专利名称：一种生物多肽血管支架的制作方法
技术领域：
本发明涉及医疗器械领域，尤其涉及一种挖槽的血管支架，该支架的槽中存储有 抗vWF相关抗体和蛋白。
背景技术：
支架植入是冠心病的常用治疗方法，但经常发生有相当多的病人会植入支架后 血管会发生再狭窄。血管再狭窄是一个复杂过程，大致可分为5个阶段(l)血栓形成期， (2)炎症期，(3)血管平滑肌细胞增殖期，(4)基质形成期，(5)血管重塑期(Drug-Eluting Stents, Delayed Healing, AndHypersensitivity Reactions, R. Virmani， tctmdTM， April, 2006)。在支架植入过程中，由于导管摩擦及球囊扩张作用，病变部位附近血管受伤内皮层 剥落，血管组织裸露，因此诱发凝血及炎症反应，凝血及炎症反应可释放一系列生长因子、 细胞因子及炎症因子，导致平滑肌细胞(由收縮型转为合成型)及基质过度增殖。这一系 列过程是一个相互联系、相互影响的有机过程，其中血栓可引起炎症，炎症可以加重血栓， 平滑肌细胞增殖可导致细胞外基质增加，而基质增加又可加重细胞增殖。这一系列反应的 最终结果导致了血管再狭窄。 目前市场上用于治疗冠心病的药物支架(Drug-Eluting-Stent， DES)，携带了可 以抑制平滑肌增殖的药物，自上市以来，其有效性有目共睹，将金属裸支架(Bare Metal Stent,BMS)植入后血管再狭窄率从20% _30%降到了 3% _6%，但安全性问题近来逐渐暴 露出来，受到许多医生/专家的质疑。目前暴露出来的最大问题是晚期血栓问题。虽然DES 晚期血栓发生的机率很低，低于1%，但后果可能是致命的。为避免血栓问题，病人必须长 期(六个月到一年，特殊病人甚至终身)服用抗凝血药，这给病人带来很大的经济负担，并 有可能引发出血等副作用。 鉴于第一代DES有延迟受伤血管愈合的问题，"促愈合(pro-healing)"成为DES 的一个目标。这方面比较成熟的产品是Orbus-Neich的Genous支架，这种支架表面接有抗 CD34抗体片段(Fab)，植入血管后，接枝在支架表面的抗体片段可以将血液中内皮始祖细 胞(Endothelial Progenitor Cell，EPC)俘获，EPC迅速分化成成熟内皮细胞，促使受伤血 管愈合。但临床试验随访结果显示Genous支架没有晚期血栓问题(只服用30天抗血小板 药)，但有效性不如第一代DES。此外Genous是通过化学接枝的方法在支架表面引入抗体， 效率低成本高，引入的抗体量有限，且仅限于支架表面，其他广大病变部位仍无抗体覆盖， 影响内皮化效率。 从支架植入后血管发生再狭窄的机理来看，受伤血管引发凝血是导致再狭窄的 一个重要原因。支架植入过程中，球囊扩张或支架植入均会导致血管壁内皮组织受损， 从而造成血管壁胶原蛋白裸露。在高切变应力(如冠脉血流中)条件下，血液中血管血 友病因子(von Willebrand Factor, vWF)的A3域将迅速和血管壁裸露的胶原蛋白结 合(Biochemistry 1986 ;25(26) :8357-8361， Blood 1987 ;70 (5) : 1577-1583， J.Biol. Chem. 1987 ;262(28) :13835-13841)，结合在胶原蛋白的vWF在高切变应力下作用下，其
3Al域又迅速和血小板表面受体GPIb/IX/V结合(Blood 1985 ;65(1) :85-90， Blood 1985 ; 65(4) :823-831， Br. J. Haematol 1986 ;63(4) :681-691)，从而激活血小板，因此，vWF是高 切变应力下胶原蛋白激活血小板的一个关键因子。有文献研究表明，在高切变应力下，如果 没有vWF的桥梁作用，胶原蛋白和血小板表面其他多种受体直接作用无法导致足够的血小 板积聚从而引发血栓(Br. J. Haematol 1986 ;63(4) :681-691)。 vWF在动脉血管受损愈合过程中的作用非常重要，Giddings等人研究了猪劲 动脉球囊扩张受损后，受伤局部部位vWF表达随时间变化的关系(Ar t e r i o s c 1 e r o s i s ， Thrombosis, and Vascular Biology, 1997 :17 :1872-1878)，结果发现手术10分钟后，在 受伤血管局部表面粘附的血小板中就可以检测到vWF(正常猪劲动脉血管中没有vWF)，从 手术后30分钟到7天这段时间内，在受伤血管内表面可以检测到一层均匀分布的vWF， 这一结果证明血管受损可诱导vWF在受伤血管部位表达/富集，从而引发凝血等一系列 反应。抗vWF抗体A j vW- 2被在不同动物模型中证明可以抑制血管受损后凝血及内膜 增生(Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 2000 :20 :2303-2308， Arteriosclerosis, Thrombosis, and VascularBiology， __ :2003 :1105-1100)。
发明内容
鉴于支架植入过程中容易出现血管再狭窄问题，并结合支架植入后血管发生再狭 窄的机理，本发明提出一种存储有抗vWF相关抗体和蛋白的生物多肽血管支架，这种支架 能够在支架植入手术后有效防止血管发生再狭窄。 基于本发明的技术方案，所述的生物多肽血管支架为挖槽的支架，包括多组金属 波杆和金属连接杆。其中，所述金属波杆呈波浪形，其上挖槽，该槽中存储药物活性成分；所 述金属连接杆的中部呈U形或S形，其两端分别与不同所述金属波杆的弯曲部相连接。其 中金属波杆起主要支撑血管壁的作用，而连接杆则能增加支架的柔顺性。具体而言，所述支 架由多组金属波杆和金属连接杆连接成圆柱状而成，使用前支架被压握在输送器上，被输 送到病变部位后通过球囊加压而释放，撑开血管并支撑血管不使其弹性回縮，输送器则撤 回完成整个支架植入过程。 在活性药物成分上，本发明从噬菌体多肽库筛选出以vWFAl/A3域为作用耙点的 多肽，不通过目前药物支架常用的聚合物载体，直接将这类多肽上载到表面刻槽或开孔的 金属支架上，支架植入后，这些多肽迅速释放到受伤血管壁处，在受伤血管部位迅速饱和， 阻止裸露的胶原蛋白通过vWF对血小板激活，从而抑制血栓形成及后期的再狭窄。
具体而言，在本发明技术方案中采用的所述药物活性成分可以是抗vWF相 关抗体和/或蛋白多肽，该抗体或蛋白选自一种或多种下列抗vWF相关抗体或蛋白 AJvW-2抗_(人类vWF Al域)单克隆抗体(Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 2000 :20 :2303-2308， Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, --:2003 :1105-1100) 、 AJW200 (Contribution of von Willebrand factor to thrombus formation on neointimaof rabbit stenotic iliac artery under high blood—flow velocity.Yamashita A， Asada Y， et al.Arterioscler Thromb Vase Biol.2003 Jun 1 ;23 (6) :1105-10. Epub2003 May 15.) 、82D6A3抗-(人类vWF A3域) 单克隆抗体(A consensustetr即印tide selected by phage display adopts theconformation of a dominantdisconti皿ous epitope of a monoclonal anti—VWF antibody that inhibits the vonWillebrand factor—collagen interaction. J Biol Chem.2003 S印26 ;278(39) :37815-21. Epub 2003 Jul 10) 、 mAb LJ-C3、 mAb NMC-4(抗 Al域)、mAbMR5(Identification of domains responsible for von Willebrand factor type VIcollagen interaction mediating platelet adhesion under high flow. Mazzucato M， Spessotto P， et al.J Biol Chem. 1999 Jan 29 ;274(5) :3033-41.)、 ALX-0081(Ablynx biopharmaceutical company)、金精三羧酸(ATA)、乳清酸Saratin ;该 蛋白多肽为 一种或多种具有下列多肽序列的抗vWF相关蛋白GDCFFGFLNSPWRVC (L15G8)、 RSSYWVYSPWRFISR(L15C5) 、 CMTSPWRC (C6H5) 、 CRTSPWRC (C6G12) 、 CYRSPWRC (C6A12)。
上述抗vWF相关抗体的名称，例如AJvW-2、 AJW200均为本领域相关专业文献上广 泛报道的抗vWF相关抗体，其制作方法可通过相关文献检索而获知。此外Sigma-aldrich 等公司提供的商品化的抗vWF抗体(如货号为HPA001815、 HPA002082和F3520等)可用 于本发明支架上。抗vWF相关蛋白的名称，例如GDCFFGFLNSPWRVC(L15G8)，是简写形式的氨 基酸多肽序列，其后的括号中为本领域技术人员对该序列约定俗成的名称或代号。通常根 据该序列即可合成相应序列的多肽蛋白。 在本发明的技术方案中，因为多肽药物的特殊性，常用的药物支架聚合物载体对 本发明不适用。普通的药物支架在其金属支架外一般包括最外层的聚合物控释层和内层 的药物贮存层，通过聚合物的控释作用控制支架上药物的释放速度达到抑制血管内膜增生 的作用。而抗体/多肽由于分子量比较大，不能通过聚合物控制释放速度。另外目前药物 支架非降解型聚合物载体的在体内长期存在，被怀疑可造成过敏及炎症反应，可能是引发 血栓生成的原因。与背景技术中所介绍的Genous支架将抗体通过化学方式接枝到支架表 面不同，本发明将多肽以物理的方法直接上载到支架的波杆上所开的槽中。该上载方式可 以使支架植入人体血管后，其中的多肽得到迅速释放。该方式至少有两个优点，一是多肽可 以迅速释放渗透到支架及支架附近的血管组织，可以更有效地发挥作用，而不像Genous支 架，仅仅在支架表面发挥作用。这个方法另外一个优点是免除了繁琐的化学接枝步骤，这可 以最大限度保存多肽活性，减少多肽原料在化学接枝这一步的浪费，并简化生产工艺。还有 不可降解。 在关于所采用的抗体和/或多肽的选择上，本发明选用的多肽，具有专一性好和 亲和性高的优点，比一般化学药物的副作用要小。和常用的抗体片段或抗体相比，多肽还具 有免疫原性低，毒性低，稳定性高等优势。而且多肽筛选及制备周期相对较短，不需要考虑 人化或人源化问题，后期规模化生产所需投入的人力和财力也大大低于抗体片段。虽然多 肽和其靶点作用的亲合性一般来说不如抗体来得高，但在筛选过程中通过多次淘选及建立 突变库的方法，也可以得到高亲和力的多肽。而且，和针对血小板表面受体的抗血小板药物 相比，针对vWF耙点的多肽优势在于它只抑制血管受损处血小板激活，不会对正常或其他 生理激活的血小板产生任何影响，因而不会有导致出血的副作用。
图1为本发明实施例1所述的生物多肽血管支架的整体结构示意图；
图2是本发明实施例1所述的生物多肽血管支架中的金属波杆截面图。
具体实施例方式
下面通过实施例进一步说明本发明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。 实施例l 生物多肽血管支架的结构 本实施例提供了 一个生物多肽血管支架的实例，参见图1 ，其为生物多肽血管支架 的整体结构示意图。本发明所述的生物多肽血管支架1为挖槽的支架，其包括多组金属波 杆11和金属连接杆12、12'。其中，所述金属波杆ll呈波浪形，其上挖有槽。所述金属波 杆11包括挖槽部位以及未挖槽部位，挖槽部位的槽中存储药物活性成分。所述金属连接杆 12、12'的中部分别呈U形和S形，如图所示，金属连接杆12的中部为U形，金属连接杆12' 的中部为S形，其两端均分别与不同金属波杆的弯曲部相连接。 上述挖槽部位的横截面示意图请参见图2，如图所示，金属波杆11的表面挖有槽， 该槽中存储药物活性成分13。
实施例2 在生物多肽血管支架中加载活性药物成分 本实施例提供了一个在血管支架上载入多肽类药物活性成分的实例，所采用 的血管支架如实施例l所述。所述的药物活性药物成分是从噬菌体多肽库筛选出以 vWFAl/A3域为作用靶点的多肽，其选自一种或多种具有下列多肽序列的抗vWF相关蛋白 GDCFFGFLNSPWRVC(L15G8)、 RSSYWVYSPWRFISR(L15C5)、 CMTSPWRC(C6H5)、 CRTSPWRC (C6G12)、 CYRSPWRC(C6A12)。所述多肽不通过目前药物支架常用的聚合物载体上载到支架上，而是直 接将这类多肽上载到金属支架的波杆上所开的槽中，以保证支架植入后这些多肽能迅速释 放到受伤血管壁处，在受伤血管部位迅速饱和，阻止裸露的胶原蛋白通过vWF对血小板激 活，从而抑制血栓形成及后期的再狭窄。本实施例中，这种多肽蛋白抗体加载方式为精确定 位点滴，直接将上述多肽类物质的溶液液体通过微量点滴的方式直接滴加于如图2所示的 金属波杆11上所开的槽内，这种加载方式下多肽溶液利用率非常高。 参照图2所示的金属波杆截面图，在金属波杆11的挖槽部位111内点滴多肽 CMTSPWRC (C6H5)，所述的CMTSPWRC (C6H5)溶解在磷酸盐缓冲溶液中。该磷酸缓冲液可通过 0. 2mol/L NaH2P04溶液19ml和0. 2mol/LNa2HP04溶液81ml混合而制备。CMTSPWRC(C6H5) 溶解后的浓度为l-100ug/ml，将此多肽溶液通过微量点滴于支架杆挖槽部位111，真空解 析后即得CMTSPWRC (C6H5)多肽抗体支架。
实施例3 在生物多肽血管支架中加载活性药物成分 本实施例提供了另一个在血管支架上载入抗vWF相关抗体或蛋白类药物活性成 分的实例，所采用的血管支架如实施例1所述。所述活性成分的筛选以及加载方式和实施 例2相同。 参照图2所示的金属波杆截面图，在金属波杆11的挖槽部位111内点滴选自一 种或多种抗vWF相关抗体或蛋白AJvW-2 (抗_(人类vWF Al域)单克隆抗体)、AJW200、 82D6A3 (抗-(人类vWF A3域)单克隆抗体)、mAb LJ-C3、 mAb NMC-4(anti Al domain)、 mAb MR5、 ALX-0081、金精三羧酸(ATA)、乳清酸。所述的82D6A3溶解在Tris缓冲溶液中。
6该磷酸缓冲液可通过8g NaCl、0. 2g KC1和3g Tri溶解于1000ml蒸馏水中混合，调节pH 至7. 2即得。82D6A3溶解后的浓度为l-10ug/ml，将此抗体溶液通过微量点滴于支架杆挖 槽部位111，真空解析后即得82D6A3多肽抗体支架。
权利要求
一种生物多肽血管支架，其特征在于，所述支架为挖槽支架，其由多组金属波杆和金属连接杆组成；所述金属波杆呈波浪形，其上挖槽，该槽中存储药物活性成分；所述金属连接杆的中部呈U形或S形，其两端分别与不同的所述金属波杆的弯曲部相连接。
2. 根据权利要求1所述的生物多肽血管支架，其特征在于，所述药物活性成分为抗 vWF相关抗体或蛋白，选自一种或多种下列抗体AJvW-2、 AJW200、82D6A3、 mAb LJ_C3、 mAb NMC-4、 mAb MR5 、 ALX-0081 、金精三羧酸、乳清酸。
3. 根据权利要求2所述的生物多肽血管支架，其特征在于，所述支架中的金属波杆表 面带槽，所述抗vWF相关抗体以物理方式上载于所述的槽中，该物理上载的方式为微量点 滴。
4. 根据权利要求l所述的生物多肽血管支架，其特征在于，所述药物活性成分 为抗vWF相关蛋白，选自 一 种或多种具有下列多肽序列的蛋白GDCFFGFLNSPWRVC、 RSSYWVYSPWRFISR、 CMTSPWRC、 CRTSPWRC、 CYRSPWRC。
5. 根据权利要求4所述的生物多肽血管支架，其特征在于，所述支架中的金属波杆表 面带槽，所述抗vWF相关蛋白以物理方式上载于所述的槽中，该物理上载的方式为微量点 滴。
全文摘要
本发明提供了一种生物多肽血管支架，其本体结构为挖槽的支架，包括多组金属波杆和金属连接杆。其中，所述金属波杆呈波浪形，其上挖槽，该槽或孔中存储药物活性成分；所述金属连接杆的中部呈U形或S形，其两端分别与两个所述金属波杆的弯曲部相连接。该生物多肽血管支架中的活性药物成分是以vWFA1/A3域为作用靶点的抗体和/或多肽，这类抗体和/或多肽以物理方式直接上载到表面刻槽的金属支架上，以保证支架植入后，所述抗体和/或多肽迅速释放到受伤血管壁处，在受伤血管部位迅速饱和，阻止裸露的胶原蛋白通过vWF对血小板激活，从而抑制血栓形成及后期的再狭窄。
文档编号A61F2/91GK101785718SQ200910045840
公开日2010年7月28日 申请日期2009年1月23日 优先权日2009年1月23日
发明者乐承筠, 胡玺 申请人:微创医疗器械(上海)有限公司