一种精子核酸完整性的检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物测定技术领域，尤其是设及一种体外检测精浆中含有核酸完整性 的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 经国内外的学者研究发现，雄性不育患者的精子核酸完整性会明显缺失，精子核 酸的完整性是判断精子质量的有效依据。精子核酸完整性不仅会严重影响到精子的受精能 力、受精后原核的形成，而且可能导致流产、后代先天崎形或者患有某些遗传性疾病。精子 核酸的完整性对宫腔内人工授精助孕的实施来说，是极大影响助孕成功的不利因素之一。 因此，检测精子核酸的完整性对不育患者精子质量的评估具有极大的价值。
[0003] 研究发展XRCC1和xro基因与精子的形成W及完整性有些密切的关系。
[0004] XRCC1是碱基切除修复系统的重要组成部分，而xro是核巧酸切除修复系统的重要 组成部分，他们在维持基因组稳定性过程中起着关键的作用。XRCC1基因多态Argl94化P、 Ar的99Gln和Xro基因多态Lys751Gln是原发性无精现象的遗传易感因素。
[000引相比于传统的血清学检测方案，基于核酸检测的PCR技术可W在更早的阶段对病 原体做出精确的诊断。但是，PCR检测技术需要昂贵的设备和试剂，巧光定量PCR更是需要昂 贵的探针和复杂的操作步骤，对人员的操作水平也有较高的要求。鉴于W上的问题，一种可 操作性更强的检测方法的发明是一种趋势的。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种快速、准确、简便、实用的检测试剂盒，该试剂盒可对 精浆中含有核酸完整性进行综合评价。
[0007] 本发明的技术方案为： 盒体包括两个部分，核酸抽提、核酸检测。
[0008] 核酸抽提部分包括:抽提使用磁性乳酸微珠、裂解液、有机相清洗液、无机相清洗 液、洗脱保存液； 核酸检测部分包括:质控品、反应混合物、引物组。
[0009] 本发明的测试原理： 1) 针对XRCC1和xro两个基因的序列设计用于富集目标基因序列的结合磁性乳酸微珠 上的捕捉序列 所述抽提富集结合序列为： 沈Q NO.1:5 '-CGACCTGTCACCGCCCTCGGTCCCGGG -3 ' 沈Q N0.2:5'-CGCTGCGGGTGTAAACATAGGAGGTGG -3' 沈Q N0.3:5'-CGCTGCGGGTGTAAACACGGGCGAGAG -3' 2) 针对XRCQ和xro的Ξ个位点设计引物序列 针对XRCC1的Argl94Trp和Ar的99Gln的位点，W及XPD的Lys751Gln的位点设计扩增引 物，用于对运Ξ个位点进行信号放大和检测。
[0010] 所述XRCC1 Argl94T巧的引物序列为： 沈Q N0.4 F:5'-GCCAGGGCCCTCCTCTCAAA -3' 沈Q N0.5 R:5'-TACCTCCAGACCCACGAGT -3' 所述XRCC1 Ar的99Gln的引物序列为： 沈Q N0.6 F:5'-TCCTCCACCTTGTGCTTTCT-3' 沈Q N0.7 R:5'-AGTAGTCTGCTGGCTCTGGG -3' 所述XPD Lys751Gln的序列引物序列为： 沈Q N0.8 F:5'-GCCCGCTCTGGATTATACG-3' 沈Q N0.9 R:5'-CTATCATCTCCTGGCCCTAT -3' 3化RCQ和xro质控品的设计： 为了对整个扩增过程实施质量，在扩增反应中加入质控品用于对扩增系统进行质控， 也便于出现错误时，追溯错误的原因。W引物的对应序列作为序列的5'端和3'端，中间选用 与检测精子核酸没有同源性的天然序列。
[0011] SEQ NO.10： 5'-CGGTCCCGGGAGGAGAGTTTTTCAGCTTTGAGCCAGTTATTAAAACCCCTTTTGATTTGTTAAAACACC TTGCGGTCTGGCAACTGCAAGTGTCAAACAAGAAATCAAAAGTCTGTGGCAACCGCTTAATGACACTCGTTTGCTGG CTGAATCTCCGGCAGCATTCATACGAATCTCCGGCAGCATTCACACCCAGCAACATATGGAGGTCTGGGTGCTCA- 3， 沈Q NO.11: 5'-TCCTCCACCTTGTGCTTTCTTTCAGCTTTGAGCCAGTTATTAAAACCCCTTTTGATTTGTTAAAACACCT TGCGGTCTGGCAACTGCAAGTGTCAAACAAGAAATCAAAAGTCTGTGGCAAGCCGCTTAATGACACTCGTTTGCTGG CTTCATTCATCAGACGACCGAGACCC -3' 沈Q NO.12: 5'-CGGGCGAGACCTAATATGCTTCAGCTTTGAGCCAGTTATTAAAACCCCTTTTGATTTGTTAAAACACCTT GCGGTCTGGCAACTGCAAGTGTCAAACAAGATGATAGTAGAGGACCGGGATA -3 ' 4)抽提的原理： 通过磁性乳酸微珠上结合的序列对基因组中的目标核酸片段进行捕捉，并通过对捕捉 的目标核酸片段用有机相清洗液和无机相清洗液去除附着的有机相和无机相，并通过洗脱 保存液洗脱并保存。
[001引所述抽提步骤如下： 4.1样本的处理:将适合量的样本放入离屯、管中，并加入裂解液，震荡混匀后备用； 4.2磁性乳酸微珠的处理:充分摇匀磁性微珠，用移液器取合适的量置于离屯、管中，磁 性分离Imin，弃上清;吸取适量的磁性微珠加入裂解混合液中，吹吸混匀； 4.3将离屯、管置于磁性管架上，静置2 min,弃上清； 4.4将离屯、管磁性管架上取下，将适量的有机相清洗液加入离屯、管中，吹吸混匀，将离 屯、管放置回磁性管架上，静置2 min,弃上清； 4.5将离屯、管磁性管架上取下，将适量的无机相清洗液加入离屯、管中，吹吸混匀，将离 屯、管放置回磁性管架上，静置2 min,弃上清； 4.6将离屯、管磁性管架上取下，将适量的洗脱保存液加入离屯、管中，吹吸混匀，将离屯、 管置于60°C水浴5min; 4.7将离屯、管放置回磁性管架上，静置至上清澄清，上清即为纯化的基因组DNA，将上清 转移至另一离屯、管中，可直接于-20°C低溫保存。
[0013] 4)扩增反应的原理 所述反应液包括：l〇X扩增反应缓冲液、引物组、Bst DNA聚合酶。
[0014] 所述反应体系如下： '^所述按W下程序进行扩增:
' ' 60°C 90min〇
[0015] 5)扩增反应的分析 通过凝胶电泳或毛细电泳将不同大小的特定基因型的扩增产物片段进行分离，分离后 使用紫外检测扩增产物片段的大小，W此来确定目的基因的基因型。
[0016] 本发明的有益效果是： 此技术在同一个反应体系中同时扩增多条不同的产物，定性鉴定样本精子的核酸完整 性。而且扩增片段长度适中，扩增条件溫度要求低，使用仪器简单。
[0017]
【附图说明】
[0018] 图1为本发明所述试剂盒核酸抽提部分； 其中1 -磁性乳酸微珠、2-裂解液、3-有机相清洗液、4-无机相清洗液、5-洗脱液、6-保存 液； 图2为本发明所述试剂盒核酸检测部分； 其中1-反应液、2-质控品、3-XRCC1的Argl94T巧引物、4-XRCC1的A