一种拟康宁木霉ReTk1菌株及菌剂制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种拟康宁木霉ReTk1菌株及其菌剂制备方法和应用，其步骤：A、将ReTv2菌株在PDA培养基于28℃活化培养3d；B、再接种到PDA斜面，在28℃培养5d，加入灭菌的去离子水；C、调整孢子液浓度为5×105孢子/mL，加入1mL的孢子液于250mL的PDB培养基中，在180rpm、25℃的条件下培养6d，收集孢子制备成孢子悬浮液制剂。一种拟康宁木霉ReTk1菌剂在油菜生长的促进、在制备治疗或预防油菜根肿病药物、菌株在发酵滤液对油菜根肿病菌休眠孢子萌发抑制中的应用。该菌株对油菜有显著的促生作用，同时对油菜根肿病具有显著的防治效果。该生防菌剂在室内栽培条件下对油菜根肿病的防效达到了55.2%，并且可直接在播种时直接施用，施药方法简单，节约劳动力，并且具有生物农药对人畜安全。CCTCC NO：M20144082014.09.10
【专利说明】一种拟康宁木霉ReTkI菌株及菌剂制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物病害生物防治【技术领域】，更具体涉及一种用于油菜根肿病生物防 治的囷株拟康宁木霉ReTkl，该囷株能在油采内进彳丁内生性生长，冋时还涉及一种拟康宁木 霉ReTkl菌株的制备方法，还涉及一种拟康宁木霉ReTkl菌株在制备治疗或预防油菜等十 字花科植物根肿病药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 油菜是我国重要的油料作物之一，在油菜生产过程中面临多种病原菌的威胁。油 菜根肿病是由原生动物界根肿菌门芸薹根肿菌O ciZa1SWoiZioMora Ara1S1Sicad引起的一种 重要病害，该病害主要危害寄主根部造成根部薄壁细胞增生而形成肿瘤，该病害同时也危 害其他多种十字花科植物。目前对于根肿病缺乏有效的防治手段，常规的抗病品种、种子处 理与化学药剂相结合的综合防治措施对该病防治效果欠佳。根肿病难以防治的主要原因在 于该病为典型的土传病害，根肿病菌的休眠孢子可以在缺乏寄主的条件下在土壤中存活很 多年，在病害一旦发生的情况下菌源积累极快，难以利用常规的化学防治方法进行有效防 治；同时目前也缺乏针对该病的有效抗病品种。针对根肿病目前难以有效防治的困难，在 根肿菌寄主群体中寻找可以利用的抗病种质资源及在寄主微生态环境或寄主中寻找有效 的生防菌进行生物防治均是解决目前根肿病防治困境的方向。目前也有不少学者在进行这 方面的尝试，如季海雯等分别在枝江、黄山根肿病重发病区对214个油菜品种进行抗性研 究，结果表明赣两优三号等12个油菜品种在枝江对4号生理小种表现抗病；成油杂6号等 3个杂交种在黄山对13号生理小种表现出抗病，可作为当地根肿病病区主栽品种及育种材 料使用（季海雯，硕士学位论文，2013)。徐海燕等也从9个云南主栽品种和国内新育成的 7个油菜品种中，筛选出A35、花油7号和云油双1号3个品种全生育期均表现出较强的抗 根肿病能力的品种(徐海燕，硕士学位论文，2011)。杨力帆等发现深绿木霉（TricAoofezma aiiwiriife)REMI突变菌株H6的发酵液对对根肿休眠孢子萌发有明显的抑制作用，对根肿 病具有一定的生物防治潜力（杨力帆，硕士学位论文，2010)。王会军等从油菜品种KT1004 和Y05-84-5-1的根部分离出51株内生菌，发现其中短小芽孢杆菌YN201305和枯草芽孢杆 菌YN201310菌株对十字花科根肿病菌有明显裂解和抑制作用（王会军等，中国油料作物学 报，2014,36(1) :92-97)。本发明则报道了一株能在油菜植株内生性生长，对油菜根肿病具 有显著防治效果的拟康宁木霉菌株及其在防治油菜根肿病中的应用。迄今为止未见有涉及 本发明主题的相关文献。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，是在于提供了一种拟康宁木霉ReTkl菌 株，该菌株是自发病油菜田中的健康油菜植株分离筛选而来，该菌株对油菜有显著的促生 作用，同时对油菜根肿病具有显著的防治效果。
[0004] 本发明的另一个目的是在于提供了一种拟康宁木霉ReTkl菌剂的制备方法，该方 法取材容易，制备过程简单，产量高，分生孢子产量可以达到IX 109/mL。
[0005] 本发明还有一个目的是在于提供了一种拟康宁木霉ReTkl菌剂在促进油菜生长 中的应用，该菌为油菜内生性真菌，能在油菜植株内生长，发挥促进油菜生长的功效。
[0006] 本发明还有一个目的在于提供了一种拟康宁木霉ReTkl菌株(发酵上清液)在抑制 油菜根肿病菌休眠孢子萌发中的应用，该发酵液对油菜根肿病菌休眠孢子的萌发抑制率可 达 52. 69%。
[0007] 本发明最后一个目的在于提供了一种拟康宁木霉ReTkl菌剂在制备治疗或预防 十字花科植物根肿病药物中的应用，所述的十字花科植物优选油菜，该菌剂对油菜根肿病 的防效可达55. 2%。
[0008] 为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施： 一种拟康宁木霉ReTkl菌株的制备方法，其步骤是： 1) 一种拟康宁木霉菌株的分离与获得：收集湖北省枝江地区发病油菜田块的健康油菜 根部组织，清洗干净后用70% (体积比，以下相同）乙醇浸泡lmin，用5% (质量体积比，以下 相同）的NaOCl浸泡4-6min，之后用无菌水清洗3次。将根部切成0. 4-0. 6cm的小段至于 PDA培养基上，在25°C培养14天，将长出的真菌孢子在PDA平板上进行划线培养，并进行单 孢纯化；根据形态学特征和ITS DNA序列进行鉴定，详见实施例1。
[0009] 2)-种拟康宁木霉ReKtl菌株内生性的验证：以pCAMBIA1301(购自CAMBIA公司） 为骨架构建RFP表达载体，在PDA上培养拟康宁木霉ReKtl菌株5-7天后收集分生孢子，利 用农杆菌介导的转化方法（Li Moxiao 等，FEMS Microbiol Lett，2005, 243 (2) :323-329)将 RFP载体转化拟康宁木霉ReKtl菌株，在含有50ug/mL潮霉素的PDA上筛选转化子，并在含 有100ug/mL潮霉素的PDA上进行第二轮筛选，最后挑选能发红色荧光且生物学表现无改变 的菌株进行内生性验证。在200mL的PDB培养基中接种I X IO6的孢子，在28°C、200rpm的 条件下培养15h，4000rpm离心5min收集孢子，无菌水清洗3次。将幼嫩的油菜根部浸泡到 含I X IOVmL拟康宁木霉ReKtl孢子的MM培养基中，在22°C条件下共培养24h后在荧光显 微镜下观察拟康宁木霉ReKtl在油菜根部的定殖情况。
[0010] 本发明从湖北省枝江地区发病油菜田块的健康油菜根部组织分离筛选获得一株 适用于油菜根肿病防治的生防真菌拟康宁木霉（ZricAoofe/ma airoririofe)菌株ReKtl,该 菌株能在油菜根部定殖，其在PDA培养基上的菌落形态如图1所示，该菌在PDA培养基上菌 落圆形，早期白色，后期因为产生大量的分生孢子呈绿色；分生孢子梗单轴近直角分支，分 生孢子近圆形；25°C为最适生长温度，在15°C或35°C条件下生长均极缓慢。
[0011] 该菌株于2014年9月10日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保 藏中心(英文简称CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC N0:M2014408,分类命名：拟康宁木霉 ReTKl Trichoderma koningiopsis ReTKl。一种拟康宁木霉 ReTkl 菌株中含有 SEQ ID NO : 1所示的核苷酸序列。
[0012] 一种生防菌拟康宁木霉ReTkl菌剂的制备方法，其步骤是： A、 将ReTv2菌株在PDA培养基于28°C活化培养3 d ; B、 再接种到PDA斜面，在28°C培养5 d，加入灭菌的去离子水； C、 调整孢子液浓度为5 X IO5孢子/mL，加入ImL的孢子液于250mL的PDB培养基中，在 180rpm、25°C的条件下培养6 d，收集孢子制备成孢子悬浮液菌剂； 上述步骤中的PDA和PDB培养基的组分及配比如下： PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂10 g，补充蒸馏水至1000 mL，调pH至 7. 0,在121°C高压蒸汽灭菌30min ; PDB培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，补充蒸馏水至1000 mL，调pH至7.0,在121°C 高压蒸汽灭菌30min。
[0013] 一种拟康宁木霉ReTkl菌剂在油菜生长的促进中的应用，其步骤是： A、 在灭菌的培养基质(购自镇江培蕾基质科技发展有限公司）中加入ReTkl的分生孢 子，使孢子浓度为I X IO7孢子/g ; B、 接种孢子后加入油菜种子后置于20-23°C的光照培养室中培养，以不接ReTkl菌株 孢子的处理为对照。
[0014] C、每个处理含60株油菜，重复3次。
[0015] C、培养25d后测量各处理中第一片真叶的直径，培养42d后测量各处理中油菜植 株根茎的长度。结果发现经过ReTkl处理后，植株第一片真叶的直径及油菜根茎的长度菌 有大幅提高，培养25d时对照组第一片真叶的直径为6. 5cm，而ReTv2处理组第一片真叶的 直径可达10. 5cm ;培养42d时对照组根茎的长度分别为8. Ocm和15. 5cm，而ReTv2处理组 根茎的长度分别达12. Ocm和20. 5cm，结果说明该菌株对油菜生长有明显的促进作用。
[0016] 一种拟康宁木霉ReTkl的菌株(发酵滤液)在对油菜根肿病菌休眠孢子萌发抑制中 的应用，其步骤是： A、根肿菌休眠孢子的制备：将油菜根肿病发病组织置于无菌水中浸泡，将组织捣碎搅 拌后用纱布过滤收集休眠孢子，用梯度离心的方法进一步纯化休眠孢子，调整浓度。
[0017] B、油菜根分泌物的收集：将发芽后的油菜幼苗移栽到杯子中的滤纸上，让其根部 穿透滤纸浸入纸杯下部的营养液中，在20-23°C的光照培养室中培养14d后收集下部的液 体，用滤膜过滤后备用。
[0018] C、菌株ReTkl发酵滤液的制备：将ReTkl菌株在PDA培养基活化培养，再接种到 PDA斜面，在28°C培养5d，加入灭菌去离子水，制备孢子悬浮液，加入孢子液（5X IO5孢子/ mL)于PDB培养基中，在一定条件下培养，收集上清备用。
[0019] D、孢子萌发抑制试验：将5mL的根分泌物、0. 5mL纯化的休眠孢子及ImL的ReTkl 发酵滤液（PDB为对照）加入灭菌的离心管中，调整pH值，在黑暗条件下培养，在不同的时 间点在光学显微镜下检测孢子的萌发率。结果显示后，对照组休眠孢子萌发率达到73%，而 ReTkl发酵滤液处理组休眠孢子萌发率仅为39. 74%，在6d后，对照组休眠孢子萌发率达到 100%，而ReTkl发酵滤液处理组休眠孢子萌发率仅为47. 31%，结果显示ReTkl发酵滤液对油 菜根肿病菌休眠孢子的萌发有明显的抑制作用。
[0020] 一种拟康宁木霉ReTkl菌剂在制备治疗或预防油菜根肿病药物中的应用，其步骤 是： A、菌株ReTkl对油菜根肿病发生率的影响：准备灭菌的培养基质，在播种前接种根肿 菌休眠孢子（I X IO7休眠孢子/mL)在培养基质中，接种混匀后基质中的休眠孢子浓度为 2 X IO6休眠孢子/g。
[0021] B、在播种油菜后加入ReTkl分生孢子（IX IO7孢子/mL)，加入后基质中ReTv2孢 子浓度为IX 107孢子/g，加入的无菌水为对照处理。之后将油菜置于20-23°C的光照培养 室中，培养后收集不同处理的油菜根部，仔细用清水清洗掉土壤后用无菌水润洗3次，切成 小段后置于70%的乙醇中保存。 C、用1% (体积比）的醋酸胭脂红进行染色后在显微镜下观察根毛中的侵染情况，每个 处理中至少计算40个根毛的侵染情况进行统计分析不同处理中的根肿病发生率。
[0022] D、菌株ReTkl对油菜根肿病的控制作用：按上述同样处理后的油菜置于20_23°C 的光照培养室中培养6周，每个处理均有60株油菜，且每处理重复3次。在第42d时进行病 害发生情况的统计。油菜根肿病分级标准为：〇级：没有根肿发生；1级：仅在侧根可见非常 小的肿瘤；2级：在主根和侧根均可见小的肿瘤；3级：在主根和侧根均可见中等到大的肿 瘤，植株长势衰弱；4级：出现非常严重的肿瘤，整个根部被完全破坏，植株长势严重衰弱。
[0023] 申请人:应用上述微生物菌剂对盆栽条件下的油菜根肿病进行了生物防治试验，该 菌剂对油菜根肿病的防效为55. 2%，达到了预期的效果。
[0024] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果： 该菌为油菜内生性真菌，能进入油菜根部生长，可长期在植物内发挥防治病害的功效； 该菌不仅能防治病害，还对油菜有显著的促生作用；该方法取材容易，制备过程简单，产量 高，分生孢子产量可以达到I X IO9个/mL。本发明的拟康宁木霉ReTkl菌株为油菜内生性菌 株，可在油菜根部成功定殖并对油菜有促生作用，其发酵液对油菜根肿病病菌休眠孢子的 萌发有明显的抑制作用，该生防菌剂在室内栽培条件下对油菜根肿病的防效达到了 55. 2%， 并且可直接在播种时直接施用，施药方法简单，节约劳动力，并且具有生物农药对人畜安 全。
[0025]
【专利附图】
【附图说明】 图1为一种分离筛选的生防菌拟康宁木霉ReTkl的菌落（A)、孢子梗和孢子（B)形态 图。
[0026] 图2为一种红色荧光蛋白RFP标记的生防菌菌株ReTkl在荧光显微镜下发出红色 荧光（A)，将RFP标记菌株的孢子与油菜根部在丽培养基中共培养24h后进行观察，油菜 根部组织内的红色荧光显示该菌能在油菜根部成功定殖（B)而对照的油菜根部无红色荧光 (C)。
[0027] 图3为一种分离筛选的生防菌拟康宁木霉ReTkl对油菜生长的促进作用示意图。
[0028] 图中：A为ReTkl菌剂处理后油菜第一片真叶的直径明显增大；B为ReTkl处理后 油菜的根和茎的长度均大大增长。
[0029] 图4为一种分离筛选的生防菌拟康宁木霉ReTkl对油菜根肿病的控制作用示意 图。
[0030] 图中：A为ReTkl菌剂处理14d后油菜根毛中休眠孢子的侵染情况；B为ReTkl菌 剂处理42d后油菜根肿病的根部症状。
[0031]
【具体实施方式】 实施例1 : 一种拟康宁木霉ReTkl菌株的制备方法，其步骤是： 1.菌株的分离地点及分离方法： 收集湖北省枝江地区发病油菜田块的健康油菜根部组织，清洗干净后用70% (体积比） 乙醇浸泡lmin，用5%的NaOCl浸泡5min，之后用无菌水清洗3次。将根部切成0. 5cm的小 段至于PDA培养基上，在25°C培养14天，将长出的真菌孢子在PDA平板上进行稀释培养，并 进行单孢纯化；获得一株真菌菌株将其编号为ReTkl，其菌落、孢子梗及孢子形态见图1，进 一步结合ITS DNA序列进行鉴定。
[0032] 2.菌株的 16S rDNA 鉴定： 取上述菌株ReTkl接种在铺有玻璃纸的PDA平板上，28°C培养Id后刮取菌丝。
[0033] 采用CTAB法提取菌株的DNA，参考Sambrook等（1989)。具体步骤如下：称取0. 2 g菌丝在液氮中研磨成粉末，转入ImL 65°C预热的抽提缓冲液（0. OlM Tris-HCl，pH8. 0;2% CTAB，W/V;L4M NaCl，121 °C灭菌 30 min)，65°C 温育 5?8 min，每 2 min 颠倒混匀；加入 等体积的苯酚/氯仿（1/1)，振荡器上充分混勻，12, 000 rpm离心10 min,取上清，加入等体 积的氯仿再抽提一次；12, 000 rpm离心15 min,取上清，加入0. 1倍体积的3M醋酸钠溶液 和0. 6倍体积的异丙醇轻轻混勻，-20°C静置沉淀30 min，12,000 rpm离心15 min,弃上清， 将沉淀用70 % (体积比）乙醇洗两遍，置37°C温箱干燥后，加入适量20 μ I TE溶解，-20°C 保存。以真菌 ITS 通用引物 ITSl (5' TCC GTA GGT GAA CCT GCG G 3'）和 ITS4 (5' TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3，）（White et al·，1999)为引物，上述 DNA 为模板，对菌株 ReTkl 的 ITS rDNA 进行 PCR 扩增。
[0034] ?〇?采用25以1的反应体系：(1(1!120 19.8111，10 1111的10\1311打61<含]\%(：12)2.5111， 2. 5 mM dNTP 0· 5μ 1，10μ M 的引物 ITSl 0· 5μ 1，10μ M 的引物 ITS4 0· 5μ l，Taq酶 IU (5U/ul )，DNA 模板（50ng/ μ I) I μ I。
[0035] 反应程序：（1)94°C 3min;(2)94°C 40s，54°C 30s，72°C lmin，循环 35 次；（3) 72°C Imin 延伸；（4)4°C下保存。
[0036] 应用回收试剂盒将PCR产物回收并连接到pMD18_T (购自TaKaRa公司，中国大连） 上进行序列测定。测序后的序列见序列表SEQ ID N0:1。将测序结果与GenBank(http:// blast, ncbi. nlm. nih. gov)中已知的ITS rDNA序列进行同源性比较，发现与拟康宁木霉 (,ricAoofe/ma )同源性达到100%,结合菌株菌落及孢子梗和孢子形态,将菌 株ReTkl鉴定为拟康宁木霉。
[0037] 菌株 ReTkl 的 16S rDNA 序列为 SEQ ID NO :1 所示。
[0038] 将菌株已经鉴定为拟康宁木霉（[ricAoofe/ma 菌株ReTkl,该菌株 于2014年9月10日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(英文简称 CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO :M2014408。
[0039] 一种拟康宁木霉（Trichoderma koningiopsis)菌株 ReTkl 中含有 SEQ ID NO : 1 所示的核苷酸序列。
[0040] 实施例2 : 本发明分离的菌株ReTkl在油菜根部内生性验证： 一种拟康宁木霉ReTkl菌株内生性的验证：以pCAMBIA1301为骨架构建RFP表达载体， 在PDA上培养拟康宁木霉ReTkl菌株5-7天后收集分生孢子，利用农杆菌介导的转化方法 将RFP载体转化拟康宁木霉ReTkl菌株，在含有50ug/mL潮霉素的PDA上筛选转化子，并在 含有lOOug/mL潮霉素的PDA上进行第二轮筛选，最后挑选出能发红色荧光且生物学表现无 改变的菌株（图2A)。在200mL的PDB培养基中接种能发红色荧光的菌株的I X IO6的孢子， 在28°C、200rpm的条件下培养15h，4000rpm离心5min收集孢子，无菌水清洗3次。将幼嫩 的油菜根部浸泡到含IXlO5 /mL拟康宁木霉ReTkl孢子的MM培养基中，在22°C条件下共 培养24h后在突光显微镜下观察拟康宁木霉ReTkl在油菜根部的定殖情况，结果发现该菌 能成功在油菜根部定殖（图2B)，而对照处理中没有检测到红色荧光。
[0041] 实施例3: 一种生防菌拟康宁木霉ReTkl菌剂的制备方法，其步骤是： A、 将ReTkl菌株在PDA培养基于28°C活化培养3 d，再接种到PDA斜面； B、 在步骤A上28°C再培养5d，加入灭菌的去离子水，洗下孢子悬浮液，加入灭菌的去离 子水，调整孢子液浓度为5 X IO5孢子/mL。
[0042] C、加入ImL的孢子液于250mL的PDB培养基中，在180rpm、25°C的条件下培养6 d， 浓度可达IX IO9孢子/mL，收集孢子制备成孢子悬浮液制剂(菌剂)。
[0043] 上述步骤中的PDA和PDB培养基的组分及配比如下： PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂10 g，补充蒸馏水至1000 mL，调pH至 7. 0,在121°C高压蒸汽灭菌30min ; PDB培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，补充蒸馏水至1000 mL，调pH至7.0,在121°C 高压蒸汽灭菌30min。
[0044] 实施例4 : 一种拟康宁木霉ReTkl菌剂在油菜生长的促进中的应用，其步骤是： A、 在灭菌的培养基质(购自镇江培蕾基质科技发展有限公司）中加入ReTkl的分生孢 子，使孢子浓度为I X IO7孢子/g ; B、 接种孢子后立即加入油菜种子后置于20-23°C的光照培养室中培养，以不接ReTkl 菌株孢子的处理为对照。
[0045] C、每个处理含60株油菜，重复3次。
[0046] C、培养25d后测量各处理中第一片真叶的直径，培养42d后测量各处理中油菜植 株根茎的长度。结果发现经过ReTkl处理后，植株第一片真叶的直径及油菜根茎的长度菌 有大幅提高，培养25d时对照组第一片真叶的直径为6. 5cm，而ReTv2处理组第一片真叶的 直径可达10. 5cm ;培养42d时对照组根茎的长度分别为8. Ocm和15. 5cm，而ReTv2处理组根 茎的长度分别达12. Ocm和20. 5cm，结果说明该菌株对油菜生长有明显的促进作用（图3)。
[0047] 实施例5 : 一种拟康宁木霉ReTkl菌株在发酵滤液对油菜根肿病菌休眠孢子萌发抑制中的应用， 其步骤是： A、根肿菌休眠孢子的制备：将5g干的油菜根肿病发病组织置于150mL无菌水中浸泡 2h，将组织捣碎搅拌后用纱布过滤收集休眠孢子，用梯度离心的方法进一步纯化休眠孢子， 调整浓度为IX IO7孢子/mL。
[0048] B、油菜根分泌物的收集：将发芽3d后的油菜幼苗移栽到杯子中的滤纸上，让其 根部穿透滤纸浸入纸杯下部的营养液中，在20-23°C的光照培养室中培养14d后收集下部 的液体，用孔径为〇. 22 μ m的滤膜过滤后备用。
[0049] C、菌株ReTkl发酵滤液的制备：将ReTkl菌株在PDA培养基于28°C活化培养3d， 再接种到PDA斜面，在28°C培养5d，加入灭菌去离子水，制备孢子悬浮液，加入ImL的孢子 液（5 X IO5孢子/mL)于250mL的PDB培养基中，在180rpm、25°C的条件下培养6d，4000rpm， 15min收集上清备用。
[0050] D、孢子萌发抑制试验：将5mL的根分泌物、0. 5mL纯化的休眠孢子及ImL的ReTkl 发酵滤液（PDB为对照)加入灭菌的离心管中，调整pH值为6. 3,在24°C的黑暗条件下培养， 在不同的时间点在光学显微镜下检测孢子的萌发率。结果显示在4d后，对照组休眠孢子萌 发率达到73%，而ReTkl发酵滤液处理组休眠孢子萌发率仅为39. 74%，在6d后，对照组休 眠孢子萌发率达到100%，而ReTkl发酵滤液处理组休眠孢子萌发率仅为47. 31%，结果显示 ReTkl发酵滤液对油菜根肿病菌休眠孢子的萌发有明显的抑制作用。
[0051] 实施例6: 一种拟康宁木霉ReTkl菌剂在制备治疗或预防油菜根肿病药物中的应用，其步骤是： A、菌株ReTkl对油菜根肿病发生率的影响：准备灭菌的培养基质(购自镇江培蕾基质 科技发展有限公司），在播种前2d接种5mL的根肿菌休眠孢子（I X IO7休眠孢子/mL)在培 养基质中，接种混匀后基质中的休眠孢子浓度为2 X IO6休眠孢子/g。
[0052] B、在播种油菜后立即加入25mL的ReTkl分生孢子（IX IO7孢子/mL)，加入后基 质中ReTv2孢子浓度为I X 107孢子/g，加入25mL的无菌水为对照处理。之后将油菜置于 20-23°C的光照培养室中，培养14d后收集不同处理的油菜根部，仔细用清水清洗掉土壤后 用无菌水润洗3次，切成Icm的小段后置于70%的乙醇中保存。 C、用1% (体积比）的醋酸胭脂红进行染色后在显微镜下观察根毛中的侵染情况，每个 处理中至少计算40个根毛的侵染情况进行统计分析不同处理中的根肿病发生率。
[0053] D、菌株ReTkl对油菜根肿病的控制作用：按上述同样处理后的油菜置于20_23°C 的光照培养室中培养6周，每个处理均有60株油菜，且每处理重复3次。在第42d时进行病 害发生情况的统计。油菜根肿病分级标准为：〇级：没有根肿发生；1级：仅在侧根可见非常 小的肿瘤；2级：在主根和侧根均可见小的肿瘤；3级：在主根和侧根均可见中等到大的肿 瘤，植株长势衰弱；4级：出现非常严重的肿瘤，整个根部被完全破坏，植株长势严重衰弱。
[0054] 病情指数=Σ (病级数X该级病株数）/(调查总数X最高病情指病级数） XlOO 防效（％) =100%X (无菌水处理病情指数-处理病情指数）/无菌水处理病情指数 从试验结果可知，ReTkl菌剂处理可有效降低根肿菌休眠孢子在根毛中的侵染率(表 1，图4A)，在14d时对照组根毛侵染率达89. 1%，而ReTkl菌剂处理组仅为57. 1% ;同时病情 指数调查结果显示ReTkl菌剂处理对根肿病发生的非常明显的控制作用，在培养42d后的 调查结果显示，对照组的病情指数为62. 5,而ReTkl菌剂处理组的病情指数仅为28. 0,防效 达到55. 2% (表1，图4B)。
[0055] 表1本发明的菌株ReTkl菌剂处理对油菜根肿病的防治效果
【权利要求】
1. 一种拟康宁木霉ReTkl菌株，其特征在于：菌株为拟康宁木霉（fricAoofe/ma koningiopsis ) ReTkl, CCTCC NO ：M2014408〇
2. 根据权利要求1所述的一种拟康宁木霉ReTkl菌株中含有SEQ ID NO :1所示的核 苷酸序列。
3. 权利要求1所述的一种拟康宁木霉ReTkl菌剂的制备方法，其步骤是： A、 将ReTv2菌株在PDA培养基于28°C活化培养3d ; B、 再接种到PDA斜面，在28°C培养5d，加入灭菌的去离子水； C、 调整孢子液浓度为5 X 105孢子/mL，加入lmL的孢子液于250mL的PDB培养基中，在 180rpm、25°C的条件下培养6d，收集孢子制备成孢子悬浮液制剂； 所述步骤A、步骤B中的PDA和PDB培养基的组分及配比如下： PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂10 g，补充蒸馏水至1000 mL，调pH至 7. 0,在121°C高压蒸汽灭菌30min ; PDB培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，补充蒸馏水至1000 mL，调pH至7.0,在121°C 高压蒸汽灭菌30min。
4. 权利要求3所述的一种拟康宁木霉ReTkl菌剂在油菜生长的促进中的应用。
5. 权利要求3所述的一种拟康宁木霉ReTkl菌剂在制备治疗或预防油菜根肿病药物中 的应用。
6. 权利要求1 一种拟康宁木霉ReTkl菌株在发酵滤液对油菜根肿病菌休眠孢子萌发抑 制中的应用。
【文档编号】A01P21/00GK104277984SQ201410487407
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年9月22日 优先权日:2014年9月22日
【发明者】程家森, 穆罕默德·哈森, 王庆庆, 姜道宏, 付艳苹, 谢甲涛 申请人:华中农业大学