一种利用复合菌种协同作用处理六价铬污染的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种处理重金属铬污染的方法，具体涉及一种利用复合菌种协同作用处理六价铬污染的方法，属于环境生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002]铬被广泛应用于电镀、印染、制革、冶金等行业，含铬废水和铬渣的处理不当造成的污染越来越严重，铬在自然界主要以三价铬和六价铬的形态存在，三价铬不易溶于水，与土壤等介质的结合力强，流动性差，毒性较小，而六价铬迀移性强，具有较高的生物毒性，能引起畸变和癌症，损伤内脏器官，是对人体有较大危害的工业污染物。
[0003]目前治理含铬废水的方法主要有化学还原法、化学沉淀法、电化学沉淀法、萃取、反渗透、电渗析、液膜法等物理化学方法以及生物絮凝法、生物还原法、生物吸附法等生物学方法。物理化学方法存在有投资较大、运行维护成本较高、处理后的水质很难达到回用标准并且存在二次污染的可能；而生物法处理铬污染废水主要是通过生物还原和生物吸附作用，所具有的投资少，运行费用低，原料廉价，除铬效果好，无二次污染等优点，使该法具有广阔的发展前景。生物还原类型可分为:1.微生物以Cr6+作为呼吸链的最终电子受体被还原；2.微生物体内代谢过程中产生的可溶性酶将六价铬还原成三价铬；3.微生物代谢过程中产生的还原性次级代谢产物还原六价铬。生物吸附是利用微生物的细胞壁、细胞膜等结构的构成组分所含有的羧基、羟基、巯基等官能团的活性化学作用吸附六价铬，目前已经有大量的微生物被证实能够在好氧或者厌氧环境下能够还原六价络，如Arthrobacter sp.，Bacillus sp., Providencia sp., Microbacterium sp., Serratia sp.等。但目前该方法的研宄主要局限于单一菌株或菌群，由于纯培养自身的条件较为苛刻，菌种培养周期长、费用高，限制了其应用。
[0004]中国发明“一种用于铅铬污染修复的芽孢杆菌CP-1及其应用”，申请号201410807594.7 ;中国发明“铬污染土壤复合微生物修复剂及其制备方法和应用”，申请号201410681388.6 ;中国发明“一种碱性铬污染土壤的微生物修复方法”，申请号201210355258.4 ;中国发明“一株能生物修复重金属污染土壤的菌株及生物修复方法”，申请号201110050792.X，公开的都是采用单一菌株生物修复铬污染的方法。
[0005]因此通过筛选除铬菌株的驯化、分离、纯化、复合培养等技术手段，培养制备协同作用的复合菌剂，提高微生物对处理废水进水水质的耐受能力、降低处理成本，对生物处理法的实际应用有重要意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有技术物理化学方法以及单一微生物治理六价铬污染的不足，提供一种利用复合菌种协同作用处理六价铬污染的方法。复合菌种从同一土壤环境中筛选得到，菌种之间无拮抗作用，利用地霉菌生长代谢的适宜PH偏酸，芽孢杆菌的适宜PH偏碱的特性，将两株菌种单独培养分别得到单一菌液，再将菌液(体积比1:1)接种于同一污染水体中混合培养用于处理六价铬污染，使混合菌能够处理酸性和碱性废水，扩大菌剂对进水酸碱度的适应范围，酸性进水时，芽孢杆菌优先大量繁殖，代谢产物积累，溶液pH降低，为地霉菌生长创造条件，地霉菌开始大量繁殖，生物量的增加使六价铬含量及有机物含量快速降低，水质得到净化，而碱性进水时适宜地霉菌生长，地霉菌短时间内大量增殖还原、吸附六价铬，消耗有机质，水质得到净化。
[0007]为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:
一种利用复合菌种协同作用处理六价铬污染的方法，驯化筛选步骤:
(1)取铬污染土壤样品10g加入到100 ml牛肉膏蛋白胨液态培养基中，30°C培养24h，摇床转速为120 rpm ；
(2)取步骤(I)培养液Iml转移进100 ml无机盐液态培养基，培养基中含六价铬20mg/L，六价铬以重铬酸钾配制，30°C培养24 h，摇床转速为120 rpm ；
(3)取步骤(2)培养液Iml转移至100 ml无机盐液态培养基，培养基中含六价铬30mg/L，六价铬以重铬酸钾配制，30 °C培养24 h，摇床转速为120 rpm，以此类推其余条件不变以10 mg/L的增量，逐步增加六价铬的含量，直至六价铬浓度达到50 mg/L，培养24 h后得到驯化菌液；
(4)取驯化菌液Iml转移至9 ml无菌生理盐水中，稀释10倍，菌液依次梯度稀释至菌液浓度为10_7;
(5)从10_6、10_7g两个稀释组中分别取0.1 ml涂布在牛肉膏蛋白胨固体培养基上，培养箱中30°C培养24 h ；
(6)从上述步骤中分别挑取单菌落，平板划线纯化，得到一株芽孢杆菌Bacillus和一株地霉菌Geotrichum，斜面保存备用；
(7)将芽孢杆菌Bacillus(简称BI )和地霉菌Geotrichum (简称Gl)单独培养，得到单一菌液，再将菌液按体积比1:1接种于同一污染水体中混合培养，用于处理六价铬污染，使混合菌能够处理酸性和碱性废水，扩大菌剂对进水酸碱度适应范围，酸性进水时，芽孢杆菌优先大量繁殖，代谢产物积累，溶液PH降低，为地霉菌生长创造条件，地霉菌开始大量繁殖，生物量的增加使六价铬含量及有机物含量快速降低，水质得到净化，而碱性进水时适宜地霉菌生长，地霉菌短时间内大量增殖还原、吸附六价铬，消耗有机质，水质得到净化。
[0008]所述牛肉膏蛋白胨液态培养基的成分为:牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化钠5g/L、水 I L0
[0009]所述牛肉膏蛋白胨固态培养基为牛肉膏蛋白胨液态培养基中加入15~25 g琼脂。
[0010]所述无机盐液态培养基成分为0.5g/L K2HPO4,1 g/L KH2PO4, 0.5g/L MgSO4,
0.01g/L CaCl2, lg/L NH4C1,0.01 g/L FeSO4, 1.0g/L NaCl,0.003g/L MnSO4, 5g/L 葡萄糖。
[0011]所述依次梯度即每次取前一步骤的稀释液加入到9 ml无菌生理盐水中。
[0012]两株菌适宜生长pH:
挑取两株菌分别在100 ml无机盐培养基中培养24 h后各取I ml菌液分别加入pH为
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10的150ml无机盐培养基中，摇床转速为120 rpm, 30°C培养24 h后，取I ml芽孢杆菌菌液稀释10倍，在600 nm测定吸光度值，计算菌液浓度，同时将地霉菌菌液滤膜过滤后，105°C烘干至恒重称重，结果如图1:可以看出地霉菌Gl能够生长繁殖的pH范围为2~7，最适生长pH为4，碱性(pH>7)环境中无法生长繁殖；芽孢杆菌B2的适宜生长pH范围为5~10，最适生长pH为8。
[0013]本发明的有益效果是:本发明提供的复合菌剂处理方法能在较宽pH范围内100%去除废水中的六价铬污染，并能利用废水中的有机质作为碳源，去除六价铬的同时消耗有机质，净化水质；并且两株菌筛选自同一土壤环境中，经拮抗性实验证明无拮抗作用，亦可应用于六价铬污染土壤修复；本方法降低了菌剂对进水pH的要求，提高接种微生物对废水的初始PH耐受范围，提高了处理效率，降低了预处理成本，同时提高六价铬污染废水的治理效果，且复合菌剂简单易得。
[0014]单一菌种和复合菌种处理效果对比:
单一菌种处理六价铬污染:
挑取两株菌分别在含有40mg/L六价铬的100 ml无机盐培养基中培养，各取I ml菌液分别加入pH为2、4、6、7、8、10的150 ml无机盐培养基(六价铬含量为40mg/L)中，摇床转速为120 rpm，30°C培养，按一定时间间隔，分别取样5 ml，在9280Xg离心力作用下离心15 min，取上清液，稀释10倍后按标准法(HJ687-2014)测定并计算六价铬残留量，结果如图2 (G1、B2):从图中可以看出当pH大于、等于3或者小于、等于5时，地霉菌Gl能够处理含六价铬的废水，并且在6天内100%去除六价铬；而当pH小于3或者pH大于5时Gl菌对含六价铬的废水没有净化作用，微生物生长繁殖完全被抑制；而芽孢杆菌B2在pH6~10范围内能处理一定量的六价铬，但均不能100%处理，处理效率也较低；当pH低于6或者大于10时则生长繁殖完全被抑制，对六价铬含量没有影响。
[0015]复合菌种协同作用处理六价铬污染:
挑取两株菌分别在含40 mg/L六价铬的100 ml无机盐培养基中培养24 h后，各取Iml菌液同时加入pH为2、4、6、7、8、10的150 ml无机盐培养基(六价铬含量为40mg/L)中，摇床转速为120 rpm, 30°C培养，每隔一定的时间取样5 ml，在9280X g离心力作用下离心15 min，取上清液，稀释10倍后按标准法(HJ687-2014)测定并计算六价铬残留量，结果如图3:由图可知进水pH在2~10的范围内均能处理六价铬，而且除pH=2外，其余酸碱度均能完全去除废水中的六价铬，pH小于5时，主要是地霉菌Gl的生长繁殖使六价铬被去除，而当大于5时初期由芽孢杆菌生长代谢去除部分六价铬，同时代谢产物的积累使废水pH降低，为Gl的生长繁殖创