专利名称：：低分子肝素在制药中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及低分子肝素的用途，尤其涉及低分子肝素在制药领域中的应用
背景技术：
：类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,RA)是一种以关节滑膜炎症为特征的全身性慢性自身免疫性疾病，RA的发病机制至今仍不是很清楚，Trenthem首次发现50%的RA患者血清中存在有抗II型胶原(CollagentypeII，CII)的自身抗体，并根据这些发现于1977年首次建立了实验性关节炎动物模型，CII大量存在于关节软骨中，同时也存在于视网膜和玻璃体中，CII是一种与免疫系统隔绝的蛋白质，但在某些病理条件下可作为一种自身抗原呈现出来，20世纪80年代至90年代初期，国外大量重复实验并在临床表现、病理组织学、针对胶原的体液和细胞的免疫反应，以及与主要组织相容性复合物(MHC)的关系等方面进行了广泛深入的研究。随着人们对RA和CIA的深入研究，发现二者存在许多类似之处如滑膜增生、血管翳形成及随之出现的软骨及骨破坏，侵犯肢体远端关节。近年来大量研究证实激活的T淋巴细胞在CIA的病理变化中同样发挥重要作用，认为T淋巴细胞的活化及其产生的细胞因子是引起CIA免疫损伤的主要诱导因素。CIA动物的外周血中一般都可以检出高浓度自身抗体，尤其是抗CII抗体。抗CII抗体在疾病早期即可出现，并随时间的延长逐渐下降，同时可以预测疾病的转归，这些特征均与人类RA相似。因此成为目前世界上公认的人类风湿性关节炎较为理想的动物模型之一，特别是在与治疗机制及免疫反应有关的研究中，CIA模型的优点将为研究者提供极大帮助。在RA的病因学以及发病机制中重视T细胞的作用被视为是认识这种顽症的里程碑。许多RA的急性感染中T细胞的明显渗透提示其可能是主要参与者。目前较为流行的观点是RA为抗原提呈细胞(APC)和CD4+细胞互相作用的结果。APC呈现复杂的主要组织相容性复合物II类分子(MHC-II)和抗原多肽，与T细胞表面受体(TCR)结合，随之巨噬细胞等被激活并分泌前炎症细胞因子如IL-l和TNF-a等。这些细胞因子激活关节软骨周围的滑膜成纤维细胞和软骨细胞分泌降解糖蛋白和胶原的多种酶，从而导致组织破坏。现已普遍认为，巨噬细胞因子，尤其是IL-1和TNF-a是RA重要的炎症介质，在炎症的发生和发展中具有非常重要的作用；TNF-a和IL_1的抑制剂在RA治疗中取得了良好的疗效，这充分支持了细胞因子在RA中发挥着重要作用的观点。目前认为IL-1是参与RA进展期关节破坏的典型前炎症细胞因子，而TNF-a在RA的炎症反应过程中具有关键位置。目前，对于低分子肝素的研究多集中在其抗凝功能中，而在类风湿关节炎中的作用尚无报道。
发明内容为了解决现有技术中的问题，提供低分子肝素的新用途。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为一种低分子肝素在制备治疗风风湿性疾病药物中的应用。所述的风湿性疾病是类风湿性关节炎。依据上述技术方案，本发明的具体实施方法是1)胶原诱导性关节炎动物模型的建立2)确定了低分子量肝素用于体内抗炎治疗的可行性及有效剂量1.l实验分组及治疗方案1.1.1分组造模后观察单侧踝或腕关节评分达2分后依次选入NS组、肝素高剂量组、肝素低剂量组、MTX组。同时开始药物干预。记录每只大鼠干预时间。同时设有未免疫的Nai've做对照。1.1.2药物干预剂量1)MTX(lmg/只/周)腹腔注射2)肝素高剂量(H印-H)皮下注射3)肝素低剂量(H印-L)皮下注射4)NS组处理同肝素低剂量组用生理盐水代替肝素1.1.3观察指标每只大鼠分别于入组治疗后第21天处死，1)取脾细胞做增殖实验，2)取心脏血用于测定血清中的TNF-及anti-CIIantibody3)取病变肢体用于拍钼靶片及HE染色和组化分析本发明的有益效果1、本发明发掘了低分子肝素的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。2、本发明结果表明低分子肝素具有抑制类风关滑膜炎症的作用，其作用途径之一是抑制滑膜成纤维细胞与炎症细胞的黏附。这一结果为寻找生物治疗和其他小分子药物治疗靶点提供实验依据，具有临床应用价值。图1是大鼠踝关节钼靶摄片；图2是不同放大倍数的关节组织病理切片结果图片；图3是不同治疗天数关节炎症评分的改善情况比较；图4是不同治疗组间淋巴细胞增殖比值的比较；图5是各组大鼠血清抗II型胶原抗体浓度的比较。具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的低分子肝素在制药中的应用的具体实施方式做详细说明。实施例1:低分子肝素在在类风湿关节炎滑膜组织中实验材料与方法1实验材料1.1实验动物Wistar大鼠，24只，雌性，7_8周龄，体重160_180g，购买自上海生命科学院动物中心，饲养环境为上海交通大学医学院实验动物科学部SPF级动物房，大鼠自由饮水及进食，室温24士2t:，动物适应性饲养3天后进行实验。1.2主要试剂造模试剂牛II型胶原蛋白，20mgX4瓶，购自Chondrex，Inc.公司；弗式完全佐剂(CFA)，美国sigma公司；冰醋酸，北京化学试剂公司。治疗药物低分子量肝素钠注射液(clexane)，规格0.6ml:6000AxalU，购自LaboratorieAventis公司；MTX注射剂，规格5mg/支，购自浙江海正药业股份有限公司。混合淋巴细胞增殖试验试剂HEPES缓冲液，Gibco公司；胎牛血清，Gibco公司。CollagentypeII，规格lOmg/瓶，批号#，购自Chondrex,Inc.公司；3H-TdR本实验室自行配制。免疫组化试剂-SolventBlue,sigma公司。结晶紫，MEBInc;苏木素，购买自上海蓝季科技发展有限公司；伊红，购买自中国医药(集团)上海化学试剂公司。试剂盒RatTNF-aElLISA检测试剂盒，批号ffi(RC3011，购自Invitrogen公司；大鼠抗II型胶原IgG抗体ELISA分析盒，批号#2042，购自Chondrex,Inc.公司；1.3实验仪器高速台式离心机，Eppendorf高速立式低温离心机，HITACHI湿度C02培养箱，Heraus电子游标卡尺，切片机，Leica包埋仪，Leica倒置相差纤维镜，日本OlympusCK2型低温离心机，HeraeusAxioplan2多功能全自动荧光显微镜，ZEISS公司AxioCam数码相机，ZEISS公司超净台，上海瑞仰净化装备有限公司酶标仪，液体闪烁仪2实验方法2.1胶原诱导性关节炎动物模型的建立2.1.1牛II型胶原的乳化1)配制乙酸溶液溶解无水冰醋酸于灭菌用水，配制0.05mol/L的乙酸。2)配制胶原溶液溶解牛II型胶原于0.05mol/L的乙酸溶液中，胶原终浓度为4mg/ml。3)乳化胶原将完全弗氏佐剂(CFA)与4mg/ml的胶原乳液等体积混合，采用注射器法，反复推拉，注意冰上操作，即为胶原乳剂，终浓度为2mg/ml。2.1.2免疫方法每只大鼠尾根部皮内注射和背部皮内注射0.1ml胶原乳剂，(含胶原200g/只)，初次致敏后7天按照同样的方法加强免疫一次，用量为初次免疫的一半。2.2药物对动物模型的干预动物分组造模成功后将大鼠随机分为MTX组，低分子量肝素高剂量组，低分子量肝素低剂量组，注射用水组，每组6只。给药情况MTX组剂量lmg/只，腹腔注射，每周1次；低分子量肝素高剂量组，低分子量肝素低剂量组，低分子量肝素微剂量组，剂量分别为0.24ml:100-120U/只，O.24ml:40-100U/只，O.24ml:20_40U/只皮下注射，每天1次；注射用水组剂量为0.24ml/只，皮下注射，每天1次；各组给药21天后采集血清、下肢踝关节、脾脏；治疗期间每日测量体重变化和后肢踝关节肿胀直径和周径。关节肿胀评分采用关节炎评分法(04级)。0分无关节炎；1分有红色斑点或轻度肿胀；2分关节部位中度肿胀；3分严重肿胀；4分严重肿胀且不能负重。关节摄片治疗21天后拍摄双侧后肢钼钯片。踝关节组织石蜡切片免疫后21天脱颈椎处死大鼠，取双下肢踝关节置于10%中性福尔马林溶液中固定7天，用10%EDTA脱钙液脱钙30天，用大头针检测脱钙满意后，流水冲洗23小时，将关节纵向剖开，脱水，透明，浸蜡，包埋。固定石蜡作5ym切片。HE染色过程如下1)切片脱蜡至水化二甲苯I2-5min—二甲苯II2_5min—无水乙醇lmin—95%乙醇lmin—85%乙醇lmin—75%乙醇lmin—蒸馏水洗2min2)染色苏木素染色5min—蒸馏水洗lmin—75%盐酸乙醇分化30s—蒸馏水洗lmin—95%乙醇lmin—伊红乙醇液染色l_2min3)脱水、透明、封固95%乙醇1lmin—95%乙醇IIlmin—无7JC乙醇Illmin—无7JC乙醇Ilmin—二甲苯透明一石炭酸液lmin—二甲苯Ilmin—二甲苯IIlmin—中性树胶盖玻片封固一显微镜观察2.3大鼠脾脏混合淋巴细胞细胞反应试验1)麻醉取2%戊巴比妥钠0.35ml腹腔注射2)75%酒精浸泡大鼠5min.无菌操作取脾，放入盛有NS的试管中。3)研磨脾脏，滤膜过滤，4)1500rpm离心5min5)取沉淀加RBC裂解液各3ml裂解2min，6)1500rpm离心10min7)用洗液重悬洗涤2次，8)加入1640培养液各10ml，稀释10倍后计数单个核细胞数。9)调整细胞密度为1X106个/ml，接种于圆底96孔板(0.lml细胞悬液/孔)，剌激48小时后，10)加入3H-TdR各10ul，孵育16h11)收板，液体闪烁仪检测。62.4大鼠血清TNF-a浓度测定1)麻醉取2%戊巴比妥钠0.35ml腹腔注射2)心脏采血胸骨左缘第3-4肋间垂直进入心脏，取血3-5ml3)37。C静置lh，血凝固后4)2000rpm/min离心15min5)取上清，每个标本分装4管，-S(TC冻存待测6)每孑L力口人50ulIncubationBuffer鹏育7)力口lOOulStandardDiluentBuffer于0孑L8)加lOOul标准样品或待测样品或对照样品，轻轻敲打混匀9)加50ulbiotinConjugate液，轻轻敲打混匀，封孔室温静置1.5h10)260ulwashbuffer洗板4次，每次30s11)力QlOOul/孑LStr印tavidin-HRP工作液12)盖板，室温孵育45min13)洗板同步骤914)力口lOOul/孑LStabilizedChromogen，液体变蓝15)室温，避光孵育30min16)加lOOul/孔StopSolution,轻轻敲打混匀，液体由蓝变棕17)上机检测吸光度，波长450nm。2.5大鼠血清抗II型胶原抗体测定1)按照ELISA试剂盒说明书进行，取出8X8孔/stripe，待用。2)加lOOulBlockingBuffer,室温孵育lh3)准备标准溶液取出250ulX16U/ml加入250ul样品稀释液里制备8U/ml的标准样品，重复此步骤获得4、2、1、0.5、0.25U/ml浓度的标准品。4)准备样品溶液按照1:50000的比例稀释血清，采用1:100(10ul/1000ul)、1:20(50ul/1000ul)、l:25(10ul/250ul)三次稀释的方式，将血清的稀释50000倍共lml。5)稀释洗液将50mlX(20X的洗液)溶到1L的灭菌水，得到IX的洗液。6)加260ul/孔洗液洗涤4次。7)加lOOul样品(包括标准品和待测样品)，盖膜密封，4度冰箱过夜。8)加260ul洗液洗涤4次。9)加二抗溶解二抗到10ml二抗稀释液，加lOOul/孔二抗溶液，室温，孵育2小时。10)加260ul洗液洗涤4次。ll)OPD，溶解OPD到OPD稀释液中，加lOOulOPD溶液，室温孵育30分钟12)力口50ulStopSolution13)上机读板，波长490nm或630nm。2.6数据的统计学处理试验结果应用SPSS13.0及Graphpad软件进行分析，计量资料组间比较应用单因素方差分析(one-wayANOVA)或单样本t检验，检验水准a=0.05(双侧)，P值小于0.057认为有显著性差异，<0.01认为有非常显著性差异。3、实验结果l形态学变化1.1钼靶片结果大鼠踝关节钼靶摄片结果(图1)可见Nai've组大鼠踝关节及距下关节关节面平整，关节间隙正常，关节周围骨质正常；Model组大鼠踝关节周围肿胀，关节面破坏，距骨轮廓基本消失，关节间隙软组织填充增大，关节周围骨质肥大疏松；MTX组大鼠踝关节关节面基本平整，关节间隙轻度狭窄，关节周围骨质基本正常；H印-L组大鼠踝关节间隙轻度减小，关节面欠平整，接近与MTX组；H印-H组大鼠踝关节肿胀，破坏，距骨轮廓模糊，侵蚀严重，关节周围骨质疏松。由此可见低剂量肝素可缓解关节破坏，防止关节畸形发生。1.2.3石蜡病理切片HE染色结果及CYR61组化结果踝关节HE染色作病理切片(图2)显示NaYve组关节面平整，无滑膜增生；Model组关节面严重破坏，大量滑膜增生，大面积关节软骨及软骨下骨侵蚀破坏，肉芽组织填充；MTX组关节面基本保持平整，关节边缘可见少量滑膜增生，局部少量关节软骨及软骨下骨破坏；H印-L组关节面基本平整，关节周缘少量滑膜增生，伸向关节间隙；H印-H组关节面破坏严重，关节腔内可见大量滑膜增生，破坏软骨面及软骨下骨，并伴局部大量红细胞。CYR61组化分析结果显示正常大鼠关节中CYR61表达水平较低，而在病变的关节中CYR61主要表达于增生的肉芽组织中，以侵蚀到软骨及软骨下骨的增生滑膜最为显著。2.1关节肿胀评分结果模型组大鼠关节大约在首次免疫后20天左右(入组治疗6天左右)达到急性炎症期，表现为踝关节明显红肿，活动受限。经低剂量肝素治疗后关节红肿有所减轻，其疗效与MTX组相近，关节炎症评分明显低于生理盐水组，于治疗第11天效果最为显著(P<0.05)。高剂量肝素处理组则与生理盐水组无显著差异(表1、图3)。表l.各组大鼠后肢肿胀程度评分结果(;；士S7;)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*:同时间点与模型组比较差异有统计学意义。△:同组与初始比较差异有统计学意义。3、淋巴细胞转化实验在入组治疗第21天分离大鼠脾细胞，用20Ug/mlII型胶原剌激后观察各组细胞对胶原剌激的增殖能力的不同。结果可见未免疫Naive组脾细胞在胶原剌激后没有明显增殖倾向，而模型组大鼠脾细胞经胶原剌激后其增殖明显，与Naive组相比较P<0.001;同时还发现低分子量肝素低剂量治疗组的脾细胞对胶原剌激作用明显受抑制，与模型组相比较P<0.001，其抑制作用与MTX组相近，肝素低剂量组作用比较显著(图4)。1.2.5血清抗II型胶原抗体检测入组治疗第21天各治疗组间血清中anti-II型胶原抗体的水平。结果可见未免疫正常大鼠血清中未测到抗体；而模型组血清中anti-II型胶原抗体的水平明显升高，与Naive组相比较P〈0.001;同时还发现低分子量肝素低剂量治疗组血清中anti-II型胶原抗体的水平明显降低，与模型组相比较P<0.05，MTX组治疗组anti-II型胶原抗体的水平也降低，肝素低剂量组作用比较显著(图5)。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。权利要求一种低分子肝素在制备治疗胶原诱导性关节炎药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的关节炎是类风湿性关节炎。全文摘要本发明公开了一种低分子肝素在制备治疗胶原诱导性关节炎药物中的应用，本发明采取的技术方案是一种低分子肝素在制备治疗风湿性疾病药物中的应用，所述的风湿性疾病是类风湿性关节炎。本发明优点在于本发明发掘了低分子肝素的医疗用途，开拓了一个新的应用领域，本发明结果表明低分子肝素具有抑制类风关滑膜炎症的作用，其作用途径之一是抑制滑膜成纤维细胞与炎症细胞的黏附。这一结果为寻找生物治疗和其他小分子药物治疗靶点提供实验依据，具有临床应用价值。文档编号A61K31/727GK101780101SQ20091004546公开日2010年7月21日申请日期2009年1月16日优先权日2009年1月16日发明者何勇,李宁丽,欧阳桂林,肖涟波申请人:上海市长宁区光华中西医结合医院