C延伸7min。
[0070] 对PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，120v电泳30min，邸染色后用凝胶成 像系统观察结果。其中，感病亲本仅扩增出一条大小为237bp的条带，记为a型条带;抗病亲 本仅扩增出一条大小为201bp的条带，记为b型条带；同时扩增出双亲条带（一条大小为 237bp的条带和一条大小为2(Ubp的条带)记为ab型条带。结果表明：接种来源于云南通海的 芸臺根肿菌（芸臺根肿菌7号生理小种）的95株BC2F2代大白菜植株中，表型鉴定为抗病的37 株大白菜中均扩增到含有抗病亲本的b型条带，其中17株大白菜中扩增到仅含有抗病亲本 的b型条带，20株大白菜中扩增到含有双亲亲本的ab型条带;表型鉴定为感病的58株大白菜 扩增到仅含有感病亲本的a型条带（图2a和表2)。接种来源于沈阳新民的芸臺根肿菌(芸臺 根肿菌2号生理小种）的119株BC2F2代大白菜植株中，表型鉴定为抗病的60株大白菜中均扩 增到含有抗病亲本的b型条带，其中27株大白菜中扩增到仅含有抗病亲本的b型条带，33株 大白菜中扩增到含有双亲亲本的ab型条带;表型鉴定为感病的59株大白菜中均扩增到仅含 有感病亲本的a型条带（图化和表2)。接种来源于大连水师营的芸臺根肿菌(芸臺根肿菌2号 生理小种)的122株BC2F2代大白菜植株中，表型鉴定为抗病的60株大白菜均扩增到含有抗病 亲本的b型条带，其中30株大白菜中扩增到仅含有抗病亲本的b型条带，30株大白菜中扩增 到含有双亲亲本的ab型条带;表型鉴定为感病的62株大白菜中均扩增到仅含有感病亲本的 a型条带（图2c和表2)。由此可知，利用特异引物对Indell409-3PCR扩增鉴定分别接种来自 云南通海的芸臺根肿菌、自大连水师营的芸臺根肿菌和来自沈阳新民的芸臺根肿菌BC2F2群 体单株大白菜的抗性结果与表型鉴定结果吻合率达到100% (表2)。
[0071] 表2:特异引物对Indell409-3对不同菌源根肿病抗性的验证结果
[0072]
[0073] 对抗大白菜根肿病的BC2F2代大白菜植株的PCR扩增产物中的b型条带（201bp的 DNA)进行测序。结果表明：b型条带（2(Ubp的DNA片段）均含有SEQ ID No.l的第32-232位所 示的核巧酸序列。对感大白菜根肿病的BC2F2代大白菜植株的PCR扩增产物中的a型条带 (237bp的DNA)进行测序。结果表明：a型条带（237bp的DNA片段)均不含有沈Q ID No. 1的第 32-232位所示的核巧酸序列。
[0074] 由此可知，利用SEQ ID No. 1的第32-232位所示的核巧酸序列及其引物对对大白 菜根肿病的鉴定结果与表型鉴定结果一致。表明，SEQ ID No. 1的第32-232位所示的核巧酸 序列与大白菜的根肿病抗性是连锁标记的，可利用该核巧酸序列及其引物对对大白菜的根 肿病抗性进行辅助鉴定。
【主权项】
1. 鉴别或辅助鉴别大白菜是否为抗根肿病大白菜的方法，包括以待鉴别大白菜的基因 组DNA为模板，以SEQIDNo.2所示的单链DNA为正向引物，SEQIDNo.3所示的单链DNA为反 向引物，进行扩增，检测扩增产物的大小，根据扩增产物的大小按照下述方法确定所述待鉴 别大白菜是否为抗根肿病大白菜： 如果所述待鉴别大白菜的扩增产物中含有大小为201bp的条带，所述待鉴别大白菜为 抗根肿病大白菜或候选抗根肿病大白菜;如果所述待鉴别大白菜的扩增产物中不含有大小 为201bp的条带，所述待鉴别大白菜为非抗根肿病大白菜或非候选抗根肿病大白菜。2. 鉴别或辅助鉴别大白菜是否为抗根肿病大白菜的方法，包括检测待鉴别大白菜的基 因组DNA中是否含有SEQ ID No. 1的第32-232位所示的201bp的DNA片段;如果所述待鉴别大 白菜的基因组DNA中含有SEQ ID No.l的第32-232位所示的201bp的DNA片段，所述待鉴别大 白菜为抗根肿病大白菜或候选抗根肿病大白菜； 如果所述待鉴别大白菜的基因组DNA中不含有SEQ ID No.l的第32-232位所示的201bp 的DNA片段，所述待鉴别大白菜为非抗根肿病大白菜或非候选抗根肿病大白菜。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述检测待鉴别大白菜的基因组DNA中是 否含有SEQ ID No. 1的第32-232位所示的201 bp的DNA片段的方法包括：以待鉴别大白菜的 基因组DNA为模板，以SEQIDNo.2所示的单链DNA为正向引物，SEQIDNo.3所示的单链DNA 为反向引物，进行扩增，检测得到的扩增产物的序列。4. 权利要求1-3任一所述的方法的用途，所述用途为下述1)-4)中任意一种： 1) 在鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性中的应用； 2) 在选育大白菜根肿病抗病品种中的应用； 3) 大白菜育种中的应用； 4) 预测大白菜根肿病抗性中的应用。5. 鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性的引物对，由正向引物和反向引物组成； 所述正向引物为如下al)或a2): al)SEQ ID吣.2所示的单链0嫩分子； a2)将al)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 a 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子； 所述反向引物为如下bl)或b2): bl)SEQ ID吣.3所示的单链0嫩分子； b2)将bl)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与 b 1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。6. 含有权利要求5所述引物对的鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性的试剂或试剂盒。 7.SEQ ID No.l的第32-232位所示的201bp的DNA片段。8.权利要求4所述的引物对、权利要求5所述的试剂或试剂盒或权利要求6所述的DNA片 段的用途，所述用途为下述A-F中任意一种： A、 在鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性中的应用； B、 在选育大白菜根肿病抗病品种中的应用； C、 大白菜育种中的应用； D、 预测大白菜根肿病抗性中的应用； E、 在制备鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性产品中的应用； F、 在制备预测大白菜根肿病抗性产品中的应用。9. 根据权利要求1-3任一所述的方法、权利要求5所述的引物对、权利要求6所述的试剂 或试剂盒或权利要求4或8所述的应用，其特征在于：所述大白菜根肿病是由芸薹根肿菌 (Plasmodiophora brassicae Woron)所弓丨起的。10. 根据权利要求1-3任一所述的方法、权利要求5所述的引物对、权利要求6所述的试 剂或试剂盒或权利要求4或8所述的应用，其特征在于:所述待鉴别大白菜为CR-为民AX北 京新3号和/或北京新3号XCR-为民A的杂交后代中的F2及其以后世代的家系。
【专利摘要】本发明公开了一种鉴定定位于白菜A03染色体的根肿病抗性QTL的InDel分子标记及其应用。本发明提供了鉴别或辅助鉴别大白菜是否为抗根肿病大白菜的方法，包括以待鉴别大白菜的基因组DNA为模板，以SEQ？ID？No.2所示的单链DNA为正向引物，SEQ？ID？No.3所示的单链DNA为反向引物，进行扩增，检测扩增产物的大小，根据扩增产物的大小按照下述方法确定所述待鉴别大白菜是否为抗根肿病大白菜：如果所述待鉴别大白菜的扩增产物中含有大小为201bp的条带，所述待鉴别大白菜为抗根肿病大白菜或候选抗根肿病大白菜；如果所述待鉴别大白菜的扩增产物中不含有大小为201bp的条带，所述待鉴别大白菜为非抗根肿病大白菜或非候选抗根肿病大白菜。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105543391
【申请号】CN201610080876
【发明人】汪维红, 于拴仓, 苏同兵, 张凤兰, 余阳俊, 张德双, 赵岫云, 卢桂香
【申请人】北京市农林科学院
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年2月5日