酿酒酵母菌在生物合成l-苯基乙酰基甲醇中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及酿酒酵母菌在生物合成k苯基乙酷基甲醇中的应用，属于生物工程
技术领域。
【背景技术】
[0002] 苯甲醒又称安息香醒、苦杏仁油，是一种重要的医药中间体，广泛用于医药、香料、 农药、染料、塑料添加剂等行业。W淀粉类和糖类作为发酵材料，W苯甲醒为底物，采用微生 物法生物合成药物中间体是一项缓解能源危机的技术，但底物苯甲醒对细胞毒性作用使其 工业应用受到限制。
[0003]k苯基乙酷基甲醇化-phenylacetylcarbinol，kPAC)是合成药物k麻黄素 化-巧he化ine)和D-伪麻黄素值-pseudoe地e化ine)的关键手性前体，W苯甲醒为底物酶 催化合成L-PAC的研究着眼于寻找成本低、产率高和产量高的生物催化剂。目前获得苯甲 醒耐受菌株的方法多是通过进化工程和基因工程。然而，其工艺复杂，成本较高。微生物的 一个重要特性就是在压力环境下改变细胞内部的物理条件来适应抗性环境并将其应用在 生物合成k苯基乙酷基甲醇。
【发明内容】
[0004] 发明目的：本发明的目的是提供酿酒酵母菌在生物合成k苯基乙酷基甲醇中的 应用。 阳0化]技术方案：本发明提供的酿酒酵母菌在生物合成k苯基乙酷基甲醇中的应用。
[0006] 所述应用，具体包括W下步骤：
[0007] (1)苯甲醒耐受酵母菌株的获得：将酵母菌株活化后接种于含不同浓度苯甲醒的 固体培养基中培养；将苯甲醒耐受菌株接种到高浓度种子培养基中培养；将生长到稳定期 的细胞分离后，再接种到相同的高浓度种子培养基中培养；获得的稳定期的菌株，即为苯甲 醒耐受酵母菌株；
[0008] (2)生物催化剂的构建：利用复合载体固定化苯甲醒耐受酵母菌株，即为生物催 化剂；
[0009] (3)微生物转化：生物催化剂、底物在转化培养基和等体积辛醇的两相体系中发 酵即得k苯基乙酷基甲醇。
[0010] 其中，步骤（1)中，所述酵母菌为酿酒酵母菌为S.cerevisiaeAY9316U购自 ATCC，编号CCTCCAY93161)。
[0011] 其中，步骤（2)中，所述复合载体为含聚乙締醇和海藻酸钢的固定化缓冲液；所述 固定化缓冲液为含20mmol/LΜ拆〇4和Immol/L硫胺素焦憐酸灯PP)的0. 5MKH2PO4/K2HPO4 缓冲液；复合载体中，所述聚乙締醇的质量百分比浓度为5-15%;所述海藻酸钢的质量百分 比浓度为1. 5-2. 5%。
[0012] 其中，步骤（2)中，复合载体固定化苯甲醒耐受酵母菌株的步骤具体为：将聚乙締 醇和海藻酸钢和Ig苯甲醒耐受酵母菌株加入到4ml的含20mmol/LΜ拆〇4和Immol/L硫胺 素焦憐酸灯PP)的0. 5MKH2PO4/K2HPO4缓冲液中，混匀后用20ml注射器吸取混合液并滴入 4°C的含0. 2%戊二醒的4%化C12饱和棚酸溶液中制粒固化2地，洗涂2~3次。
[0013] 其中，步骤（3)中，所述转化培养基的组成为：葡萄糖30旨/1，酵母浸粉lOg/l， MgClzO. 5g/L，（NH4)2S〇4l〇g/l，MnCl2〇. 2g/l，CaCl2〇. 2g/l，KH2P〇4〇.6g/L，pH用醋酸钢-冰醋 酸调至6. 5。
[0014] 其中，步骤（3)中，反应体系中还可加入添加剂，所述添加剂为β-环糊精或 3-(Ν-吗嘟）丙横酸。
[0015] 有益效果：本发明方法一方面通过筛选酵母菌株获得对苯甲醒的耐受性高、生长 性状稳定的酵母菌株，另一方面采用复合载体固定化苯甲醒耐受酵母菌株改善菌体的代谢 状况，稳定并延长酶的催化时间，改进反应条件，提高关键底物苯甲醒的浓度，简化菌体与 转化液分离程序，从而提高L-PAC累积量（转化液中L-PAC浓度接近45g/L)。该方法大大 提高了原料利用率，降低了生产成本，显著提高L-PAC的产量，可为生物法合成麻黄素的产 业化奠定基础。
【附图说明】
[0016] 图1苯甲醒耐受酵母菌株的获得的工艺流程图。
[0017] 图2本发明筛选方法筛选得到的分离菌株的相对生长率图；其中，A:在0. 2%苯甲 醒浓度下分离菌株的相对生长率；B:在0. 4%苯甲醒浓度下分离菌株的相对生长率；C:在 0.6%苯甲醒浓度下分离菌株的相对生长率；D:在0.8%苯甲醒浓度下分离菌株的相对生 长率。
[0018] 图3生物催化剂转化合成L-PAC的原理图。
[0019] 图4实施例2最终得到的反应液的HPLC检测结果图。
【具体实施方式】
[0020] W下实例将结合附图对本发明作进一步说明。本实施例在W本发明技术方案为前 提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的 条件。
[0021] 实施例1苯甲醒耐受酵母菌株的获得
[0022] 苯甲醒耐受酵母菌株的获得，见图1，步骤如下：
[0023] (1)苯甲醒耐受菌株的筛选：从市售酵母菌株中活化挑取单菌落发酵，获得酵 母细胞；取酵母细胞Ig悬浮于10ml生理盐水中，分别取细胞液50μ1接种于含苯甲醒 0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的固体培养平板上，30°(：培养，每12}1观察平板 菌落生长情况；
[0024] 似耐受性分析：抓含苯甲醒0.2%、0.4%、0.6%的固体培养平板上的耐受单菌 落，接种至分别含0. 2%、0. 4%、0. 6%、0. 8%苯甲醒的150ml种子培养基中发酵24h' 阳0巧](3)W0成。。=0.1的初始菌体浓度接种到相同的高浓度种子培养基中发酵2地， 在600nm波长下，用分光光度计测定菌体密度，计算菌株的相对生长率，即可获得苯甲醒耐 受菌株，结果如图2所示。图2显示，酿酒酵母菌S.cerevisiaeAY93161对苯甲醒的耐受 性提高，生长性状稳定。 阳0%] 其中，种子培养基为葡萄糖26g/l，蛋白腺15旨/1，酵母浸粉8g/l，^C1 3g/l， KH2PO4O. 4g/L，MgClzO. 5g/L，抑为自然值，余量为单蒸水；种子培养基内培养条件：30°C、220r/min。
[0027] 实施例2生物合成kPAC
[0028] (1)生物催化剂的构建
[0029] 利用复合载体固定