本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种高产细菌纤维素的发酵方法。
背景技术：
19世纪末，英国科学家布朗在实验时首次发现细菌纤维素。细菌纤维素和植物纤维素一样，都是由葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接起来形成的大分子，而且相较于植物纤维素，细菌纤维素有许多独特的性质。首先，细菌纤维素的纯度很高，几乎不含有半纤维素、木质素和果胶等杂质；其次，细菌纤维素的弹性模量很高，一般是植物纤维素的的数倍乃至十数倍，高弹性模量赋予了细菌纤维素抗张强度高的特性；细菌纤维素具有极强的吸水性和透水透气性，能吸收60-700倍其干重的水分；细菌纤维素具有较高的生物相容性、适应性和良好的生物可降解性；最后，细菌纤维素在合成过程中具有可调控性，可根据要求，对细菌纤维素进行性质改造。现在，细菌纤维素已广泛应用于食品、造纸、医药等领域，取得了很大的经济效益。但是微生物发酵生产细菌纤维素存在着产量低、发酵周期长等问题，其产量也不能满足当下的需要，因此提高细菌纤维素的产量显得尤为重要。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够显著提高细菌纤维素产量的方法，以克服目前细菌纤维素发酵生产过程中产量较低的现状。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种高产细菌纤维素的发酵方法，将汉逊氏葡糖酸醋杆菌与酵母菌混合接种于改良bsh发酵培养基中28-30℃静置培养6-10天发酵生产细菌纤维素；其中，所述的酵母菌为酿酒酵母菌或产朊假丝酵母菌。
其中，所述的汉逊氏葡糖酸醋杆菌为cctccno：m2016696，分类命名为汉逊氏葡糖酸醋杆菌(gluconacetobacterhansenii)a-2，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期2016年11月29日，其16srrna序列如seqidno：1所示。
其中，所述的酿酒酵母为cgmcc2.3857，购自于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
其中，所述的产朊假丝酵母为atcc10231，购自于美国模式培养物集存库。
其中，汉逊氏葡糖酸醋杆菌与酵母菌混合接种总量为10％v/v。
其中，酿酒酵母与汉逊氏葡糖酸醋杆菌混合接种的菌体个数比为1∶110～2560，优选1∶1225。
其中，产朊假丝酵母与汉逊氏葡糖酸醋杆菌混合接种的菌体个数比为1∶2～20，优选1∶3。
其中，所述汉逊氏葡糖酸醋杆菌与所述酵母菌混合接种前，经过如下活化培养和扩大培养：
(1)将汉逊氏葡糖酸醋杆菌和酵母菌菌株分别划线转接到bsh和ypd固体培养基上，在30℃下活化两次；
(2)挑取两个活化好的汉逊氏葡糖酸醋杆菌和酵母菌菌株单菌落置于bsh和ypd液体培养基中，在30℃、150r/min的条件下培养24h用于制备种子液，将制备好的汉逊氏葡糖酸醋杆菌种子液以10％v/v的接种量扩大培养2次，将制备好的酵母菌种子液以10％v/v的接种量扩大培养1次。
本发明所述的bsh培养基配方为：葡萄糖，20g/l；鱼粉蛋白胨，5g/l；酵母浸粉，5g/l；磷酸氢二钠，2.7g/l；柠檬酸，1.15g/l，ph5.0。
本发明所述的ypd培养基配方为：酵母浸粉，5g/l；胰蛋白胨，10g/l；葡萄糖，20g/l，自然ph。
本发明所述的改良bsh发酵培养基配方为：鱼粉蛋白胨，5.0g/l；酵母浸粉，40.0g/l；葡萄糖，20.0g/l；十二水合磷酸氢二钠，2.7g/l；一水合柠檬酸，1.15g/l，ph5.0。
有益效果：本发明通过将汉逊氏葡糖酸醋杆菌与一定量的酿酒酵母、产朊假丝酵母混合接种到改良bsh发酵培养基中培养，其细菌纤维素产量要显著高于汉逊氏葡糖酸醋杆菌的单菌发酵，最高时纤维素膜干重可提高500％以上。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例所用的菌株来源如下：
所述的汉逊氏葡糖酸醋杆菌为cctccm2016696，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期2016年11月29日。
所述的酿酒酵母为cgmcc2.3857，购自于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
所述的产朊假丝酵母为atcc10231，购自于美国模式培养物集存库。
实施例1：
1.醋酸菌菌株活化：将保藏在4℃冰箱中的汉逊氏葡糖酸醋杆菌划线接种到bsh平板上，在30℃下培养5天用于菌株活化，此过程重复两次；
2.酵母菌菌株活化：将保藏在4℃冰箱中的酿酒酵母划线接种到ypd平板上，在30℃下培养2-3天用于菌株活化，此过程重复两次；
3.醋酸菌种子液的制备：挑取两个活化好的汉逊氏葡糖酸醋杆菌单菌落于装有100mlbsh液体培养基的250ml锥形瓶中，在30℃、150r/min的条件下培养24h用于制备种子液，将制备好的种子液以10％的接种量扩大培养两次；
4.酵母菌种子液的制备：挑取两个活化好的酿酒酵母单菌落于装有100mlypd液体培养基的250ml锥形瓶中，在30℃、150r/min的条件下培养24h用于制备种子液，将制备好的种子液以10％的接种量扩大培养一次；
5.发酵培养基的制备：按照配方制备改良bsh发酵培养基，分装到100ml锥形瓶中，分装体积为18ml，在121℃下灭菌20min。改良bsh液体培养基配方为：鱼粉蛋白胨，5.0g/l；酵母浸粉，40.0g/l；葡萄糖，20.0g/l；十二水合磷酸氢二钠，2.7g/l；一水合柠檬酸，1.15g/l，ph5.0；
6.发酵培养基的接种：将汉逊氏葡糖酸醋杆菌种子液和酿酒酵母种子液(将酿酒酵母培养液稀释100倍)以不同的体积比混合接种到改良bsh发酵培养基中，混合均匀后置于30℃下静置培养10天，总接种量为10％(v/v)；
7.微生物个数的统计：利用稀释涂布平板统计微生物个数的方法统计汉逊氏葡糖酸醋杆菌和酿酒酵母种子液中的微生物个数；
8.纤维素膜的收获与处理：将发酵结束后培养基表面形成的纤维素膜取出，用蒸馏水反复冲洗，以除去膜表面的培养基、细菌菌体和其他杂质，再用0.1mol/l的氢氧化钠溶液在80℃的条件下浸泡2h，以除去菌体蛋白和残余的培养基，此时纤维素膜呈现呈乳白色半透明状，然后再用蒸馏水和0.5％的乙酸反复冲洗，直至纤维素膜呈中性；
9.纤维素膜湿重的确定：将处理好的纤维素膜置于洁净平板上，在室温下放置1h后翻转，再次放置1h，然后将平板斜放30min，用吸水纸吸干平板底部的非结合水后置于电子天平上称重，所得数值减去平板自重即得纤维素膜的湿重；
10.纤维素膜干重的确定：将称量过后的纤维素湿膜置于80℃烘箱中烘干，6小时后每隔10min取出，称量其重量，直至得到的重量不再变化为止，所得数值减去平板自重即得纤维素膜的干重；
11.纤维素膜持水力的计算：将得到的纤维素膜湿重减去纤维素膜干重，得到的重量比上纤维素膜干重即为持水力；
12.实验数据的分析：将收获的纤维素膜处理后得到的数据如下表1。
表1.汉逊氏葡糖酸醋杆菌与酿酒酵母混合发酵的实验结果
汉逊氏葡糖酸醋杆菌和酿酒酵母混合发酵的实验结果表明，和对照组相比，实验组能显著提高纤维素膜的产量。在湿重上，最高的实验组纤维素产量为933.306g/l，比对照组的186.826g/l提高了399.559％；在干重上，最高的实验组为18.543g/l，比对照组的3.036g/l提高了510.771％。
在菌体个数统计实验中，酿酒酵母原液中的菌体浓度为2.25×108/ml，汉逊氏葡糖酸醋杆菌原液中的菌体浓度为2.40×108/ml。混菌发酵用的酿酒酵母培养液为原液稀释100倍所得，汉逊氏葡糖酸醋杆菌培养液为原液。汉逊氏葡糖酸醋杆菌的培养液与酿酒酵母培养液的体积之比为9.2ml：0.8ml时，纤维素膜的产量最高，而此时菌体个数比为2.25×106/ml×0.8ml：2.40×108/ml×9.2ml，即当酿酒酵母和汉逊氏葡糖酸醋杆菌的菌体个数比约为1∶1225时，纤维素的干湿重产量最高，且当混菌比例在1∶2560至1∶110之间时均可以获得可观的产量。
实施例2：
1.醋酸菌菌株活化：将保藏在4℃冰箱中的汉逊氏葡糖酸醋杆菌划线接种到bsh平板上，在30℃下培养5天用于菌株活化，此过程重复两次；
2.酵母菌菌株活化：将保藏在4℃冰箱中的产朊假丝酵母划线接种到ypd平板上，在30℃下培养2-3天用于菌株活化，此过程重复两次；
3.醋酸菌种子液的制备：挑取两个活化好的汉逊氏葡糖酸醋杆菌单菌落于装有100mlbsh液体培养基的250ml锥形瓶中，在30℃、150r/min的条件下培养24h用于制备种子液，将制备好的种子液以10％的接种量扩大培养两次；
4.酵母菌种子液的制备：挑取两个活化好的产朊假丝酵母单菌落于装有100mlypd液体培养基的250ml锥形瓶中，在30℃、150r/min的条件下培养24h用于制备种子液，将制备好的种子液以10％的接种量扩大培养一次；
5.发酵培养基的制备：按照配方制备改良bsh发酵培养基，分装到100ml锥形瓶中，分装体积为18ml，在121℃下灭菌20min。
6.发酵培养基的接种：将汉逊氏葡糖酸醋杆菌种子液和产朊假丝酵母种子液(将酿酒酵母培养液稀释10倍)以不同的体积比混合接种到改良bsh发酵培养基中，混合均匀后置于30℃下静置培养10天，总接种量为10％(v/v)；
7.微生物个数的统计：利用稀释涂布平板统计微生物个数的方法统计汉逊氏葡糖酸醋杆菌和产朊假丝酵母种子液中的微生物个数；
8.纤维素膜的收获与处理：将发酵结束后培养基表面形成的纤维素膜取出，得用蒸馏水反复冲洗，以除去膜表面的培养基、细菌菌体和其他杂质，再用0.1mol/l的氢氧化钠溶液在80℃的条件下浸泡2h，以除去菌体蛋白和残余的培养基，此时纤维素膜呈现呈乳白色半透明状，然后再用蒸馏水和0.5％的乙酸反复冲洗，直至纤维素膜呈中性；
9.纤维素膜湿重的确定：将处理好的纤维素膜置于洁净平板上，在室温下放置1h后翻转，再次放置1h，然后将平板斜放30min，用吸水纸吸干平板底部的非结合水，即得纤维素膜的湿重；
10.纤维素膜干重的确定：将称量过后的纤维素湿膜置于80℃烘箱中烘干，6小时后每隔10min取出，称量其重量，直至得到的重量不再变化为止；
11.纤维素膜持水力的计算：将得到的纤维素膜湿重减去纤维素膜干重，得到的重量比上纤维素膜干重即为持水力；
12.实验数据的分析：将收获的纤维素膜处理后得到的数据如下表2。
表2汉逊氏葡糖酸醋杆菌与产朊假丝酵母混合发酵的实验结果
汉逊氏葡糖酸醋杆菌和产朊假丝酵母混合发酵的实验结果表明，和对照组相比，实验组能显著提高纤维素膜的产量。在湿重上，最高的实验组纤维素产量为967.115g/l，比对照组的196.479g/l提高了392.223％；在干重上，最高的实验组为23.021g/l，比对照组的3.182g/l提高了623.476％。
在菌体个数统计实验中，产朊假丝酵母的菌体浓度为2.9×108/ml，汉逊氏葡糖酸醋杆菌的菌体浓度为1.7×108/ml。混菌发酵用的产朊假丝酵母培养液为稀释5倍所得，汉逊氏葡糖酸醋杆菌培养液为原液。当产朊假丝酵母培养液和汉逊氏葡糖酸醋杆菌的培养液体积之比为5.2ml：4.8ml时，纤维素膜的产量最高，而此时菌体个数比为5.8×107/ml×4.8ml：1.7×108/ml×5.2ml，即当产朊假丝酵母和汉逊氏葡糖酸醋杆菌的菌体个数比约为1：3时，纤维素的干湿重产量最高，且当混菌比例在1∶20至1∶2之间时均可以获得可观的产量。
sequencelisting
<110>南京工业大学
<120>一种高产细菌纤维素的发酵方法
<130>sg170116001
<160>1
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>1361
<212>dna
<213>汉逊氏葡糖酸醋杆菌
<400>1
atgcaagtcgcacgaacctttcggggttagtggcggacgggtgagtaacgcgtagggatc60
tgtccatgggtgggggataactttgggaaactgaagctaataccgcatgatacctgaggg120
tcaaaggcgcaagtcgcctgtggaggaacctgcgttcgattagctagttggtggggtaaa180
ggcctaccaaggcgatgatcgatagctggtctgagaggatgatcagccacactgggactg240
agacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgcaag300
cctgatccagcaatgccgcgtgtgtgaagaaggttttcggattgtaaagcactttcagcg360
gggacgatgatgacggtacccgcagaagaagccccggctaacttcgtgccagcagccgcg420
gtaatacgaagggggcaagcgttgctcggaatgactgggcgtaaagggcgcgtaggcggt480
tgttacagtcagatgtgaaattcccgggcttaacctgggggctgcatttgatacgtgacg540
actagagtgtgagagagggttgtggaattcccagtgtagaggtgaaattcgtagatattg600
ggaagaacaccggtggcgaaggcggcaacctggctcatgactgacgctgaggcgcgaaag660
cgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgatgtgtgctgg720
atgttggatggcttggccattcagtgtcgtagttaacgcgataagcacaccgcctgggga780
gtacggccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagca840
tgtggtttaattcgaagcaacgcgcagaaccttaccaggacttgacatgcggaggctgtg900
tccagagatgggcatttctcgcaagagacctccagcacaggtgctgcatggctgtcgtca960
gctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgcctttagttg1020
ccagcacgtctgggtgggcactctaaaggaactgccggtgacaagccggaggaaggtggg1080
gatgacgtcaagtcctcatggcccttatgtcctgggctacacacgtgctacaatggcggt1140
gacagtgggaagccaggcagcgatgccgagcggatctccaaaagccgtctcagttcggat1200
tgcactctgcaactcgagtgcatgaaggtggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgcc1260
gcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagttggtttg1320
accttaagccggtgagcgaaccgcaaggacgcagccgacca1361