m离屯、lOmin;
[0022] 步骤F;吸取上清液，并加入等体积的-40°C的无水己醇，于-40°C冰箱中沉淀 30min，将沉淀物取出放入到新的离屯、管中，用75%己醇洗漆；
[0023] 步骤G;惊至无己醇味后，用200ulDEPC水或TE缓冲液溶解沉淀物。
[0024] 作为本发明的进一步地改进，所述步骤F中，采用白色小枪头或牙签将沉淀物取 出。
[00巧]进一步优化的，所述果庶植株基因组DNA的提取方法，包括W下步骤：
[0026] 1)取新鲜果庶嫩叶0. 3-0. 5g，用经高压灭菌后的干净剪刀剪碎，放入研鉢中并在 研鉢中加入Ig的PVP(聚己締化咯烧酬），分多次倒入足量的液氮，将叶片样品充分研磨成 粉末状；
[0027] 2)将全部粉末样品转移到事先加入了 1.OmlCTAB(十六烷基S甲基漠化锭）提 取液且经过65°C预热的2ml离屯、管中，再加入20y1 0 -琉基己醇，于65°C水浴锅中温浴 60min，期间上下颠倒混匀，W便DNA充分析出；
[0028] 3)将离屯、管置于4°C冷冻离屯、机中，12000巧m离屯、lOmin后除去底部残渣，吸取上 清液到新的干净的离屯、管中，并在上清液中加入0. 5ul的RNaseA(核糖核酸酶A)，上下充分 颠倒混匀，静置5min;
[0029] 4)加入与上清液等体积的氯仿抽提，上下充分颠倒混匀，静置5min，4°C冷冻离屯、 机中12000巧m离屯、lOmin;
[0030]5)吸取上清液，并再次加入与上清液等体积的氯仿抽提，4°C冷冻离屯、机中 12000巧m离屯、lOmin;
[0031] 6)吸取上清液并加入与上清液等体积且事先在-40°c预冷的无水己醇于-40°c冰 箱中沉淀30min，用白色小枪头或牙签将沉淀挑出来到新的干净的1. 5ml离屯、管中，用75% vol己醇洗漆沉淀二遍；
[0032] 7) 5min左右惊干后，用200y1DEPC(焦碳酸二己醋）水或TE缓冲溶液溶解沉淀。
[0033] 本发明还提供了一种用于果庶芽变分子鉴定的试剂盒，所述试剂盒含有URP38F 引物。
[0034] 与现有技术相比，本发明的有益效果为；
[00巧]采用本发明的技术方案，可W有效地、快速地从果庶拔地拉自然突变株中鉴定出 芽变品种，为进一步育成高产、稳产、优质、抗病、适应性广、应用前景好的果庶新品种奠定 了基础；且本发明的鉴定方法具有较强的通用性，为有效选择变异奠定了理论基础和提供 了技术支撑，操作简便、用途广泛，节约了大量的人力和物力，便于推广。
【附图说明】
[0036] 图1是本发明现有技术的果庶亲本拔地拉及其对应的4个芽变品种的SCoT标记 技术鉴定的1.5%琼脂糖凝胶电泳图，图中所用单引物分别为5(：〇16、5(：〇19和5(：〇1'12，编号 1-5分别对应拔地拉、芽变3号、芽变1号、芽变2、芽变4号；
[0037] 图2是本发明一种实施例果庶亲本拔地拉及其对应的4个芽变品种的URP标记技 术鉴定的1. 5%琼脂糖凝胶电泳图，图中所用单引物分别为URP2F、URP9F、URP38F和URP4R， 编号1-5分别对应拔地拉、芽变3号、芽变1号、芽变2、芽变4号；
[0038] 图3是本发明一种实施例果庶亲本拔地拉及其对应的4个芽变品种的URP标记技 术重复鉴定的1. 5%琼脂糖凝胶电泳图，图中所用单引物为URP38F，编号1-5分别对应拔地 拉、芽变3号、芽变1号、芽变2、芽变4号。
[0039]图中，M为DNAMarkerDL2000,从上到下条带大小依次为 2000bp、1000bp、750bp、 500bp、250bp和lOObp。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
[00川实施例1
[0042]材料；
[0043] 本实施例选取拔地拉、芽变3号、芽变1号、芽变2、芽变4号五个品种进行对比分 析。其中，拔地拉为果庶亲本品种，芽变3号、芽变1号、芽变2、芽变4号为疑似芽变果庶品 种。
[0044] 步骤一，提取亲本果庶拔地拉及疑似芽变果庶品种的基因组DNA，包括W下步骤：
[0045] 1)取新鲜果庶嫩叶0. 3-0. 5g，用经高压灭菌后的干净剪刀剪碎，放入研鉢中并在 研鉢中加入Ig的PVP(聚己締化咯烧酬），分多次倒入足量的液氮，将叶片样品充分研磨成 粉末状；
[0046] 2)将全部粉末样品转移到事先加入了 1.OmlCTAB(十六烷基S甲基漠化锭）提 取液且经过65°C预热的2ml离屯、管中，再加入20y1 0 -琉基己醇，于65°C水浴锅中温浴 60min，期间上下颠倒混匀，W便DM充分析出；
[0047] 3)将离屯、管置于4°C冷冻离屯、机中，12000巧m离屯、lOmin后除去底部残渣，吸取上 清液到新的干净的离屯、管中，并在上清液中加入0. 5ul的RNaseA(核糖核酸酶