人乳干细胞的获取方法及人乳干细胞库的构建方法
【专利说明】人乳干细胞的获取方法及人乳干细胞库的构建方法
[0001]本发明涉及干细胞获取方法及其干细胞库构建的方法，尤其涉及一种人乳干细胞的获取方法及人乳干细胞库的构建方法。
【背景技术】
[0002]干细胞研宄是近年来医学和生物学领域中最引人注目的热点之一。1999年，《Science》将人类胚胎干细胞研宄成果评为当年世界十大科技进展之首，2000年，《Time》周刊将其列为20世纪末世界十大科技成就之首，并认为胚胎干细胞和人类基因组将同时成为新世纪最具发展和应用前景的领域。至此干细胞研宄成为近年来生物学以及医学领域中最引人注目的热点之一。干细胞是在生物个体的生长和发育中起“主干”作用的原始细胞，具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。近几年研宄表明，成体干细胞的分化能力远超过传统观点所局限的范围。因此目前干细胞的应用已经不再局限于利用胚胎干细胞的全能性去研宄组织细胞再生，也不再局限于只用组织本身的起始干细胞做细胞治疗研宄，而是趋于寻找更多的干细胞来源，通过研宄他们的分化潜能，体外扩增能力，分化后的细胞功能以及取材是否安全方便等问题，选择最合适的干细胞来源来进行未来的细胞治疗应用。
[0003]最新研宄发现，在人类母乳中包含有丰富的干细胞，这些干细胞可以分化为身体的其他细胞，比如骨骼细胞、脂肪细胞、肝脏细胞和脑细胞等。许多研宄表明，从人类乳汁中成功提取出来的人乳干细胞与其他间充质干细胞基本类似，表达相同的表面抗原，并且能够在体外扩增，同时具有较低的免疫原性和免疫调节功能。此外，人乳干细胞来源广泛，获得方式也比较容易，安全无痛苦，且在体外培养稳定，扩增速度快，不易衰老。因此，人乳干细胞在未来细胞治疗及再生医学领域都具有重大的应用潜力。
[0004]为了便于人们有效储存和应用干细胞资源，目前在世界不同国家范围内，已经建立了多个干细胞库。所谓干细胞库是将干细胞储存于约为_196°C液氮中及搜集存放干细胞资源相关资料的场所。按所储存的干细胞来源和采集方式，干细胞库主要可分为胚胎干细胞库、成体干细胞库以及病理细胞库，成体干细胞库中包括脐血干细胞库、脂肪干细胞库、以及脐带间充质干细胞库。一个完善的干细胞库应具备随时随地将储存的健康干细胞提供临床使用的能力。目前尚无人乳干细胞库，因此，构建人乳干细胞库，将人健康的人乳干细胞通过本发明建立的系统工程技术储存建库，是将现有的资源充分利用的有效方法，为储存本人、家属和他人在需要采用人乳干细胞移植及相关技术治疗的各种疾病时，提供临床适用型人乳干细胞，具有十分广阔的应用前景。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种人乳干细胞的获取方法以及人乳干细胞库的构建方法，其具有成本低、应用前景广阔，可为临床和研宄提供大量干细胞资源的优点。
[0006]本发明提供的一种人乳干细胞库的构建方法，包括如下步骤:
I)人乳汁的采集:采集乳汁之前，采集供者的可确认身份的信息，优选需经供者签订知情同意书后，方能采集，知情同意书中通常包括供者姓名、年龄、身份证号、通讯地址、联系方式等信息。签订同意书后，对供者进行至少ABO/Rh血型检测、HLA分型的检测以及HIV、HBV, HCV的检测，然后在无菌条件下采集供者的乳汁；
2)获取和分离人乳干细胞:取出采集的乳汁，在无菌条件下加入营养液稀释2-3倍，在250-800 g下离心10-20min，去除上层的油脂和奶状液体。底层的细胞用无菌的平衡磷酸盐缓冲溶液清洗2-3次，最后用干细胞培养液重悬细胞，并接种至细胞培养装置如细胞培养皿中，在37°C，5%0)2的条件下培养，每2-3天更换新鲜的干细胞培养液，待长至80-90%时即得到原代的人乳干细胞；
3)人乳干细胞的培养:将获得的原代人乳干细胞以0.1 X 15-L O X 15个细胞/cm 2的密度接种在细胞培养装置如细胞培养皿中，当细胞长满如铺满整个平皿(10mm)后，去除如吸弃旧培养液，使用磷酸缓冲盐溶液如1mL清洗如一遍，之后用0.25%消化液(通常预热20分钟左右)如2ml消化，轻轻摇晃，直至肉眼见单层细胞呈块状脱落或在显微镜下观察细胞之间分离，立刻加细胞培养液如5ml终止消化，轻柔吹打如8-10次成单细胞；800-1000rpm离心5_6分钟，弃上清，加干细胞培养液进行轻柔吹打；之后将细胞悬液1:4传到细胞培养装置如10mm细胞培养皿中，加干细胞培养液，如每个细胞培养皿加1ml细胞培养液，正常情况下2-3天就可以长满，期间不用换液，获得更多的人乳干细胞；
4)人乳干细胞的检测与冻存:
人乳干细胞的检测:待人乳细胞长至80-90%融合时，去除旧的培养液，加入无菌的平衡磷酸盐缓冲溶液清洗，之后去除平衡磷酸盐缓冲溶液，接着加入0.25%-0.5%含EDTA的胰酶，在37°C条件下消化3-5分钟，优选在显微镜下观察细胞的消化情况，并用手轻轻的拍打培养皿，以帮助细胞脱落，待细胞全部脱落后，加入等体积的干细胞培养液，吹打均匀，以终止消化。将终止消化后的人乳干细胞悬液转移至离心管中，800-1000转/分钟离心5-6分钟，结束后去除上清，收获得到人乳干细胞。将收获的一部分人乳干细胞进行质量检测，包括无菌检测、支原体检测、细胞活性检测、分化能力检测以及流式细胞检测等，以确定细胞是否达到合格标准，其余同批次得到的人乳干细胞进行细胞冻存；
人乳干细胞的冻存:将上述获得的同批次的人乳干细胞利用人乳干细胞冻存液重悬，调整细胞密度为I X 16-1 X 17个/mL,分装入冻存容器中，封盖，并做好编号，立即进行程序式降温，之后放入到_196°C的液氮中长期保存。细胞冻存时做好所有的冻存记录，符合干细胞冷冻保存的标准，储存环境定期检测。
[0007]其中，人乳干细胞的检测与冻存同时进行，即当检测结果出来之后，细胞已经冻存，这时将检测不合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃，做好记录，之后由专门人员进行处理；
5)建库:在储存入库的容器载体上建立人乳干细胞的相关信息，将前述所采集的供者的基本信息和相应人乳干细胞制备及其细胞库构建过程的相关信息录入计算机数据库，并按检索编码调出相关记录与供者资料进行核实，纳入人乳干细胞库管理，即完成人乳干细胞库的构建。
[0008]其中，步骤2)所述的营养液是含有支持干细胞生长的糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，包括商品化的DMEM、a -MEM等；
所述的平衡磷酸盐缓冲溶液主要是含有无机盐的水溶液，可以是PBS盐缓冲溶液，D-Hanks盐缓冲溶液，SPB盐缓冲溶液等，能够维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定；
所述的干细胞培养液是含有支持干细胞生长的糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，包括商品化的DMEM、a -MEM以及自制的含10_20%的血清或无血清培养基。
[0009]步骤4)所述的干细胞冻存液是含有细胞冷冻保护剂，一般常用DMSO —类渗透性保护剂，可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤，同时也含有血清以及干细胞基本培养基，包括DMEM、a -MEM等，其中，冷冻保护剂(如DMS0)，血清和干细胞基本培养基的配比为1:2:7。
[0010]步骤4)所述的程序式降温方法，包括4°C保存40-60min，-20°C保存l_2h，-80°C过夜，最后存入到_196°C液氮，或者，也可以直接置于程序性降温盒中，放入_80°C冰箱过夜，第二天转到_196°C的液氮中。
[0011]本发明提供的一种人乳干细胞的获取方法，包括如下步骤:
1)人乳汁的采集:采集乳汁之前，采集供者的可确认身份的信息，优选需经供者签订知情同意书后，方能采集，知情同意书中通常包括供者姓名、年龄、身份证号、通讯地址、联系方式等信息。签订同意书后，对供者进行至少ABO/Rh血型检测、HLA分型的检测以及HIV、HBV, HCV的检测，然后在无菌条件下采集供者的乳汁；
2)获取和分离人乳干细胞:取出采集的乳汁，在无菌条件下加入营养液稀释如2-3倍，在250-800 g下离心10-20min，去除上层的油脂和奶状液体。底层的细胞用无菌的平衡磷酸盐缓冲溶