催化生产α -酮戊二酸的方法，以下通过步骤进一步对本发明进行描述:
步骤1、L-谷氨酸氧化酶基因的合成:
根据大肠杆菌密码子偏爱性，全基因合成sp X_119_6来源的L_谷氨酸氧化酶基因LGOX (SEQ ID N0.1)，并委托上海捷瑞生物科技有限公司进行L-谷氨酸氧化酶基因的全合成，合成后的全基因两端分别带用Ncol和Xhol酶切位点并连接到pET28a (+)上，获得融合表达载体pET28a-LG0X。
[0028]步骤2、融合表达载体pET-LGOX-ELP的构建:
根据L-谷氨酸氧化酶基因序列，设计一对引物，上游引物:5’ -CATGCCATGGGCACGACCGATACTGC
AAGAAGGC-3 '下游引物:5 ’ -CCCTCGAGCTAGAATTCCATATGTGAGGTCAAGGCTTCCTCACGCATTG-3 ’，其中上游引物含有Afcol酶切位点，下游引物含有ZAol、EcoRi和Ndel酶切位点。
[0029]以PET28a_LG0X为模板，通过PCR获得的目的片段，PCR扩增程序如下:预变性94。。，10 min ;变性 94°C，40s ;复性 55°C，20s ;延伸 72°C，2.5 min，共 30 个循环，最后一次反应延伸时间为10 min。取PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒提取胶中的目的片段LG0X。
[0030]回收获得的LG0X片段经Ncol和Xhol双酶切后与同样经过双酶切的载体pET28a用T4 DNA连接酶于16°C连接过夜，次日，用氯化钙法转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂布于含Kana的LB平板，37°C培养过夜。挑取单克隆接种于含有Kana的LB试管中进行培养，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，用Ncol和Xhol进行双酶切验证，获得重组载体pET-LGOX。
[0031]取10 yL含有质粒pET-EICM-ELP的大肠杆菌DH5a接种到含有氨苄抗生素的LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜。次日，收集菌体，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，获得质粒pET-EICM-ELP0
[0032]用Ndel和EcoRi对载体pET_EICM_MBP进行双酶切，取酶切产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒提取胶中的目的片段ELP。
[0033]回收获得的ELP基因片段并与同样经过双酶切的载体pET-LGOX用T4 DNA连接酶于16°C连接过夜，次日，用氯化钙法转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂布于含Kana的LB平板，37°C培养过夜。挑取单克隆接种于含有Kana的LB试管中进行培养，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，用Ndel和EcoRV进行双酶切验证。获得融合表达载体pET-LGOX-ELP。
[0034]步骤3、将融合表达载体转化到大肠杆菌中:制备大肠杆菌Rosetta (DE3)感受态细胞，通过氯化钙法转化将融合表达载体pET-LGOX-ELP转化至Rosetta(DE3)感受态细胞，涂布于含有50 Pg/mL的Kana和30 Pg/mL Chi抗性的LB平板，37°C培养过夜。挑取单菌落，小量扩增后提取质粒，然后进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察，含有质粒条带的为实验所需的重组大肠杆菌。保存甘油菌备用。
[0035]步骤4、重组LG0X-ELP融合蛋白的表达:将5 μ L甘油菌加入到5 mL含卡那霉素(Kana)和氯霉素(Chi)的LB培养液中，37°C，200转/分，摇床培养过夜，次日取1 mL菌液加入到含50 Pg/mL的Kana和30 Pg/mL Chi抗性的100 mL LB培养基中，37°C下振荡培养至0D6QQ=0.6-0.8，然后添加IPTG至终浓度为0.1 mM, 25_28°C下诱导培养8_16 h。离心后收集菌体备用。
[0036]步骤5、细胞破碎:用0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)缓冲液洗涤菌体三次，然后再用
0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)缓冲液重悬，进行超声破碎(超声功率200W,工作5s，停7s，工作次数为50次)，超声破碎后13000 g，4°C离心10 min，上清即为粗酶液。
[0037]步骤6、融合蛋白的纯化:4°C条件下，往粗酶液中缓慢添加硫酸铵至终浓度为0.4M，然后置于37°C水浴锅中水浴10 min，使得融合蛋白发生凝聚。室温条件下，13000 g离心10 min，倒去上清液，沉淀部分即为纯化的融合蛋白。用预冷的0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)缓冲液重悬沉淀部分，使其重新溶解在缓冲液中。反复几次获得纯的融合蛋白LGOX-ELP。
[0038]步骤7、融合蛋白的酶切:选用蛋白酶K对融合蛋白进行酶切处理，投酶量按照谷氨酸氧化酶酶活的千分之一当量进行投放，随后在4°C进行过夜酶切。酶切的反应液后置于70°C水浴中水浴1 h，使得蛋白酶K变性，13000 g，4°C离心10 min后去除变性的蛋白酶K，从而获得成熟的L-谷氨酸氧化酶。
[0039]步骤8、酶切前后热稳定性的比较:将LG0X-ELP融合蛋白和成熟的L-谷氨酸氧化酶分别至于一系列不同温度下(25-95°C)保温1 h，然后测定所残余酶活。
[0040]步骤9、L-谷氨酸氧化酶的酶活测定方法:在0.2 mL的反应体系内，反应液中含有5 mM谷氨酸钠，6 mM 4-氨基安替比林，6 mM苯酚，1U过氧化物酶和适量的酶液，反应在25°C下测定，采用分光光度计进行反应的测定。该方法主要是通过检测生成的过氧化氢的含量来确定酶的活性，酶活定义为:在25°C下，1 min生成1 ymol过氧化氢所需要的酶量定义为一个酶活力单位。
[0041]步骤10、利用酶切后的L-谷氨酸氧化酶催化生产α-酮戊二酸:用发酵罐或者其他供养条件好的容器中进行反应，反应体系中加入120 g/L L-谷氨酸，15 U/mL的L-谷氨酸氧化酶和200 U/mL过氧化氢酶后在30°C，150转/分下进行转化反应，反应进行20 h后酮戊二酸的产量可达113.56 g/L ο
[0042]本说明书中所描述的以上内容仅仅是对本发明所作的举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明说明书的内容或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种利用L-谷氨酸氧化酶催化生产α -酮戊二酸的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)将L-谷氨酸氧化酶基因和类弹性蛋白基因依次连接到原核表达载体上，获得融合表达载体； (2)将融合表达载体转化到大肠杆菌中，在低温条件下进行L-谷氨酸氧化酶-类弹性蛋白融合蛋白的诱导表达，收集菌体，用超声波破碎，离心去除不溶性物质，获得可溶性的细胞裂解液即为粗酶液； (3)利用类弹性蛋白的特性，用ITC循环方法纯化重组融合蛋白； (4)利用L-谷氨酸氧化酶的特性，用蛋白酶对重组融合蛋白进行酶切，去除弹性蛋白并获得成熟的L-谷氨酸氧化酶； (5)酶切前后热稳定性的比较； (6)利用成熟的L-谷氨酸氧化酶催化L-谷氨酸生产酮戊二酸。2.根据权利要求1所述的一种利用L-谷氨酸氧化酶催化生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于:所述步骤(1)中的L-谷氨酸氧化酶基因来源各种链霉菌微生物的L-谷氨酸氧化酶基因，并对其进行密码子优化。3.根据权利要求1所述的一种利用L-谷氨酸氧化酶催化生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于:所述步骤(2)中的表达条件为:将重组载体转化到大肠杆菌中，将转化子接种到含LB培养基的锥形瓶中，220rpm，30-37 °C培养直至细胞生长密度达到0.6-0.8左右，然后添加终浓度为0.1mM IPTG于25-28°C条件下进行诱导表达12_16h，收集菌体，用0.lMTris-HCl缓冲液在pH值为8.0的环境下重悬菌体并用超声波进行破碎，4°C，13000g离心去除不溶性物质，获得的可溶性细胞裂解液即为粗酶液。4.根据权利要求1所述的一种利用L-谷氨酸氧化酶催化生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于:所述步骤(3)中的ITC纯化过程为:添加硫酸铵至粗酶液中的终浓度为0.4M，37°C水浴中孵育lOmin，13000g室温离心lOmin获得融合蛋白沉淀部分，用预冷的0.lMTris-HCl缓冲液在pH值为8.0的环境下重悬沉淀部分，即获得纯化的重组融合蛋白。5.根据权利要求1所述的一种利用L-谷氨酸氧化酶催化生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于:所述步骤(4)中的酶切过程为:将蛋白酶添加到纯化的重组融合蛋白中，4°C酶切过夜，70°C下保温lh使蛋白酶变性，4°C下，13000g离心lOmin除去变性的蛋白酶，获得的上清液即为成熟的L-谷氨酸氧化酶。6.根据权利要求1所述的一种利用L-谷氨酸氧化酶催化生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于:所述步骤(5)中的热稳定性测定方法为:将L-谷氨酸氧化酶-类弹性蛋白融合蛋白和成熟的L-谷氨酸氧化酶分别至于一系列不同温度下保温lh，然后测定所残余酶活。7.根据权利要求1所述的一种利用L-谷氨酸氧化酶催化生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于:所述步骤(6)中酶催化体系为:在3L发酵罐中配置含有120 g/L的L-谷氨酸的磷酸缓冲液，添加15 U/mL的L-谷氨酸氧化酶和200U/mL过氧化氢酶后在30 °C，220rpm下进行转化反应。
【专利摘要】本发明公开一种利用L-谷氨酸氧化酶催化生产α-酮戊二酸的方法，包括以下步骤：对L-谷氨酸氧化酶（L-GOX）基因的密码子进行优化设计和合成；构建L-GOX和类弹性蛋白（ELP）的融合表达载体pET-28a-LGOX-ELP并将其转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中，挑取转化子培养并添加诱导剂进行表达，获得重组L-谷氨酸氧化酶融合蛋白粗酶液；利用ITC方法纯化获得重组L-谷氨酸氧化酶融合蛋白，利用蛋白酶对重组L-谷氨酸氧化酶融合蛋白进行酶切，获得成熟的L-谷氨酸氧化酶；利用成熟的L-谷氨酸氧化酶催化生产酮戊二酸。本发明方法简单、快速、高效，可用于大规模的分离纯化L-谷氨酸氧化酶，在酮戊二酸的酶法生产中具有较高的实际应用价值。
【IPC分类】C12N9/06, C12N15/70, C12P7/50, C12N15/53
【公开号】CN105331642
【申请号】CN201510851671
【发明人】徐志南, 唐云平, 沈颂娣, 朱晓仙, 黄保苗, 王鹏
【申请人】浙江汇宁生物科技有限公司
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年11月30日