金铁锁带腋芽嫩茎无性快速繁殖技术方法
【专利摘要】一种金铁锁带腋芽嫩茎快速繁殖无菌种苗的技术方法，剪取金铁锁带腋芽嫩茎作为外植体，利用外植体诱导愈伤组织，利用愈伤组织分化出无菌金铁锁种苗，对不同植物生长调节剂种类、浓度、搭配比例进行优化选择，不同天然植物添加剂的应用，对金铁锁诱导及成苗效果的影响，筛选出各个时期金铁锁最佳的生长调节剂和添加物附加的搭配配方，从而建立金铁锁利用嫩茎进行无性快繁体系。通过无性繁殖获得的无菌苗，能最大限度保持母株优良的遗传性状，提供性无菌种苗。对于保护野生金铁锁免遭灭绝性采挖。极大的提高了金铁锁种苗的繁殖系数，对濒危植物金铁锁的保护以及生物多样性的恢复和保护具有重要意义。
【专利说明】金铁锁带腋芽嫩茎无性快速繁殖技术方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物无性繁殖【技术领域】，尤其属于植物中药金铁锁带腋芽嫩茎无性快速繁殖技术方法。
【背景技术】
[0002]金铁锁为石竹科金铁锁属植物金铁锁iPsammosilene tunicoides ff.C.ffu et C.Y.Wu),又名独定子、昆明沙参、蜈蚣七、对叶七等，主要分布于云南、四川、贵州和西藏部分地区。为中国特有的单种属植物，是研究石竹科植物系统分类和进化及其重要的材料。民间用药历史较为悠久，首载于《滇南本草》，而后收载于1977年版《中华人民共和国药典》，具散瘀、消肿、排脓、止血等功效，主治风湿疼痛、跌打损伤、创面出血、消肿排脓等，现为云南白药、贵州太极等制药企业常用原材料。随着市场需求的扩大，金铁锁野生资源遭遇了前所未有的破坏，过渡的采挖导致了野生资源的濒危，在《中国植物红皮书》中已被列为国家二级保护植物。
[0003]金铁锁种子成熟期极度不一致，通常为先期开花的种子已经成熟，后期的仍然处于花苞状态，导致集中采种较为困难，同时成熟种子无后熟作用，条件适宜即可萌芽，导致金铁锁利用种子繁殖一致性不佳。据相关文献报道，金铁锁种子在人工条件下萌发率仅为37%-56%，这一较低水平的萌芽率对金铁锁规模化种植具有极大抑制作用。随着价格的连年翻番，金铁锁近年来遭遇过渡采挖，现野外已难觅金铁锁集中分布地，仅有部分地区残存零星分布。为了更好的利用这一珍稀中药资源，做到保护与开发并举，研究中利用组织培养方式对金铁锁资源进行高效快速繁殖，以期在短期内获得一致性好，脱毒的金铁锁种苗。经查阅文献，目前已有相关科研人员对金铁锁利用发根农杆菌进行根诱导、有机成分、入血成分研究，对金铁锁快速繁殖亦有部分相应的研究。但尚未见完整的组培快繁体系报道，为了完善金铁锁组培快繁体系的构建，研究中首次提出利用人工重新促使金铁锁根萌芽。利用带叶嫩茎为外植体进行快速繁殖，有效遏制了直接利用野生茎段作为外植体所带来的内生菌污染严重的问题。目前尚未见关于金铁锁利用带叶嫩茎进行快繁的报道，本发明具有一定的创新性和新颖性。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是建立一套金铁锁利用带叶嫩茎快速繁殖技术，从而构建了不依靠单纯的种子繁殖进行扩大化栽培的传统种植模式，利用组培技术繁殖出的种苗最大限度的保持了母本的特性，同时可在短期内获得大量性状一致，脱毒的金铁锁组培苗，为野生金铁锁资源的保护、群落的恢复和合理开发利用提供了一种新的技术支撑。
[0005]本发明可通过以下技术方案实现:
1)外植体培育收集野生金铁锁资源，最大程度保留须根，离芦头f 2cm处，用利刃去除全部老枝叶，种植于营养袋中，种植基质以红壤土为佳，视土壤含水量浇水，置于向阳通风处，约20d左右，待新长出匍匐茎为3lcm长且未现花蕾时，用不锈钢刀片截取新长出嫩茎第一对叶片以上茎段，作为外植体材料来源，外植体采集宜于在晴天的上午进行。
[0006]2)无菌苗获取
[9]获取的外植体材料，用软毛刷轻轻去除附着于叶片及茎段上的泥，置于洗净的烧杯中，滴入3滴普通洗洁精，1滴吐温20，盖上纱布并绑扎好，置于自来水下流水冲洗2h ;冲洗后的材料于超净工作台上，先用75%酒精浸泡20s，而后直接将外植体投入0.1%升汞中消毒6min，无菌水冲洗5次，每次不少于3min，材料上残留的水分用无菌滤纸吸干；接种前去掉切口处0.5cm茎段及叶尖，每对叶片截成一段，完整保留叶片及腋芽，接种于过渡培养基上；培养室温度18?23°C，湿度50?70%，光照强度22001x，每天光照时间12h，10d后把未发生污染、褐化、黄化的材料转入诱导培养基。
[0007]3)愈伤组织诱导
挑选无菌、切口处发白或膨大、腋芽萌出的材料，转入愈伤组织诱导培养基，接种时轻压外植体材料以使材料与培养基充分接触；培养室温度2(T25°C，湿度5(Γ70%，光照强度22001χ，每天光照时间12h，10d后可见紫色或米白色疏松愈伤组织长出，待愈伤组织长到lcm左右宽时，转入丛生芽诱导培养基培养。
[0008]4)丛生芽诱导与增殖
将疏松、长势良好的愈伤组织转接于分化培养基上，轻轻摇动培养液以使营养液充分浸润愈伤组织，培养室温度2(T25°C，湿度5(Γ70%，光照强度22001χ，每天光照时间12h，培养20d后，可见含水量较高的丛生芽大量长出，继续培养15d，可得分化良好，长势旺盛的丛生苗。
[0009]5)壮苗培养
截取高:T5cm，叶3飞对的丛生苗，接种于壮苗培养基上，培养室温度18?23 °C，湿度5(Γ70%，光照强度22001χ，每天光照时间12h，培养10d后可得健壮的金铁锁无菌苗。
[0010]本发明为了更好的观察金铁锁生长情况，采用脱脂棉作为支撑介质，增加培养基的流动，同时可适时倾斜培养瓶以达到调整培养基与金铁锁的接触面积。
[0011]本发明在接种操作过程中，需要先将金铁锁接种材料于含培养基的倾斜培养瓶中浸润，有效避免了接种材料过大或形状不规则导致的与培养基接触不充分的弊端。
[0012]本发明的技术方案，相对于利用传统种子播种进行繁殖的方法，具有以下效益:繁殖速度快，从外植体到成苗只需3个半月；繁殖系数高，种苗成指数增长；不受外界环境影响，一年四节均可进行种苗繁育；种苗一致性好，分离情况发生较少；种苗全部为脱毒苗，有利于高产，少病虫害；投资少，经济效益高，可规模化种植，解决种苗来源这一瓶颈，组培苗的野生环境栽培有利于野生居群的恢复，同时可遏制野生资源的掠夺性采挖，产生良好的经济、社会和生态效益。
【具体实施方式】
[0013]实施例1
带土采挖野生金铁锁资源，离芦头f 2cm处，用利刃去除全部老枝叶，种植于营养袋中，适时浇水，置于向阳通风处，待新长出匍匐茎为3?8cm长且未现花蕾时，于晴天上午用不锈钢刀片截取新长出嫩茎第一对叶片以上茎段，作为外植体材料来源，用软毛刷轻轻去除附着于叶片及茎段上的泥，置于洗净的烧杯中，滴入3滴普通洗洁精，1滴吐温20，盖上纱布并绑扎好，置于自来水下流水冲洗2h而后带瓶置于超净工作台上，用75%酒精浸润20s，0.1%升汞消毒6min，无菌水浸泡洗5次，每次3min，吸干材料上残留的水分；接种前去掉切口处0.5cm茎段及叶尖，每对叶片截成一段，完整保留叶片及腋芽，接种于过渡培养基上；培养室温度18?23°C，湿度5(Γ70%，光照强度22001χ，每天光照时间12h，10d后把未发生污染、褐化、黄化的材料转入诱导培养基。转接时轻压外植体材料以使材料与培养基充分接触；培养室温度2(T25°C，湿度50?70%，光照强度22001x，每天光照时间12h，10d后可见紫色或米白色疏松愈伤组织长出，待愈伤组织长到lcm左右宽时，将疏松、长势良好的愈伤组织转入丛生芽诱导培养基培养，培养室温度2(T25°C，湿度5(Γ70%，光照强度22001χ，每天光照时间12h，培养20d后，可见含水量较高的丛生芽大量长出，继续培养15d，可得分化良好，长势旺盛的丛生苗，截取高3?5cm，叶3飞对的丛生苗，接种于壮苗培养基上，培养室温度18?23°C，湿度5(Γ70%，光照强度22001χ，每天光照时间12h，培养10d后可得健壮的金铁锁无菌苗。
[0014]方案所使用培养基为:
外植体培育:红壤原生土。
[0015]无菌苗获取的培养基(以1L计):
MS (无肌醇)+1.5g 活性炭 +6.2g 琼脂 +0.05?0.3mg/L ΝΑΑ+0.05?2.0mg/L 6-BA。
[0016]愈伤组织诱导(以1L计):
MS+25g 蔗糖 +1.0g 活性炭 + 脱脂棉 +0.05?0.5mg/L ΝΑΑ+0.θΓθ.2mg/L TDZ+0.05?0.5mg/L ΚΙ。
[0017]丛生芽诱导与增殖的培养基(以1L计):
MS+25g 蔗糖 +1.0g 活性炭 + 脱脂棉 +0.05?0.3mg/L ΝΑΑ+0.θΓθ.lmg/L TDZ+0.05?0.5mg/L KTo
[0018]壮苗培养的培养基(以1L计):
MS+25g 蔗糖 +1.0g 活性炭 + 脱脂棉 +0.05?0.lmg/L ΝΑΑ+0.05?2.0mg/L IBA。
【权利要求】
1.一种金铁锁带腋芽嫩茎无性快速繁殖技术方法，其特征在于:该方法的主要步骤: 1)外植体培育:采挖野生金铁锁，保留须根，离芦头l-2cm处，剪去全部老枝叶，种植于红壤原生土为基质的营养袋中，适时浇水保持土壤湿润，置于向阳通风处，20d左右，待新长出匍匐茎为3-8cm长且未现花蕾时，用不锈钢刀片截取新长出嫩茎第一对叶片以上茎段，作为外植体材料来源； 2)无菌苗获取:截取的外植体材料，用毛刷刷去附着于叶片及茎段上的泥，置于洗净的烧杯中，滴入3滴普通洗洁精，I滴吐温20，盖上纱布并绑扎好，置于自来水下流水冲洗2h ;冲洗后的材料于超净工作台上，先用75%酒精浸泡20s，而后直接将外植体投入0.1%升汞中消毒6min，无菌水冲洗5次，每次3min，材料上残留的水分用无菌滤纸吸干；接种前去掉切口处0.5cm茎段及叶尖，每对叶片截成一段，完整保留叶片及腋芽，接种于过渡培养基上；培养室温度18?23°C，湿度50?70%，光照强度22001x，每天光照时间12h，1d后转入诱导培养基； 3)愈伤组织诱导:挑选无菌、切口处发白或膨大、腋芽萌出的材料，转入愈伤组织诱导培养基培养，接种时轻压外植体材料以使材料与培养基充分接触；培养室温度2(T25°C，湿度5(Γ70%，光照强度22001χ，每天光照时间12h，1d后可见紫色或米白色疏松愈伤组织长出，待愈伤组织长到Icm左右宽时，转入丛生芽诱导培养基培养； 4)丛生芽诱导与增殖:将疏松、长势良好的愈伤组织转接于分化培养基上，即丛生芽诱导培养基培养上；轻轻摇动培养液以使营养液充分浸润愈伤组织，培养室温度2(T25°C,湿度5(Γ70%，光照强度22001χ，每天光照时间12h，培养20d后，可见含水量较高的丛生芽大量长出，继续培养15d，可得分化良好，长势旺盛的丛生苗； 5)壮苗培养:截取高3?5cm，叶3飞对的丛生苗，接种于壮苗培养基上，培养室温度18?23°C，湿度5(Γ70%，光照强度22001χ，每天光照时间12h，培养1d后可得健壮的金铁锁无菌苗。
2.根据权利要求书I所述的一种金铁锁带腋芽嫩茎无性快速繁殖技术方法，其特征在于:步骤2)中所述过渡培养基，是以MS为基本培养基，不附加肌醇和蔗糖，添加1.5g/L 活性炭粉，6.2g/L 琼脂、0.05?0.3mg/L 的 NAA,0.05?2.0mg/L 的 6-BA，pH25 °C 时调整至5.0?6.0,高压灭菌18?20min。
3.根据权利要求书I所述的一种金铁锁带腋芽嫩茎无性快速繁殖技术方法，其特征在于:步骤3)中所述的愈伤组织诱导培养基，是以MS为基本培养基，脱脂棉为支撑介质，添加0.05?0.5mg/L 的 NAA,0.01 ?0.2mg/L 的 TDZ,0.05?0.5mg/L 的 KT、25g/L 的蔗糖、lg/L 的活性炭粉混合，pH值于25°C时调整至5.(Γ6.0，高压灭菌18?20min。
4.根据权利要求书I所述的一种金铁锁带腋芽嫩茎无性快速繁殖技术方法，其特征在于:步骤4)中丛生芽诱导培养基，以MS为基本培养基，脱脂棉为支撑介质，添加0.05?0.3mg/L 的 NAA,0.01 ?0.lmg/L 的 TDZ,0.05?0.5mg/L 的 KT、25g/L 的蔗糖、lg/L 的活性炭粉混合，pH值于25°C时调整至5.(Γ6.0,高压灭菌18?20min，接种完成时左右倾斜组培瓶以使培养液完全浸润愈伤组织。
5.根据权利要求书I所述的一种金铁锁带腋芽嫩茎无性快速繁殖技术方法，其特征在于:步骤5)中所述的壮苗培养基，以MS为基本培养基，脱脂棉为支撑介质，添加0.05?0.lmg/L的NAA,0.05?2.0mg/L的IBA、25g/L的蔗糖、lg/L的活性炭粉混合，pH值于.25°C时调整至5.(Γ6.0，高压灭菌18?20min，接种时使用少量脱脂棉压住嫩茎基部以使其能直立。
【文档编号】A01H4/00GK104255489SQ201410469073
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月16日 优先权日:2014年9月16日
【发明者】陈杰, 张翔宇, 阮培均, 李恒谦, 周茂嫦, 徐庆祝 申请人:毕节市中药研究所