专利名称：：一种低分子肝素药物组合物及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种抗血栓药物及其制备方法，尤其涉及一种用于非注射抗血栓药物及其制备方法。
背景技术：
：低分了量肝素(LowMolecularWeightHeparin)是普通肝素(UnfractionatedHeparin)通过化学分解或酶催化裂解等方法制成的分了量较小的肝素片断，其平均分子量在20008000dal(分子量单位道尔顿)之间，且大部分在4000-6000dal之间。低分子肝素为80年代推向市场的新型抗血栓药物，由法国Sanofi公司开发的低分子量肝素钙，1986年首先在法国上市，以后陆续在比利时，德国、瑞士、西班牙等国上市。在低分子量肝素问世之前，肝素是治疗与预防血栓形成及栓塞的传统首选药物。但肝素最大的副作用是出血，有时甚至可导致致死性颅内出血。低分了量肝素由肝素分级或降解获得，抗血栓作用强而出血副作用很小，可不断进行临床监护，半衰期长，每日只注射一次，生物利和度高达98%，长期使用不会引起骨质疏松及血小板减少，而且不需要象普通肝素和华法林那样麻烦和耗时的临床监护。目前市场上用于抗凝和抗血栓治疗的肝素制剂均为注射剂，病人耐受性不好，特别是进行关节置换手术的病人出院后l一2周仍需每天注射肝素，非常不便。另外，对预防静脉栓塞的病人，静注过高的短时血药浓度和迅速消除的特点对预防疗效并不有力。因此开发一种非注射肝素剂型，同时能延长低分子肝素的作用时间并保持平稳的血药浓度成为临床和医药企业长期追寻的目标。固体脂质纳米粒是20世纪90年代初发展起来的纳米级新型胶体给药系统，是继乳剂、脂质体和聚合物纳米粒之后非常具有发展前景的靶向控制释放给药系统。在公开的文献报道中，固体脂质体纳米粒一般采用天然或合成的类脂材料，4如硬脂酸、卵磷脂、单苷脂等为载体，将药物包裹于类脂核中制成固体胶粒给药系统。它具有一定程度上控制药物释放、避免药物泄露的特点，同时兼具毒性低、生物相容性好、促进口服生物利用度等优点，是近年国内外大分子或较大分子药物口服给药系统研究的重要方向。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种更合理、更安全的非注射缓释型肝素药剂及其制备方法。为解决上述技术问题本发明所采用的技术方案如下一种低分子肝素药物组合物，平均粒径为50500nm，能在水性介质中均匀混悬分散，该组合物的组分有(1)有效量的活性物质低分子肝素以及未经过裂解的肝素；(2)至少一种的固体脂质材料；(3)表面活性剂材料；(4)液态不饱和脂肪酸。其中低分子肝素以及未经过裂解的肝素的分子量为20008000Dal。所述的液态不饱和脂肪酸为油酸。所述的固体脂质材料选自脂肪酸及其衍生物，可以是选自硬脂酸及其衍生物、甘油硬脂酸酯、甘油棕榈酸酯、甘油山嵛酸酯、蔗糖硬脂酸、蔗糖芥酸酯中的一种或多种。其中优选硬脂酸及其衍生物，更优选单硬脂酸甘油酯和硬脂胺。优选地，所述的低分子肝素纳米粒的组分的重量份为硬脂胺1050份，单硬脂酸甘油酯90130份，肝素25份，油酸5份，SP認855份。(SPAN:司盘，即失水山梨醇三油酸酯)本发明还提供了一种上述低分子肝素药物组合物的制备方法，其可以通过下述的溶剂扩散法制备(1)将低分子肝素、固体脂质材料、表面活性剂以及液态不饱和脂肪酸一同溶解或熔融于有机溶剂相，(2)将有机相迅速注入低温搅拌中的水相，形成负载药物的脂质纳米粒分5散液，(3)通过盐析的方法使纳米粒在水相中析出，(4)高速离心分离获得的纳米粒沉淀加含表面活性剂的水溶液再分散，即得目标的低分子肝素脂质纳米粒分散液。进一步地其制备方法可以是(1)将低分子肝素肝素溶于适量的预热的纯化水，分别将硬脂胺、单硬脂酸甘油酯、油酸和SPAN85溶于适量的无水乙醇，将上述两相分别加热至60。C以上，以水相与油相比为l:4混合，形成澄清不混浊的醇溶液，(2)将上述油相迅速倒入预冷至15。C的冰水中，快速搅拌约46分钟，形成均匀分散带蓝色乳光的载药脂质纳米粒初分散液，(3)将上述所得的载药脂质纳米粒初分散液，在磁力搅拌下加入水相重量不高于1%的氯化钠，纳米粒迅速集结絮凝，然后静置，(4)高速离心分离上清液和沉淀，取上述沉淀，去离子水洗涤，用0.2%的poloxamer188(泊洛沙姆)水溶液再分散，辅以探头超声使成均匀分散的乳白色纳米粒混悬液。本发明中固体脂质材料是一类在常温状态下为固态的脂肪酸及其酯类材料的通称。此类脂质材料常用的包括硬脂酸及其酯、棕榈酸及其酯、山嵛酸及其酯、芥酸及其酯，具体来讲，可以从以下产品中选择硬脂酸、山嵛酸、甘油硬脂酸酯、甘油棕榈酸酯、甘油山嵛酸酯、蔗糖硬脂酸、蔗糖芥酸酯等。其中优选甘油硬脂酸，更优选单硬脂酸甘油酯。另外，脂质材料也包括脂肪酸的其他衍生物，如硬脂酸的胺类衍生物硬脂胺。在本发明中，以脂质/酯质材料作为提供固体空间架构的基质材料，保护药物在水性介质中泄漏，并通过体内的酯酶降解等方式释放药物，从而实现包含于纳米粒载体中的药物通过哺乳动物生物膜。单硬脂酸甘油酯是含有C16—C18长链脂肪酸与丙三醇进行酯化反应而制得。是一种非离子型的表面活性剂。它既有亲水又有亲油基因，具有润湿、乳化、起泡等多种功能。单硬脂酸甘油酯是食物的乳化剂和添加剂;化妆品及医药膏剂中用作乳化剂，使膏体细腻，滑润;用于工业丝油剂的乳化剂和纺织品的润滑剂;在塑料薄膜中用作流滴剂和防雾剂;在塑料加工中作润滑剂和抗静电剂，在其他方面可作为消泡剂、分散剂、增稠剂、湿润剂等。硬脂胺(Stearylamine)或称十八烷基胺，由硬脂酸与氨在加热(350°C)下进行氨化反应，得十八腈(硬脂腈)，再在13(TC下经加压(3.43MPa)用催化剂阮莱镍催化加氢而得。属毒性较低的胺衍生物，对粘膜有一定刺激性，少量可用于口服。硬脂胺作为一种带正电荷的亲酯性材料，在处方中的少量加入有助于提高阴电荷性的肝素分子在脂质材料所形成的空间结构中的稳定性。提高药物的包封，降低泄漏。油酸即顺式-9-+八(碳)烯酸，是一种在常温下为液态的不饱和脂肪酸。^11111"m/croewca/ww/Wowo/fl^Mgs./"f.尸/zarm，2002,242:/2/-/2S)等石开究报道在固体脂质中混和形态相异的液体脂质作为混合类脂基质，以此制备得到新型SLN—纳米结构脂质载体(nanostructuredlipidcarrier,NLC)。液体脂质的加入，可扰乱固体脂质规则的晶格结构，增加纳米粒结构中不规则晶型的比例，使承载脂溶性药物的空间容量增加，从而提高载体的载药能力(So^o,￡.及，『/M/"g,5ar6o叫CM,eZa/.Z)eve/o/me"Zo/aco欣o〃et/re/easeybrnw/a^ow6aset/ow5ZjV失水山梨醇三油酸酯为HLB值较低的亲油性非离子表面活性剂，市售产品又成Span系列，如Span60、Span80、Span85等。Span85为药学上常用的非离子型表面活性剂，HLB值1.8。它具有乳化、润滑能力，同时还具有消泡作用。本发明中，表面活性剂的加入主要用于提高亲水性药物肝素或低分子肝素在脂质架构中的稳定性，保持药物不泄漏。本发明的低分子肝素药物组合物是一种更合理、更安全的非注射缓释型肝素药剂，可通过口服摄入的方式给予包括人的哺乳动物，具有抗凝、抗血栓的作用，病人的治疗耐受性好，治疗安全、方便、易于实施，更解决了一些不适于静注病人的难题，同时能延长低分子肝素的作用时间并保持平稳的血药浓度。图1是本发明的低分子肝素药物组合物实施例2的口服处方和阴性、阳性对照药效试验的比较图。其中1.阳性对照，皮注500IU/kg，n=472.阴性对照，口服生理盐水，n=23.处方2,口服2500IU/kg，n=9具体实施例方式为让本发明的上述目的、特征和优点能更明显易懂，以下结合具体实施方式对本发明作详细说明1.实施例及理化性质评价将低分子肝素肝素(吉派林，杭州九源基因工程有限公司生产，活度108IU/mg)溶于少量预热的纯化水，分别将硬脂胺、单硬脂酸甘油酯(即单甘酯)、油酸和SPAN溶于适量的无水乙醇，将上述两相分别加热至6(TC以上，混合(V(水相:油相)=1:4)，形成澄清不混浊的醇溶液，上述油相迅速倒入预冷至1°C(15'C均可)的冰水中，快速搅拌约5分钟，形成均匀分散带蓝色乳光的载药脂质纳米粒初分散液。各实施例处方中各原辅料的用量参考表格1(R1R4为试验组实施例1实施例4)。表格1:低分子肝素脂质纳米粒处方组成成分/处方R1R2R3R4硬脂胺10mg20mg30mg50mg单甘酯130mg120mg110mg90mg肝素25mg"mg"mg25mg油酸5mg5mg5mg5mgSPAN855mg5mg5mg5mg上述所得的载药脂质纳米粒初分散液，在磁力搅拌下加入水相重量不高于1%的氯化钠，纳米粒迅速集结絮凝，静置5分钟，高速离心(10000rpm，5°C，5分钟)分离上清液和沉淀。取上述沉淀，去离子水洗涤3次，用0.2%的poloxamer188水溶液再分散，辅以探头超声(400w强度，4050次)使成均匀分散的乳白色纳米粒混悬液，用于动物给药。8另取上述上清夜，以0.22pm微孔滤膜过滤，用去离子水稀释，以经典的天青A法(Heparinandrelatedsulfatedmucopolysaccharides.Methodsofbiochemicalanalysis.1977.24.203)测定上清液中药物的浓度，计算间接包封率。药物包封率(％)=(Wa-Ws!—Ws2)/WaX100%其中Wa:投料药物量，Ws1:上清夜游离药物量，Ws2:表面吸附药物量在调盐絮凝之前，空白或载药纳米粒的水性分散液，用去离子水稀释成大约每lml水含有0.05mg脂质的浓度，用Zetasizer(3000HS,MalvernInstruments,UK)测定粒径和电位，以体积平均直径、聚合指数和表面zeta电位表征纳米粒的物理性质。详见表格2。表格2:低分子肝素脂质纳米粒的理化性质和包封率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>%2.载药脂质纳米粒的抗凝药效评价取实施例制备的载药脂质纳米粒再分散液R1、R2和R4的样品，分别灌胃给予预先禁食但不禁水的小鼠，以皮下注射为对照。每组5只小鼠(购自浙江省医学科学院实验动物中心)，均为雄性，体重2025g。试验组给药剂量分别1200IU/kg，皮下注射对照组剂量为600IU/kg。于给药后10小时内，按时间点自小鼠眼眶毛细管取血，进行凝血时间的检视(毛细管凝血法)。试验结果显示(见表格3)，对照组药物皮下给药，迅速吸收，4h血浓降低，凝血时间慢慢縮短，5h已基本无效。吉派林说明书显示皮下给药的半衰期约45小时，基本与我们试验结果吻合；试验组三个处方均在2h左右起效(凝血时间延长)，维持至68h凝血时间逐渐恢复正常，至10h全部组别凝血时间恢复正常，不过三个处方之间无显著性差异。表格3:低分子肝素脂质纳米粒的抗凝药效比较动物对照组R1R2R4标记无左耳左右耳右耳数量给药皮下灌胃lml灌胃lml灌胃lmlOhri5"l'20"l'25"l'35"0.5h5，1'15"l'32"2'05"lh/l'20"l'33"l'46"L5h5，l'55"l'20"l'40"2h/2'40"2'50"3'15"2.5h4'10"3，20"4,24"3h/3'55"3'38"3'33"3.5h/5，4,29"4h3，30"/4'21"3'58"5hl'35"4'05"4'10"4'25"6h1，15"2'46"3'45"2'40"8h/l'45"2'53"2'25"10h/l'33"ri5"1，29注根据毛细管凝血法的判断依据，凝血时间超过5min的均按5min计算。由于毛细管凝血法通过肉眼观察分辨，其方法准确性不高，其结果仅作为提示低分子肝素经给药部分摄取进入血液发挥抗凝药效的参考，不能区别各处方间的优劣以及循环系统中药物的摄入水平。3.载药脂质纳米粒的大鼠血浆Anti-FatorXa活度测定肝素和低分子肝素的抗Xa因子测定方法收载于收载于美国药典26版、欧洲药典4、英国药典2000版等。我们选择法国STAGO公司销售的STACHROMAnti-FatorXa活度测定试剂盒，其测定原理为根据Teien文献肝素和生色底物酰胺化作用。试验材料Sprague-Dawley雄性大鼠；2%戊巴比妥钠；3.2%枸橼酸钠溶液试验样品吉派林(低分子肝素注射液)，处方R2样品(见表格1)、生理盐水。10给药方案(1)皮下注射(阳性对照)以吉派林人皮下给药80IU/Kg换算，大鼠的给药剂量约为500IU/Kg，即4.3mg/Kg或一只250g的大鼠给药l.lmgLMWH(该批次LMWH效价为115.8anti-XaIU/mg)。(2)试验组口服(灌胃给药)试验剂量设计为皮下给药的5倍，即21mg/Kg,或250g体重5.5mg的LWMH。(3)阴性对照以生理盐水口服作为阴性对照。血样采取取样量大鼠尾静脉取血每次可取血量为0.30.5ml，试剂盒检测需要分离的血浆100ul，因此设计每次尾静脉取血0.3ml0.4ml，于塑料离心管。取血点皮下(Ohr、0.5hr、lhr、2hr、4hr、6hr);口服(Ohr、lhr、2hr、4hr、6hr、8hr)。血样处理每次取血于含0.109M(即3.2%)枸橼酸钠的塑料离心管中(9份血液l份枸橼酸钠，即每次枸橼酸钠约40ul)，收集的血样必须在l小时内进行离心分离血桨，离心要小心以减少血小板变化同时又最大程度去除血小板。离心速度3000g，时间不少于15min，温度不高于18。C。移液枪分离取出血浆，2(TC放置最多2小时内必须进行分析测定；或者冷冻-2(TC下可保存一个月，待测定前30分钟于37"C水浴中融化。血样的效价测定照试剂盒测定说明进行测定。试验结果通过和对照试验比较发现(参见附图l)，阳性对照皮注迅速达到很高血药浓度(实际治疗有效浓度为0.2~1.0)，但药效持续不超过8hr，且Cmax超过安全警戒的2IU/mlXa浓度，存在出血的危险性；而应用新载体技术的处方，在口服灌胃给药后，血药浓度平稳持久(超过8hr)，且维持在预防和治疗所需要的有效浓度区间(0.2~1.0)，相对皮注更安全可靠。权利要求1.一种低分子肝素药物组合物，平均粒径为50～500nm，能在水性介质中均匀混悬分散，其特征在于该组合物的组分有(1)有效量的活性物质低分子肝素以及未经过裂解的肝素；(2)至少一种的固体脂质材料；(3)表面活性剂材料；(4)液态不饱和脂肪酸。2.根据权利1所述的低分子肝素药物组合物，其特征在于低分子肝素以及未经过裂解的肝素的分子量为20008000Dal。3.根据权利1所述的低分子肝素药物组合物，其特征在于所述的液态不饱和脂肪酸为油酸。4.根据权利要求l、2或3所述的低分子肝素药物组合物，其特征在于所述的固体脂质材料选自脂肪酸及其衍生物。5.根据权利要求4所述的低分子肝素药物组合物，其特征在于所述的固体脂质材料选自硬脂酸及其衍生物、甘油硬脂酸酯、甘油棕榈酸酯、甘油山嵛酸酯、蔗糖硬脂酸、蔗糖芥酸酯中的一种或多种。6.根据权利要求5所述的低分子肝素药物组合物，其特征在于所述的固体脂质材料选自硬脂酸及其衍生物。7.根据权利要求6所述的低分子肝素药物组合物，其特征在于所述的固体脂质材料为单硬脂酸甘油酯和硬脂胺。8.根据权利要求7所述的低分子肝素药物组合物，其特征在于所述的低分子肝素纳米粒的组分的重量份为-硬脂胺1050份，单硬脂酸甘油酯90130份，肝素25份，油酸5份，SPAN855份。9.一种上述的低分子肝素药物组合物的制备方法，其特征在于通过下述的溶剂扩散法制备(1)将低分子肝素、固体脂质材料、表面活性剂以及液态不饱和脂肪酸一同溶解或熔融于有机溶剂相，(2)将有机相迅速注入低温搅拌中的水相，形成负载药物的脂质纳米粒分散液，(3)通过盐析的方法使纳米粒在水相中析出，(4)高速离心分离获得的纳米粒沉淀加含表面活性剂的水溶液再分散，即得目标的低分子肝素脂质纳米粒分散液。10.根据权利要求9所述的低分子肝素药物组合物的制备方法，其特征在于(1)将低分子肝素肝素溶于适量的预热的纯化水，分别将硬脂胺、单硬脂酸甘油酯、油酸和SPAN85溶于适量的无水乙醇，将上述两相分别加热至60"C以上，以水相与油相比为l:4混合，形成澄清不混浊的醇溶液，(2)将上述油相迅速倒入预冷至15"C的冰水中，快速搅拌约46分钟，形成均匀分散带蓝色乳光的载药脂质纳米粒初分散液，(3)将上述所得的载药脂质纳米粒初分散液，在磁力搅拌下加入水相重量不高于1%的氯化钠，纳米粒迅速集结絮凝，然后静置，(4)高速离心分离上清液和沉淀，取上述沉淀，去离子水洗涤，用0.2%的poloxamer188水溶液再分散，辅以探头超声使成均匀分散的乳白色纳米粒混悬液。全文摘要本发明公开了一种低分子肝素药物组合物及其制备方法，该组合物平均粒径为50～500nm，能在水性介质中均匀混悬分散，该组合物的组分有有效量的活性物质低分子肝素以及未经过裂解的肝素；至少一种的固体脂质材料；表面活性剂材料；液态不饱和脂肪酸。该制备方法采用溶剂扩散法制备。本发明的低分子肝素药物组合物是一种更合理、更安全的非注射缓释型肝素药剂，可通过口服摄入的方式给予包括人的哺乳动物，具有抗凝、抗血栓的作用。文档编号A61K31/727GK101485678SQ20091004609公开日2009年7月22日申请日期2009年2月12日优先权日2009年2月12日发明者康小玉,郦小平申请人:上海宝龙药业有限公司