本发明属于植物根系定殖测定技术领域，具体涉及一种检测植物根际促生细菌在根系定殖的方法。
背景技术：
植物促生根际细菌（plantgrowth-promotingrhizobacteria，pgpr）是能够在植物根际定殖，提高植物营养的可给性、抑制病原菌的生长或产生某些特殊的促生物质，促进植物种子萌发和植物生长、发育的一类细菌。大量研究表明，使用pgpr菌肥，能够减少化肥用量20%-30%，减少农药用量30%以上，农作物增产10%-80%，在发展可持续农业中的作用越来越受到重视。
检测pgpr在根际定殖的方法，常用的是固态基质法。用土壤、草炭或蛭石等固态基质（灭菌或未灭菌）栽培植物，接种待测菌剂，培养一段时间后，取植物根系，平板计数或显微观察细菌在根际的定殖情况。固态基质法检测pgpr在根际定殖的影响因素较多，具体包括不同实验室所用基质差异较大，基质和空气中其他微生物的影响，基质含水量难以稳定控制，浇水会造成菌体的淋失，根际土取样方法不易统一等，导致实验的可重复性差，不同实验室之间获得的数据难以比较。因此，亟待研究新的检测植物根际促生细菌在根系定殖的方法。
技术实现要素：
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种检测植物根际促生细菌在根系定殖的方法，该方法在无菌环境下液体震荡培养，培养条件稳定可控，取样方法标准统一。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测植物根际促生细菌在根系定殖的方法，其包括如下步骤：
1）小麦转接及液体培养：将在固体培养基中培养的小麦苗转接于液体ms培养基中，在白天25-28℃、光照16h，夜间15-20℃、黑暗条件下，于水平摇床上20-50rmp培养24-48h，然后添加1-3ml菌悬液，再继续培养5-10天；
2）小麦根系定殖细菌数量计数：取出小麦苗，用无菌滤纸将根部的培养基擦去，称重；然后置于组织研磨器中，添加2ml1×pbs缓冲液，研磨至浆状，采用lb固体培养基进行梯度稀释平板计数，计算每克鲜重小麦根的菌落形成单位数。
具体的，步骤1）中，在固体培养基中培养的小麦苗经下述步骤获得：固体ms培养基分装于100-500ml的组织培养瓶中，每瓶分装20-100ml，110-121℃高压灭菌10-30min；在超净工作台中，将催芽后的小麦种子播种于固体ms培养基表面，每瓶播种5-10粒种子；然后将播种后的组织培养瓶在白天25-28℃、光照16h，夜间15-20℃、黑暗的条件下培养至小麦株高5-8cm（约需培养5-10天）。
具体的，步骤1）中，菌悬液经下述步骤获得：30ml规格的试管中装tsb液体培养基5-10ml，110-121℃灭菌10-30min；接入1环恶臭假单胞菌uw4菌苔，28-37℃、200-260rmp培养12-24h，离心收集菌体，菌体用液体ms培养基洗涤，然后用液体ms培养基悬浮并调至od600值为1即得。
和现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明方法采用液体震荡培养植物，在培养液中接种典型的pgpr菌剂，培养结束采用平板计数法检测细菌在根际的定殖量。与固态基质法相比，液体震荡培养法能够在无菌环境下培养，培养条件可稳定控制，取样方法标准统一。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
实施例
材料与方法。
植物和菌株
小麦种子是市售小麦矮抗58；
细菌菌株为恶臭假单胞菌uw4（pseudomonasputidauw4）：美国农业研究菌种保藏中心保藏（保藏编号为nrrlb-50193，保藏日为2008年6月9日）。美国农业研究菌种保藏中心位于伊利诺伊州皮契里亚，由美国农业部农业研究中心支持的政府性质的菌种保藏中心，英文全称agrieultutalresearchserviceculturecolleetion，简称nrrl。uw4能够产生1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶，可在以1-氨基环丙烷-1-羧酸为唯一氮源的培养基如adf培养基中生长。
培养基
（1）液体ms培养基（l）：kno31900mg，nh4no31650mg，kh2po4170mg，mgso4·7h2o370mg，cacl2·2h2o440mg，ki0.83mg，h3bo36.2mg，mnso4·4h2o22.3mg，znso4·7h2o8.6mg，na2moo4·2h2o0.25mg，cuso4·5h2o0.025mg，cocl2·6h2o0.025mg，na2-edta37.25mg，feso4·7h2o27.85mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，盐酸硫胺素0.1mg，盐酸吡哆醇0.5mg，烟酸0.5mg，蔗糖30g；
（2）固体ms培养基（l）：液体ms培养基中添加琼脂7g；
（3）tsb液体培养基：大豆蛋白胨3g，胰蛋白胨17g，葡萄糖2.5g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，加蒸馏水1000ml，ph7.1－7.5；
（4）lb固体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，nacl10g，琼脂20g，去离子水1000ml；
（5）adf培养基：
a液（微量元素）：mnso4·h2o11.19mg，h3bo310mg，cuso4·5h2o78.22mg，znso4·7h2o124.6mg，moo310mg，溶解于100ml超纯水（无菌）中，-4℃保存；
b液（feso4）：feso4·7h2o100mg溶于10ml超纯水（无菌）中，需现用现配；
a、b溶液各取0.1ml，依次加入na2hpo46.0g，kh2po44.0g，1-氨基环丙烷-1-羧酸2.0g，mgso4·7h2o0.2g，葡糖酸2.0g，葡萄糖2.0g，柠檬酸2.0g，琼脂20g，超纯水定容至1000ml，调至ph7.2，121℃灭菌20min。
液体震荡培养。
1.3.1小麦种子预处理
挑选籽粒饱满、胚芽完整的小麦种子于干净的平板中。添加95%的酒精使种子完全浸泡，处理30s后，用无菌水洗涤三次，用高压灭菌的滤纸吸取表面水分。用过滤除菌的0.1%升汞浸泡5min，然后用无菌水清洗5遍，在超净工作台中风干。在无菌的平板中平铺一张大小合适的无菌滤纸，将风干后的小麦种子平铺到滤纸上，向平板中添加10ml无菌水。静置于25℃恒温培养箱催芽24h。
1.3.2固体培养基育苗
固体ms培养基分装于300ml的组织培养瓶中，每瓶分装50ml。121℃高压灭菌20min。在超净工作台中，将催芽后的小麦种子播种于固体ms培养基表面，每瓶播种5粒种子。将播种后的组织培养瓶在白天25-28℃、光照16h，夜间15-20℃、黑暗条件下，培养至小麦株高5-8cm，培养时间8-10天。
1.3.3菌悬液制备
30ml规格的试管中装tsb液体培养基5ml，121℃灭菌30min。接入1环恶臭假单胞菌uw4菌苔，28℃、220rmp培养12h。8000rpm、离心5min收集菌体，菌体用液体ms培养基洗涤3次，用液体ms培养基悬浮并调至od600值为1。
1.3.4小麦转接及液体培养
300ml组织培养瓶每瓶分装液体ms培养基50ml，内置一个带孔漂板，121℃高压灭菌20min。将在固体培养基中培养的小麦苗转接于液体ms培养基中，每瓶液体培养基中接3棵苗。组织培养瓶在白天25-28℃、光照16h，夜间15-20℃、黑暗的条件下于水平摇床上40rmp培养24h。在超净工作台中添加1ml菌悬液，再继续培养7天。同时接1ml无菌水用做对照。
1.3.5小麦根系定殖细菌数量计数
将小麦苗从液体ms培养基中取出，用无菌滤纸将根部的培养基轻轻擦拭去，置于分析天平中测定根的重量。每个组织培养瓶中取3棵小麦的根一起置于组织研磨器中，添加2ml1×pbs缓冲液，研磨至浆状。采用lb固体培养基进行梯度稀释平板计数，计算每克鲜重小麦根的菌落形成单位数。
固体培养。
1.4.1种子消毒
挑选籽粒饱满、胚芽完整的小麦种子于干净的平板中。添加95%的酒精使种子完全浸泡，处理30s后，用无菌水洗涤三次，用高压灭菌的滤纸吸取表面水分。用过滤除菌的0.1%升汞浸泡5min，然后用无菌水清洗5遍，在超净工作台中风干。
1.4.2细菌接种
取1.3.3制备的菌悬液，4℃8000rpm离心5min，离心收集菌体，用无菌水洗涤2次，悬浮于无菌水中，调节菌数为109cfu/ml。将小麦种子于菌悬液中浸泡3-4h，以无菌水为对照。使种子充分吸胀，而后过滤掉菌悬液，用浸润无菌水的纱布盖在种子表面，使种子保持潮湿环境，置于25–28℃恒温培养箱，直到种子露白。
1.4.3蛭石盆栽
蛭石与草炭土以干重质量比1:1混匀，浇足水分后，121℃灭菌3h。分装于72穴聚乙烯育苗盘中，将处理过的种子播种，每穴1粒,播深1cm。将植株置于白天22-25℃、光照16h，夜间15-20℃。每天浇5ml无菌水。第4d、8d和12d接种菌悬液5ml。
小麦根系定殖细菌数量计数
盆栽15-21d，小心将植株根系全部挖出。抖落根系上附着的土粒，置于分析天平中测定根的重量。然后，置于组织研磨器中，添加2ml1×pbs缓冲液，研磨至浆状。采用lb固体培养基进行梯度稀释平板计数，计算每克鲜重小麦根的菌落形成单位数（总菌数）。用adf固体培养基进行梯度稀释平板计数，计算每克鲜重小麦根的菌落形成单位数（1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶产生菌菌数）。
结果
2.1液体震荡培养小麦根系定殖细菌数量
从表1可见，没接菌的无菌水对照组，在小麦根际没有检测出定殖的细菌，表明整个实验过程能够很好地维持无菌条件。接种恶臭假单胞菌uw4，小麦根际可以检测出定殖的细菌，3个组织培养瓶中小麦根际定殖的细菌数之间的变异系数小于15%，实验误差比较小，表明液体震荡培养植物检测根际定殖的pgpr是可行的。
表1液体震荡培养小麦根际定殖细菌数
2.2固体培养小麦根系定殖细菌数量
从表2和表3可以看出，尽管实验结果的变异系数比较小，但由于不能做到在无菌条件下操作，未接菌的对照植物根系污染有1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶产生菌和其他细菌，影响实验结果的真实性。
表2固体培养小麦根际定殖总细菌数
表3固体培养小麦根际定殖1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶产生菌菌数