一种有利于重组蛋白胞外分泌的基因敲除大肠杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及改造大肠杆菌遗传组基因领域，具体涉及一种有利于重组蛋白胞外分 泌的基因敲除大肠杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 大肠杆菌体系适合于生产翻译后无需修饰加工的蛋白质。由于大肠杆菌缺乏蛋白 折叠过程中需要的辅助因子，中间体易于大量积聚形成包涵体沉淀，为了获得有活性的蛋 白必须将包涵体进行复性等繁琐过程。果糖苷酶采用大肠杆菌体系进行表达，胞内表达量 较大易于形成包涵体，胞外表达量非常少，显著增加了下游成本。
[0003] 脂多糖（lipopolysaccharide, LPS)是革兰氏阴性细菌特有的结构和功能分子， 是细胞外膜主要组成部分。LPS -般由三部分组成，由内向外依次是疏水性的类脂A、核心 寡糖和由重复性糖单元构成的0-抗原。大肠杆菌BL21(DE3)的LPS中不含有0-抗原。作 为细胞最外层的屏障，LPS的组成与细胞结构的完整性、外膜的通透性的维持、菌膜的形成 能力、细菌的抗干燥能力和耐热性均密切相关。waaF为大肠杆菌BL21(DE3)中脂多糖庚糖 转移酶II(ADP_heptose:LPS heptosyltransferase II)的基因，该酶的作用是将庚糖II 连接到庚糖I上，从而完善脂多糖中核心寡糖的结构。msbB为大肠杆菌BL21(DE3)中用 于类脂A生物合成的十四烧酸转移酶（lipidAbiosynthesis(KDO) 2-(lauroyl)-lipid IVA acyltransferase)的基因，该酶的作用是将十四烧酸添加到类脂A的C3'位上，成为一条次 级脂肪酸链。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种有利于重组蛋白胞外分泌的基因敲除大肠杆菌，能够显著提高重 组蛋白在胞外的表达量，减少无活性包涵体的表达量，易于重组蛋白的纯化，显著降低生产 成本。
[0005] 本发明的另一目的是提供上述基因敲除大肠杆菌的制备方法，该方法简单，效率 高，成本低。
[0006] 本发明的再一目的是提供所述基因敲除大肠杆菌在制备胞外可溶性蛋白方面的 应用。
[0007] 本发明的目的采用如下技术方案实现。
[0008] 本发明提供有利于重组蛋白胞外分泌的基因敲除大肠杆菌，是通过敲除大肠杆菌 中脂多糖合成的相关基因后获得。
[0009] 在本发明中，所述脂多糖合成的相关基因是脂多糖庚糖转移酶II的基因waaF。
[0010] 在本发明中，所述脂多糖合成的相关基因还可以是十四烷酸转移酶的基因msbB。
[0011] 在本发明中，所述脂多糖合成的相关基因也可以是脂多糖庚糖转移酶II的基因 waaF和十四烧酸转移酶的基因msbB〇
[0012] 本发明还提供所述基因敲除大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：
[0013] (1)构建两端为待敲除靶基因同源片段、中间为抗性片段的打靶片段；所述抗性 片段是在抗性标记基因两端分别连接dif位点后得到；
[0014] (2)将pKD46质粒导入大肠杆菌，得到含有pKD46质粒的大肠杆菌；
[0015] (3)所述打靶片段与表达Red同源重组酶且含有pKD46质粒的大肠杆菌进行同源 重组，抗性筛选、消除抗性标记基因，得到所述基因敲除大肠杆菌。
[0016] 本发明还提供所述基因敲除大肠杆菌在制备胞外可溶性蛋白方面的应用。
[0017] 优选的技术方案中，将所述蛋白的编码基因插入表达载体，然后转化至所述基因 敲除大肠杆菌中，获得制备所述蛋白的重组菌。
[0018] 在本发明中，所述蛋白优选为果糖苷酶或青霉素G酰化酶。
[0019] 优选的技术方案中，诱导培养所述重组菌，将发酵液离心取上清液，得到所述可溶 性蛋白。
[0020] 本发明，首先构建线性打靶片段，包括含有庆大霉素抗性基因及两个dif位点的 抗性片段dif-Gnf-dif，以及抗性片段两侧分别是200bp左右的目标敲除基因的同源臂。然 后，通过电转化将线性打靶片段导入已经诱导表达三种Red同源重组酶Exo、Beta和Gam的 出发菌株E.coli BL21(DE3)中，实现线性打靶片段在大肠杆菌基因组中的重组。最后，利 用自身的Xer重组系统实现目标基因突变后抗性基因的消除，得到有利于重组蛋白胞外分 泌的基因敲除大肠杆菌。上述基因敲除大肠杆菌的制备方法简单，效率高，成本低。本发明 大肠杆菌由于敲除脂多糖合成的相关基因增加了细胞外膜的通透性，从而增强重组蛋白的 胞外分泌，进而极大简化下游复性及分离纯化工艺，减少表达蛋白对宿主菌的毒性和代谢 负担，最终提高可溶性重组蛋白的产量和纯度。
【附图说明】
[0021] 图1为PCR法鉴定目标基因是否被敲除的琼脂糖凝胶电泳图，其中：l.waaF基 因敲除菌用鉴定引物waaF-IF和waaF-IR进行菌落PCR;2?出发菌株Escherichia coli BL21 (DE3)用鉴定引物waaF-IF和waaF-IR进行菌落PCR ;3. msbB基因敲除菌用鉴定引物 msbB-IF 和 msbB-IR 进行菌落 PCR;4?出发菌株 Escherichia coli BL21(DE3)用鉴定引物 msbB-IF 和 msbB-IR 进行菌落 PCR。
[0022] 图2为果糖苷酶在对照菌株及基因敲除突变菌株中胞外表达效果的SDS-PAGE 比较图，其中：1. Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)_Fru;2. Escherichia coli BL21 (DE3) :：AmsbB/pET22b(+)-Fru；3. Escherichia coli BL21 (DE3) : : A waaF/ pET22b(+)-Fru〇
[0023] 图3为果糖苷酶在对照菌株及基因敲除突变菌株中胞内表达效果的SDS-PAGE 比较图，其中：1. Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)_Fru;2. Escherichia coli BL21 (DE3) :：AmsbB/pET22b(+)-Fru；3. Escherichia coli BL21 (DE3) : : A waaF/ pET22b(+)-Fru〇
[0024] 图4不同诱导表达时间对各菌株胞外青霉素G酰化酶PGA活力的影响， 其中： -Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)-pga ; O -Escherichia coli BL21 (DE3):: AmsbB/pET22b(+)-pga ； A -Escherichia coli BL21 (DE3):: AwaaF/ pET22b(+)-pga。
[0025] 图5青霉素G酰化酶PGA在重组菌株中胞外表达产物的SDS-PAGE图，其中： M:Protein marker;l，4 和 7:Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)-pga;2,5 和 8:Escherichia coli BL21(DE3)::AmsbB/pET22b(+)-pga;3,6 和 9:Escherichiacoli BL21(DE3) : : AwaaF/pET22b(+)_pga〇
【具体实施方式】
[0026] 下面结合实施例对本发明作进一步阐述，其目的是更好理解本
【发明内容】
。因此， 所举之例并不限制本发明的保护范围。此外，在所列实施例中如无特别说明均采用如下材 料：
[0027] (1)菌种及引物：
[0028] 出发菌株为Escherichia coli BL21 (DE3)(本实验室保藏，可以通过商业途径购 买）。
[0029] 抗性片段dif-Gnf-dif的结构：在庆大霉素抗性标记基因两端分别连接一个dif 位点。含有抗性片段dif-Gnf-dif?的打靶片段与含有pKD46质粒的大肠杆菌进行同源重组 后，在42°C条件下进行培养时，会进行Xer重组，消除抗性片段dif-Gnf-dif中的庆大霉素 抗性标记基因和一个dif位点。抗性片段dif-Gnf-dif和基因敲除辅助质粒pKD46为"大 肠杆菌基因删除试剂盒"内试剂，"大肠杆菌基因删除试剂盒"购自江苏锐阳生物科技有限 公司）。dif位点基因序列如SEQ ID NO: 15所示。
[0030] waaF基因克隆引物是waaF_F(序列如SEQ ID N0:3所示）和waaF_R(序列如 SEQ ID N0:4所示），waaF基因反向PCR引物是fxwaaF-F(序列如SEQ ID N0:5