金铁锁悬浮细胞培养体系及其建立方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物细胞工程技术领域，尤其涉及金铁锁毛状根高效诱导及基于此的 细胞悬浮培养体系的建立应用方法。
【背景技术】
[0002] 金铁锁（Psammosilene tunicoides W. C. Wu et C. Y. Wu)为石竹科金铁锁属多年 生草本植物，又名独丁子、小霸王、昆明沙参、金丝矮陀陀、土人参等，是我国西南部特有的 单属种药用植物。金铁锁主要以根入药，主要药用成分为三萜、三萜皂苷、环肽和内酰胺等， 药理研宄发现金铁锁提取物主要有镇痛抗炎、散瘀止血、抗肿瘤、免疫调节、抑菌等作用，用 于跌打损伤、风湿痛、胃气痛、创伤出血等的治疗，是多种知名中成药的主要成份之一，如云 南白药系列、百宝丹系列、云南红药胶囊、贵州金骨莲胶囊、福建痛血康胶囊等，具有很大的 经济价值和社会效益。
[0003] 近年来金铁锁的药用需求量不断增加，其野生资源连年过采、私采严重。由于森林 砍伐、植被石漠化、土层流失等原因，金铁锁生态环境也受到严重破坏。再加上自然气候影 响及金铁锁本身自然繁殖力差等诸多因素，造成金铁锁野生资源数量急剧下降，已作为稀 有濒危物种列入《中国植物红皮书》中，属国家二级保护植物。由于金铁锁药材主要靠采收 野生资源，收获周期较长，受病虫害、气候等外部因素影响大，造成供应量不易控制等实际 问题。因此寻求新的替代品或新技术以满足市场需求和解决物种保护问题迫在眉睫。
[0004] 综合考虑，采用生物技术方法是解决这一问题最为有效的途径。一方面可以缓解 植物资源的匮乏，保护珍贵的野生植物资源，避免掠夺性开发；另一方面通过规模化的细胞 培养技术可以定向调节细胞的次生代谢产物，使植物细胞定向合成有效的物质，以提高、调 控中药材有效成分含量，提高它的药用价值和疗效，降低中药材生产的经济成本。尽管如 此，通过细胞培养等手段实现商业化生产的植物种类有限，主要原因是遗传和药用成分生 物合成的稳定性差以及单位时间内生物量小等，因此，筛选优质高产细胞株是解决上述瓶 颈问题的关键技术环节。
[0005] 毛状根是发根农杆菌侵染植物细胞导致的特殊不定根，具有遗传稳定、激素自养、 生长速度快和次级代谢强等优点，毛状根作为一种转基因器官，一种新的药用原料，日益受 到国内外研宄者的关注。试验表明，利用毛状根作为外植体诱导的愈伤组织，也保持毛状根 生长速度快、遗传稳定的优点，与普通金铁锁愈伤组织相比，固体培养条件下较短时间内能 够获得较大的细胞产量，同时皂苷含量也较高。但是在毛状根制备与液体培养过程中存在 的突出问题：（1)毛状根诱导率低，20%左右，这是由于植物细胞与发根农杆菌互作过程中 固有的特性决定的；（2)液体培养过程中成团性，使内部组织缺氧和养分，逐渐衰老甚至死 亡，导致产量降低。另一方面，在以毛状根为原料的金铁锁悬浮细胞制备与培养尝试中，也 屡次失败，分析其原因，可能与金铁锁固有的生长习性相关。因此，需要进一步考察分析，以 寻找合适的金铁锁悬浮培养体系的建立、培养及应用的方法。以解决金铁锁自然资源缺乏 和市场产品紧缺的问题。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一在于提供一种金铁锁悬浮细胞培养体系的建立方法，所述建立 方法使用金铁索毛状根为外植体诱导愈伤组织并建立悬浮细胞培养体系。
[0007] 优选的技术方案中，上述建立方法中，所述的愈伤组织经10~12mmol/L草酸钙水 溶液浸泡预处理后用于建立悬浮细胞培养体系。
[0008] 更为具体的技术方案，所述的金铁锁悬浮细胞培养体系的建立方法包括如下步 骤：
[0009] (1)以金铁锁毛状根为外植体诱导愈伤组织；
[0010] (2)使用10~12mmol/L草酸钙水溶液浸泡愈伤组织20~40min ;
[0011] (3)步骤⑵处理后的愈伤组织按照4~6% (g(FW)/ml)的接种量接种至悬 浮培养基中，25±1 °C、110±5r. mirT1摇床上暗培养；所述的悬浮培养基是mMS+1. 5mg/ L2, 4-D+O. 5mg/L 6-BA+O. 25mg/L NAA+0. lmg/L KT+30g 蔗糖 /L ;
[0012] 其中，mMS培养基是在MS培养基的基础上添加KC1，使钾离子浓度达到50mmol/L 而得。
[0013] 其中，所述的步骤（1)，以金铁锁毛状根为外植体诱导愈伤组织，包括如下步骤：
[0014] (a)愈伤诱导：选取金铁锁毛状根，剪切成小段接种于添加有1.0mg/L 2, 4-D+l. Omg/L 6-BA+2. Omg/L NAA+30g/L蔗糖的MS固体培养基上，置于25± 1°C的暗室培 养3~4周；
[0015] (b)继代培养：将步骤（a)诱导出的愈伤组织与外植体分离，将分离出的愈伤组织 接种于添加有 〇.5mg/L 2,4-D+l.Omg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.2mg/L KT+30g/L 蔗糖的 MS 培养基上，于25 ±1°C条件下暗培养，继代周期25 ± 2d ;
[0016] (c)经过5次以上继代培养，选取合适的愈伤组织作为建立悬浮细胞培养体系的 材料。
[0017] 上述本发明的金铁锁悬浮细胞培养体系的建立方法中述及使用金铁锁毛状根为 外植体，具体的技术方案中，所述的金铁锁毛状根通过下述方法制备：
[0018] (a)取金铁锁无菌苗叶片，去除叶缘周围组织但保留叶柄，用灭菌的10~15_〇1/ L的CuCl 2水溶液浸泡外植体10~15min后，用无菌滤纸吸干外植体表面水分；
[0019] (b)发根农杆菌ACCC10060菌液接种于YEB固体培养基中，25°C ± 1下暗培养2~ 3d获得发根农杆菌ACCC10060克隆菌体；挑取发根农杆菌ACCC10060克隆菌体，接种于YEB 培养基中，25°C ± 1振荡培养；取1体积份0D值为0. 6~0. 8的菌液置于100体积份YEB 液体培养基中振荡培养至0D值为0. 6时收集菌液，3500rpm下离心10分钟收集菌体；
[0020] (C)所得菌体均匀混入至100体积份含100umol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基， 并将金铁锁外植体浸染于上述培养基中10~15分钟，取出清洁表面后，将所得的发根农杆 菌浸染的外植体接入共培养基中，于26±1°C条件下暗培养24h ;
[0021] 所述的共培养基是含100umol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基；
[0022] (d)步骤（c)的培养物转入抑菌继代培养基，3~6d继代培养一次，直至将菌除 净；
[0023] 所述的抑菌继代培养基是含有500mg/L头孢噻肟钠的无激素1/2MS固体培养基；
[0024] 所述的抑菌继代培养是：26±1°C条件下，静置暗培养；
[0025] (e)步骤（d)的培养物接入无激素1/2MS液体基本培养基进行暗黑悬浮振荡培养， 振荡摇床转速为110~120r ? mirT1。
[0026] 本发明的目的之二在于提供一种金铁锁悬浮细胞培养体系，所述细胞培养体系通 过上文所述的金铁锁悬浮细胞培养体系的建立方法制备。
[0027] 作为优选的具体技术方案，本发明进一步提供一种金铁锁悬浮细胞培养体系，通 过下述方法制备：
[0028] ①取金铁锁无菌苗叶片，去除叶缘周围组织但保留叶柄，用灭菌的10~15mmol/L 的CuCl 2水溶液浸泡外植体10~15min后，用无菌滤纸吸干外植体表面水分；
[0029] ②发根农杆菌ACCC10060菌液接种于YEB固体培养基中，25°C±1下暗培养2~ 3d获得发根农杆菌ACCC10060克隆菌体；挑取发根农杆菌ACCC10060克隆菌体，接种于YEB 培养基中，25°C±1振荡培养；取1体积份OD值为0. 6~0. 8的菌液置于100体积份YEB 液体培养基中振荡培养至OD值为0. 6时收集菌液，3500rpm下离心10分钟收集菌体；
[0030] ③所得菌体均匀混入至100体积份含100umol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基，并 将金铁锁外植体浸染于上述培养基中10~15分钟，取出清洁表面后，将所得的发根农杆菌 浸染的外植体接入共培养基中，于26±1°C条件下暗培养24h;
[0031] 所述的共培养基是含100umol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基；
[0032] ④上一步骤的培养物转入抑菌继代培养基，3~6d继代培养一次，直至将菌除净；
[0033] 所述的抑菌继代培养基是含有500mg/L头孢噻肟钠的无激素1/2MS固体培养基；
[0034] 所述的抑菌继代培养是：26±1°C条件下，静置暗培养；
[0035] ⑤上一步骤的培养物接入无激素1/2MS液体基本培养基进行暗黑悬浮振荡培养， 振荡摇床转速为110~120r ?mirT1;培养3~5天产生发根，继续培养至毛状根稳定生长；
[0036] ⑥愈伤诱导：选取上一步骤的金铁锁毛状根，剪切成小段接种于添加有l.Omg/ L2,4-D+l.0mg/L 6-BA+2. 0mg/L NAA+30g/L 蔗糖的 MS 固体培养基上，置于 25±1°C 的暗室 培养3~4周；
[0037] ⑦继代培养：将上一步骤诱导出的愈伤组织与外植体分离，将分离出的愈伤组织 接种于添加有〇.5mg/L 2,4-D+l.Omg/L 6