技术领域:
本发明涉及植物保护技术领域，具体是一种十字花科作物根肿病的接种鉴定方法。
背景技术：
由根肿菌(plasmodiophorabrassicae)引起的十字花科根肿病是一种重要的世界性植物病害。由该病引起的损失占世界十字花科作物总量的10％以上，在病区引起的损失一般在20％～90％。该菌主要危害十字花科植物的根部，能够产生吲哚乙酸和细胞分裂素等激素类物质，致使植物的根部组织膨大，形成根部肿瘤。我国是根肿病分布区域较广的国家，大部分省市的十字花科作物种植区均有分布，随着城乡一体化进程的加快，大面积蔬菜基地的建立，给根肿病大面积盛行创造了条件，也给十字花科作物的生产带来了巨大风险。据报道，不论十字花科蔬菜，还是世界四大油料作物之一的油菜，感染上该病的趋势都日益加重，损失也在逐年增加。因此，该病已成为十字花科作物可持续生产的一个重要制约因子。
本领域常识，根肿病为土传病害，其病原菌休眠孢子在土壤中可存活10年以上，因此防治十分困难。而防治根肿病的方法包括物理防治、农业防治、化学防治、生物防治等，目前这几种方法在生产上均有使用。且由于ph高于7.2时根肿菌的休眠孢子萌发受抑制，因此理论上通过撒石灰提高土壤ph值是防治根肿病的有效方法，然而石灰会破坏土壤结构，并且土壤ph值的改变效果受多种因素影响，因而以撒石灰作为唯一的防治根肿病措施时，防治效果的稳定性较差，且防效甚微，而采取综合防治方法，如施石灰和有机肥相结合并同时施用适量相应的微量元素，深耕轮作，改善土壤条件的方法程序复杂，因此在实际生产中综合应用较难推广。使用高效低毒的杀菌剂是目前较为简单且高效的防治十字花科作物根肿病的方法，并且该方法筛选出来的比较适合根种病的杀菌剂氟啶胺和氰霜唑可以在一定程度上减轻油菜根肿病的为害，但防治成本过高，只能用于种子处理。另外，利用微生物对根肿病进行的生物防治和利用植物材料进行的生物熏蒸也能够在一定程度上减轻根肿病的为害，但实际上防治根肿病的效果并不明显且成本偏高。
本领域技术人员一直致力于寻求一种简单、经济、高效的防治十字花科作物根肿病的方法，选育和种植抗病品种应运而生，而抗病性的新品种的筛选需要大量的筛选并获得抗源材料进而才能为新品种选育提供抗病亲本。本领域常识，根肿菌属专性寄主菌，存在小种分化现象，这给选育和种植抗根种病品种带来了一定的困难。因此对国内十字花科蔬菜主产区的根肿病菌进行生理小种鉴定，以期明确其生理小种的分布和优势小种；利用优势小种对十字花科蔬菜进行抗病性鉴定，为抗根肿病育种提供抗源材料，对培育抗根肿病品种具有重要意义。由于根肿菌生理小种的鉴定结果直接关系到抗根肿病品种的有效选育，因此国际上一直都非常重视。国内对根肿病的研究基本上侧重于发病规律和防治方面，对病原菌生理小种、发病机理、抗性育种等方面的报道还很少。
中国专利文献cn106520908a公开了一种高出萝卜苗期抗根肿病鉴定方法，该现有技术方法通过向杀菌并过筛后的土壤加入有机肥和过磷酸钙以及草木灰，播种，浇水再接种菌液，然后调查发病情况。然由于该现有技术为菌土接种，存在接种菌源量消耗大、结果稳定性不足的问题，从而给根肿病菌生理小种鉴定和品种抗性鉴定及抗性遗传机制研究带来不利影响。
技术实现要素：
为此，本发明的目的在于针对现有技术的菌土接种存在接种菌源量消耗大、结果稳定性不足的问题，从而给根肿病菌生理小种鉴定和品种抗性鉴定及抗性遗传机制研究带来不利影响的缺陷，提供一种十字花科作物根肿病的接种鉴定方法。
因此，本发明技术方案如下：
十字花科作物根肿病的接种鉴定方法，采用无菌干水苔作为接种培养根肿病菌的载体。
干水苔，油菜配方肥水溶液，以及纯泥炭配合使用；具体使用方式为：
所述纯泥炭覆盖在混有根肿菌的所述干水苔上，浸泡在所述油菜配方肥水溶液中的吸水绳持续提供水分。
所述油菜配方肥的总养分含量≥40％，其中n:p2o5:k2o＝25:7:8。
所述纯泥炭的ph＝6，粒径为0-6mm。
根肿菌与干水苔的数量关系为干水苔中的根肿菌休眠孢子量≥106/g。
所述吸水绳为吸水棉线。
具体步骤如下：
(1)取新鲜或-20℃冷冻保存的根肿菌，加无菌水匀浆后，倒入无菌干水苔中，混匀，使水苔中的休眠孢子量≥106/g，待用。
(2)将育苗盘架在装有所述油菜配方肥水溶液的托盘中，使育苗盘底不触及托盘中的水溶液，将浸泡在所述油菜配方肥水溶液中的棉线的一端置于育苗盘穴洞的干水苔和纯泥炭之中；
(3)播种十字花科作物种子，每穴播种5粒，每份材料种植6穴以上。
所述纯泥炭的含水量为60％。
所述吸水棉线的长度大于10cm。
病情级别划分标准如下：0级，根系正常，无肿瘤；1级，侧根有小肿瘤；3级，主根肿大，其直径小于2倍茎基部；5级，主根肿大，其直径是茎基部的2-3倍；7级，主根肿大，其直径是茎基部的3-4倍；9级，主根肿大，其直径是茎基部的4倍以上或肿大的根部出现变黑；
所述播种的十字花科作物的育苗环境条件：20℃黑暗12h，25℃光照12h。
本发明提供的十字花科作物根肿病的接种鉴定方法与现有技术相比具有如下特点：
1、本发明提供的十字花科作物根肿病的接种鉴定方法采用无菌干水苔作为接种培养根肿病菌的载体，较常规病土接种，菌源量耗费低，菌源量更稳定，不会因浇灌而改变。
2、本发明提供的十字花科作物根肿病的接种鉴定方法干水苔吸水后ph值为4.5-5.5之间，与田间发病土壤ph条件基本一致，无需进行ph调节。
3、本发明提供的十字花科作物根肿病的接种鉴定方法寄主植物根部生长环境得到了较好改善，水苔的透气性和基质的保水性融为一体，既满足了寄主生长对水份的需求，又排除了基质渍水含氧量不足，解决了水、气矛盾，减少了苗期猝倒病或其它根茎部病害的发生，保证了鉴定的有效苗数，提高了接种鉴定结果的可靠性。
4、本发明提供的十字花科作物根肿病的接种鉴定方法本发明的接种方法模拟自然条件下发病模式，但不受自然条件限制。
5、本发明提供的十字花科作物根肿病的接种鉴定方法接种效率高，可操作性强，接种方法和接种量一致，接种后发病均匀，结果稳定性好，病情判别灵敏度高，既适用于小样本材料的病原菌生理小种鉴定，也适用于大批量材料的品种抗病性鉴定，有利于病菌致病性分化研究和提高抗病材料的筛选效率。
6、本发明提供的十字花科作物根肿病的接种鉴定方法更高效、更稳定、鉴定结果更准确的人工接种鉴定的方法，为生理小种鉴定和抗性种质的筛选鉴定提供技术支撑。
7、本发明提供的十字花科作物根肿病的接种鉴定方法，适用于根肿病菌生理小种的鉴定和十字花科作物抗根肿病资源材料的筛选。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
说明：本发明所使用的所述油菜配方肥的总养分含量≥40％，其中n:p2o5:k2o＝25:7:8。
实施例1.
本实施例以两个不同病区的单个根瘤样品为研究对象，通过williams鉴别系统鉴定其小种属性。该鉴别方法包括4个鉴别寄主，均为十字花科芸薹属植物，分别为brassicaoleraceavar.capitata的两个品种jerseyqueen和badgershipper及b.napobrassica的两个品种laurentian和wilhelmsburger。
1、接种体制备
两个根瘤是由江西南昌和婺源采集到的白菜和油菜根肿病肿根组织。分别加少量无菌水匀浆后，与无菌干水苔(不需漂洗)混匀，调节水苔中的休眠孢子量达到106/g以上，待用。
2、接种方法
用0.5％的高锰酸钾浸泡育苗盘(穴深6cm，单穴口径6cm，单穴底径3cm)进行表面消毒，将育苗盘镶嵌在装有水溶液(无菌水+油菜配方肥)的矩形塑料托盘中，育苗盘底不触及托盘中的水溶液，在底部通气孔中插入长10cm以上的吸水棉线，使之一半在穴中(置于育苗盘穴洞的接种体和基质之中)，一半在穴外(延伸至托盘的水溶液中)。在育苗盘的穴洞中装入10g接种体，盖上已灭菌的纯泥炭营养基质(含水量60％)，播种根肿病菌鉴别系统4个品种(鉴定材料)，每穴播种5粒，每份材料种植6穴。育苗在20℃黑暗12h，25℃光照12h温室条件下生长，若托盘中水位降低，及时补水，确保吸水棉线接触到水溶液。
3、调查方法
调查记录播种日期，育苗40d后，调查各鉴定材料的病情，计算病情指数。按以下标准进行病情级别划分：0级，根系正常，无肿瘤；1级，侧根有小肿瘤；3级，主根肿大，其直径小于2倍茎基部；5级，主根肿大，其直径是茎基部的2-3倍；7级，主根肿大，其直径是茎基部的3-4倍；9级，主根肿大，其直径是茎基部的4倍以上或肿大的根部出现变黑。
病情指数＝∑(发病级代表值×各级病株数)÷(最高发病级代表值×调查总株数)×100
根据沈向群等(2009)和strandberg(1967)的方法，病情指数＜10为抗病(-)，病情指数≥10为感病(+)，williams十字花科根肿病菌鉴别系统小种划分如下表1所示。
表1williams十字花科根肿病菌鉴别系统小种划分
本实例鉴定结果，江西南昌采集到的根瘤为9号小种，婺源采集到的根瘤为4号小种。
实施例2.
本实施例以11个油菜品种材料为研究对象，采用本法鉴定其对根肿菌4号小种的抗性。
1、接种体制备
新鲜根瘤是由已鉴定为4号小种的根瘤扩繁获得。分别加少量无菌水匀浆后，与无菌干水苔(不需漂洗)混匀，使水苔中的休眠孢子量达到106/g以上，待用。
2、接种方法
用0.5％的高锰酸钾浸泡育苗盘(穴深6cm，单穴口径6cm，单穴底径3cm)进行表面消毒，架在10cm深装有水溶液(水中加入油菜配方肥)的托盘中，使育苗盘底不触及托盘中的水溶液，在底部通气孔中插入长度大于10cm的吸水棉线，使之一半置于育苗盘穴洞的接种体和基质之中，另一半延伸至托盘的水溶液中。育苗盘每穴洞中装入10g接种体，盖上已灭菌的纯泥炭营养基质(含水量60％)，播种鉴定材料。每穴播种5粒，每份材料种植6穴以上。鉴定材料(鉴别寄主)的育苗环境条件：20℃黑暗12h，25℃光照12h。若托盘中水位降低，需及时补水，确保吸水棉线接触到水溶液。
3、调查方法
调查记录播种日期，40d后，调查各鉴定材料的病情，计算病情指数。按以下标准进行病情级别划分：0级，根系正常，无肿瘤；1级，侧根有小肿瘤；3级，主根肿大，其直径小于2倍茎基部；5级，主根肿大，其直径是茎基部的2-3倍；7级，主根肿大，其直径是茎基部的3-4倍；9级，主根肿大，其直径是茎基部的4倍以上或肿大的根部出现变黑。按以下标准进行品种抗根肿病抗性评价：高抗(hr)，病情指数≤5；抗(r)，5＜病情指数≤10；中抗(mr)，10＜病情指数≤20；中感(ms)，20＜病情指数≤30；感(s)，30＜病情指数≤50；高感(hs)，病情指数＞50。
本实例结果如下表2所示。在鉴定的11份材料中，3份材料病情指数在10-20％之间，属于中抗材料；6份材料病情指数在20-30％之间，属于中感材料；2份材料病情指数在30-50％之间，属于感病材料。该实例的鉴定结果与这些材料播种在江西省婺源县4号小种油菜根肿病病田的实际发病情况基本一致。表明此根肿病抗性接种鉴定法是一种环境条件可控、接种效率高、结果准确和反应灵敏的方法，适用于十字花科作物种质资源筛选和品种抗病性鉴定。
表211个油菜品种材料对根肿菌4号小种的抗性的鉴定结果
对比例1.
期刊文献<中国蔬菜>中的一篇专题综述：丁云花,简元才等.十字花科蔬菜根肿病菌生理小种及接种方法.2005(8):29-31中公开了业内一直认为效果较好菌土法：在营养钵中育苗,用珍珠岩作基质,把菌根(用钮鲍尔血球计数板计数)磨碎和无菌土混合,使菌土中孢子含量为2×108·g-1,再在珍珠岩中挖1小穴,并在穴中放入20～30g菌土,然后把萌芽的种子播在菌土中。45～60d(天)后调查病情指数。
对比例1所公开的采用常用的发病较稳定的菌土法接种，接种菌土的浓度需达到107～108/g干土，且每穴须用到20g以上的菌土。
而本发明的方法只需达到106/g，每穴只需10g。
此外，本发明试验过程中，根瘤中的休眠孢子萌发出游动孢子，可随水流游动，由于育苗盘不接触水面，又没有灌水，所以绝大部分游动孢子都保留在育苗盘中，相比对比例1以及其他接种方法，浪费的菌量无疑是最少的。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。