液清洗如2-3次，最后用干细胞培养液重悬细胞，并接种至细胞培养装置如细胞培养皿中，在37°0，5%0)2的条件下培养，每2-3天更换新鲜的干细胞培养液，待长至80-90%时即得到原代的人乳干细胞；
3)人乳干细胞的培养:将获得的原代人乳干细胞以0.1X 15-L OX 15个细胞/cm2的密度接种在细胞培养装置如细胞培养皿中，当细胞长满时，如铺满整个平皿(10mm)后，去除如吸弃旧培养液，用磷酸缓冲盐溶液如1mL清洗如一遍，之后用0.25%消化液(预热20分钟左右)如2ml消化，最好轻轻摇晃，直至肉眼见单层细胞呈块状脱落或在显微镜下观察细胞之间分离，立刻加干细胞培养液如5ml终止消化，轻柔吹打如8-10次成单细胞。800-1000rpm离心5_6分钟，弃上清，加干细胞培养液进行轻柔吹打。将细胞悬液1:4传到细胞培养装置如10mm细胞培养皿中，加干细胞培养液，如每个皿加1ml细胞培养液，正常情况下2-3天就可以长满，期间不用换液，获得更多的人乳干细胞；
4)人乳干细胞的检测与冻存:
人乳干细胞的检测:待人乳干细胞长至80-90%融合时，去除旧的培养液，加入无菌的平衡磷酸盐缓冲溶液清洗，之后去除平衡磷酸盐缓冲溶液，接着加入0.25%-0.5%含EDTA的胰酶，在37°C条件下消化3-5分钟，优选在显微镜下观察细胞的消化情况，用手轻轻的拍打培养皿，以帮助细胞脱落，待细胞全部脱落后，加入等体积的干细胞培养液，吹打均匀，以终止消化。将终止消化后的人乳干细胞悬液转移至离心管中，800-1000转/分钟离心5-6分钟，结束后去除上清。将收获的一部分人乳干细胞进行质量检测，包括无菌检测、支原体检测、细胞活性检测、分化能力检测以及流式细胞检测等，以确定细胞是否达到合格标准，其余同批次得到的人乳干细胞进行细胞冻存；
人乳干细胞的冻存:将上述获得的同批次的人乳干细胞利用人乳干细胞冻存液重悬，调整细胞密度为I X 16-1 X 17个/mL,分装入冻存容器中，封盖，并做好编号，立即进行程序式降温，之后放入到_196°C的液氮中长期保存。细胞冻存时做好所有的冻存记录，符合干细胞冷冻保存的标准，储存环境定期检测。
[0012]其中，人乳干细胞的检测与冻存同时进行，即当检测结果出来之后，细胞已经冻存，这时将检测不合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃，做好记录，之后由专门人员进行处理。上述冻存容器可以是冻存管等管状容器，也可以是其它任何合适形状和体积的容器。
[0013]其中，步骤2)所述的营养液是含有支持干细胞生长的糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，包括商品化的DMEM、a -MEM等。
[0014]所述的平衡磷酸盐缓冲溶液主要是含有无机盐的水溶液，可以是PBS盐缓冲溶液，D-Hanks盐缓冲溶液，SPB盐缓冲溶液等，能够维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定。
[0015]所述的干细胞培养液是含有支持干细胞生长的糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，包括商品化的DMEM、a -MEM以及自制的含10_20%的血清或无血清培养基。
[0016]步骤4)所述的干细胞冻存液是含有细胞冷冻保护剂，一般常用DMSO类渗透性保护剂，可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤，同时也含有血清以及干细胞基本培养基，包括DMEM、a -MEM等，其中，冷冻保护剂(如DMS0)，血清和干细胞基本培养基的配比为1:2:7。
[0017]步骤4所述的程序式降温方法，包括4°C保存40-60min，-20°C保存l_2h，-80°C过夜，最后存入到_196°C液氮，或者，也可以直接置于程序性降温盒中，放入_80°C冰箱过夜，第二天转到_196°C的液氮中。
[0018]其中，细胞培养装置除使用培养皿外，也可以其它任一常用的细胞培养装置。
[0019]与现有技术相比，本发明的有益效果如下:
第一，利用本发明获取人乳干细胞的方法，可以有效地分离、纯化、扩增人乳干细胞，解决此类资源得不到充分利用的现状，并且建立储存人乳干细胞的干细胞库，由此从干细胞库向临床及科研应用提供大量干细胞资源；
第二，本发明获取的人乳干细胞构建成的干细胞库，来源丰富，细胞获取简便，可以获得大量富有活性的人乳干细胞，并且能够进行长时间保存而不失活性，具有良好的应用前景；该库为健康的人乳干细胞，为储存者在特殊情况下需要采用干细胞移植及相关技术治疗时，提供临床适用型的人乳干细胞，并且在取得允许后，将所储存的干细胞用于其他各种干细胞制剂的生产。
[0020]当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
【附图说明】
[0021]图1是本发明实施例1人乳干细胞获取方法的步骤2)所得的原代人乳干细胞的200X倒置显微镜图；
图2是本发明实施例1人乳干细胞获取方法的步骤3)传代后所得的人乳干细胞的200X倒置显微镜图；
图3是本发明实施例1人乳干细胞获取方法的步骤4)中人乳干细胞的流式细胞鉴定图，其中，图中:A: CD105-APC; B: CD13-FITC; C: CD14_FTIC;G: CD34-PE; H: HLA-DR;1: CD90-PE。
【具体实施方式】
[0022]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0023]实施例1
本实施例中的操作均在严格无菌环境进行。
[0024]本实施例提供的一种人乳干细胞的获取方法，包括如下步骤:
(1)人乳汁的采集:采集乳汁之前，需采集供者身份信息，还可包括供者通讯信息，通常可通过经供者签订知情同意书的方式，签订知情同意书后方能采集，知情同意书中包括供者姓名、年龄、身份证明等一些基本信息；签订上述知情同意书后，对供者进行至少ABO/Rh血型的检测、HLA分型的检测以及HIV、HBV、HCV的检测，然后在无菌条件下采集供者的乳汁；
(2)获取和分离人乳干细胞:将采集的乳汁在无菌条件下加入营养液稀释2-3倍，在250-800 g下离心10-20min，去除上层的油脂和乳状液体。底层的细胞用无菌的平衡磷酸盐缓冲溶液清洗2-3次，最后用干细胞培养液重悬细胞，并接种至细胞培养皿中，在37°C、5%0)2的条件下培养，每2-3天更换新鲜的干细胞培养液，待长至密度为80-90%时即得到原代人乳干细胞，该原代人乳干细胞的显微镜图片请参见图1所示，从图1中可看出，分离出的人乳干细胞长势良好；
(3)人乳干细胞的培养:将获得的原代人乳干细胞以0.1X 15-L OX 15个细胞/cm2的密度接种在细胞培养皿中，当细胞铺满整个平皿(10mm)后，吸弃旧培养液，用1mL的平衡磷酸盐缓冲溶液洗一遍，然后用0.25%消化液(预热20分钟左右)2ml消化，轻轻摇晃，直至肉眼见单层细胞呈块状脱落(或在显微镜下观察细胞之间分离)，立刻加5ml干细胞培养液终止消化，轻柔吹打8-10次成单细胞。之后800-1000rpm离心5_6分钟，弃上清，加细胞培养液进行轻柔吹打。将细胞悬液1:4传到10mm细胞培养皿中，每个皿加1ml细胞培养液，正常情况下2-3天就可以长满，期间不用换液，获得更多的人乳干细胞，所获得的人乳干细胞的显微镜图片请参见图2，从图2中可看出，步骤3)培养的人乳干细胞长势良好；
(4)人乳干细胞的检测与冻存:
人乳干细胞的检测:待人乳细胞长至密度为80-90%融合时，去除之前的培养液，加入无菌的平衡磷酸盐缓冲溶液清洗，之后去除平衡磷酸盐缓冲溶液，接着加入0.25%-0.5%含EDTA的胰酶，在37°C条件下消化3-5分钟，然后在显微镜下观察细胞的消化情况，用手轻轻的拍打培养皿，以帮助细胞脱落，待细胞全部脱落后，加入等体积的干细胞培养液，吹打均匀，以终止消化。将终止消化后的人乳干细胞悬液转移至离心管中，800-1000转/分钟离心5-6分钟，结束后去除上清。将收获的一部分人乳干细胞进行质量检测，该质量检测包括无菌检测、支原体检测、细胞活性检测、分化能力检测以及流式细胞检测等，以确