具有灭活的dna错配修复系统的真菌细胞的制作方法

专利名称：具有灭活的dna错配修复系统的真菌细胞的制作方法
技术领域：
一种利用新颖的克隆基因制备丝状真菌细胞DNA文库的方法，该基因参与丝状真菌细胞的错配修复系统。
背景技术：
错配修复系统是细胞内识别新合成的双链DNA序列中的错配的系统。
错配修复系统然后可利用甲基化的“旧”株系作为模板纠正被察觉为错误的错配，或者可以介导包含错配的双链DNA序列的降解。
独立于精确的机理之外，最终结果将是“错配修复系统”将限制细胞内的“多样性”，多样性表现为包含错配的双链DNA序列。
例如，包含单一错配的双链DNA序列代表细胞内两种不同的DNA序列的多样性。如果错配修复系统纠正错配，那么在细胞内将只有一种DNA序列。
或者，如果错配修复系统介导这样一种双链DNA序列的降解，那么多样性将消失。参见图1，其以图解方式阐述错配修复系统在细胞内是如何工作的。
所以，如果包含错配的双链DNA序列代表目的DNA文库，那么当转化(放置)到具有活性错配修复系统的细胞内时，该文库的多样性可以受到限制。
本领域提供了一种该问题的解决方案，即制备其中错配系统已失活的细胞。
EP449923描述了其中错配系统被灭活的细菌细胞。
WO97/37011描述了其中错配系统被灭活的酵母细胞。参见该文献的工作例。
WO97/05268描述了其中错配系统被灭活的小鼠细胞。参见该文献的工作例。
发明概述本发明所要解决的问题是提供制备丝状真菌细胞DNA文库的改进策略。包含这样一种DNA文库的丝状真菌细胞群体因而可以用于选择目的多肽。还可以选择具有特定性质的多核苷酸序列，例如具有改变/改进性质的启动子、终止子和其它调节元件。
解决方案的基础是发明人已经克隆了参与丝状真菌细胞错配修复系统的新基因。此外，该基因是第一种被克隆的参与丝状真菌细胞错配修复系统的基因。
通过灭活丝状细胞中的这种基因，有可能获得这样的丝状细胞，它在其错配修复系统中有缺陷，并且对制备丝状真菌细胞中的DNA文库来说是非常有用的。
该基因包含非常有特性的编码如SEQ ID NO 2之683-758位所示多肽序列的DNA序列。
该DNA已经用于克隆编码如SEQ ID NO 2之1-940位所示多肽序列的全长基因。参见本文的工作例(见下)。
如本文工作例所述被克隆的基因是从米曲霉丝状真菌细胞克隆的基因。
不过，基于本文所提供的新序列信息，对本领域技术人员来说从其他丝状真菌细胞克隆相似的同源基因是例行工作，例如使用标准的杂交或PCR技术，优选地使用编码SEQ ID NO 2之683-758位所示多肽序列的DNA序列作为制备杂交探针或PCR引物的基础。
因此，本发明在第一方面涉及丝状真菌细胞，其中参与错配修复系统的基因已经被灭活，该参与错配修复系统的基因包含(a)编码SEQ ID NO 2之683-758位所示多肽序列的DNA序列；或(b)编码至少70％等同于SEQ ID NO 2之683-758位的多肽序列的DNA序列；本发明在第二方面涉及丝状真菌细胞，其中参与错配修复系统的基因已经被灭活，该参与错配修复系统的基因包含(a)编码SEQ ID NO 2之1-940位所示多肽序列的DNA序列；或(b)编码至少70％等同于SEQ ID NO 2之1-940位的多肽序列的DNA序列。
如上所述，本发明第一或第二方面的丝状真菌细胞非常适合于制备丝状真菌细胞中目的DNA文库。
因此，本发明在第三方面涉及制备丝状真菌细胞群体的方法，其中群体中的个体细胞分别包含代表目的DNA文库的不同目的DNA序列，该方法包括下列步骤(a)分别将不同的目的DNA序列放置在包含本发明第一或第二方面丝状真菌细胞的丝状真菌细胞群体中；(b)将(a)群体生长一段时间，使群体中单个目的DNA序列在本发明第一或第二方面错配修复系统基因已被灭活的条件下复制至少一次。
图1阐述了如第三方面步骤(b)所述使单个错配修复灭活型丝状真菌细胞复制目的DNA至少一次的优点之一。图1可以看到，如本文所述使用丝状真菌错配修复灭活细胞的第三方面方法使其中最终异型双链DNA错配未被纠正的DNA文库的制备成为可行。所得DNA文库比在不具有灭活的错配修复系统的丝状真菌细胞中制得的DNA文库具有更高多样性(参见图1)。目的DNA序列的复制意味着两股都被复制，使得分别产生的两套双链DNA，每套均基于两条原始股之一。
其中群体中的个体细胞包含上述目的DNA文库的丝状真菌细胞群体可以用于选择目的多肽。
因此，本发明在第四方面涉及生产目的多肽的方法，其包括第三方面的步骤，且其中目的DNA序列编码目的多肽，该方法进一步包括下列步骤(c)从第三方面步骤(b)所得丝状真菌细胞群体中选择所需的目的多肽。
第四方面方法的优点是，目的多肽是从表达该多肽的丝状真菌细胞中选择的。所以，可直接知道所述多肽可以从丝状真菌细胞表达，如果随后需要在丝状真菌细胞内大规模制备多肽，那么这是有用的。当DNA文库编码从丝状真菌细胞衍生的目的多肽时，这一点是特别值得关注的，因为已知在工业上，丝状真菌多肽优选地是在丝状真菌细胞内制备的，且产量高。
这与类似的选择方法相反，所述类似方法例如使用酵母细胞的方法。这里唯一已知的是所选择的多肽能够在酵母中被表达，以后在丝状真菌细胞中的表达可能产生问题，尤其当需要高产量时。
定义
下面提供上述本发明各方面技术特征的定义。
术语“基因”此处表示基因(DNA序列)能够在所述细胞内被表达为多肽。因此，所述基因序列将被定义为开始于起始密码子(通常为“ATG”、“GTG”或“TTG”)，结束于终止密码子(通常为“TAA”、“TAG”或“TGA”)的开发读码框。
如本领域已知，为了表达所述基因，必须有与该基因相连的元件，它们是该基因在细胞内表达所必需的。这样的标准元件可以包括启动子、核糖体结合位点、末端序列，还可以是本领域已知的其他元件。
按照本领域，术语“错配修复系统”此处应当被理解为细胞内识别双链DNA序列错配的系统。例如参见WO97/37011第1页第21-28行。错配修复系统要么纠正被发现为错误的错配，例如通过使用甲基化“旧”链作为模板，要么它可以介导包含错配的双链DNA序列的降解。
独立于精确的机理之外，最终结果将是“错配修复系统”将限制细胞内的“多样性”，多样性表现为包含错配的双链DNA序列。
例如，包含单一错配的双链DNA序列代表细胞内两种不同的DNA序列的多样性。如果错配修复系统纠正该错配，那么在细胞内将只有一种DNA序列。或者，如果错配修复系统介导这样一种双链DNA序列的降解，那么多样性将消失。
被参与错配修复系统的基因编码的多肽通过与错配目的的机理识别该错配。
因此，检验如本文所述丝状真菌细胞的错配修复系统是否已灭活的测定法采用“凝胶移动(shift)试验”，或称“凝胶推迟试验”。这是本领域所用的一种标准试验。参见WO97/05268第16、17和25页。
这类试验的原理是细胞提取物从下列制成(a)丝状真菌细胞，其中如本文所述参与错配修复系统的基因是灭活的；和(b)相应的丝状真菌细胞，其中的基因不是灭活的。这些提取物然后与含有碱基对错配的G∶T、G∶A、G∶G、A∶C的寡核苷酸和超螺旋TG二核苷酸结合/混合，在非变性凝胶上进行测定。
如果凝胶移动(shift)试验证明所含基因未灭活的对照丝状真菌细胞包含与任意上述寡核苷酸结合的任意蛋白质，并且这些结合蛋白在所含如本文所述参与错配修复系统的基因是灭活的丝状真菌细胞中没有见到，那么确认后者错配修复系统是灭活的。
本文工作例1提供了适合的凝胶移动(shift)试验的详细说明。
涉及术语“编码至少70％等同于SEQ ID NO 2之683-758位所示多肽序列的多肽序列的DNA序列”和“编码至少70％等同于SEQ ID NO 2之1-940位所示多肽序列的多肽序列的DNA序列”的序列同一性被确定为两种序列之间的等同程度，其说明第一种序列从第二种衍化而来。同一性可以适当借助本领域已知的计算机程序加以测定，例如GCG程序包中的GAP(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，GeneticsComputer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)《分子生物学杂志》48，443453)。GAP采用下列多肽序列比较设置GAP生成罚分3.0，GAP延长罚分0.1，结果，按照发明的第一方面，针对SEQ ID NO 2之683-758位所示氨基酸序列，或者按照发明的第一方面，针对SEQ ID NO 2之1-940位所示氨基酸序列，被本发明相似DNA序列编码的多肽所表现的等同程度优选为至少70％，更优选为至少80％，更优选为至少90％，更优选为至少95％，尤其为至少97％。
术语“DNA文库”此处表示至少两种不同DNA序列的文库。出于多数实用目的，文库必须是更大的。因此，DNA文库优选地包含至少1000种不同的DNA序列，更优选为至少10000种不同的DNA序列，进而更优选为至少100000种不同的DNA序列。
涉及本发明第三方面方法步骤(a)的术语“分别将不同的目的DNA序列放置在丝状真菌细胞群体中”此处应当在“它不是等同于放置在丝状真菌细胞群体中的目的DNA序列”这一意义上加以广泛理解。在本文的上下文中，涉及使用错配修复缺陷型细胞制备DNA文库的方法时，该术语应当优选地表示这样一种情形，其中丝状真菌细胞群体内的细胞包含至少两种不同的目的DNA序列，它们是部分同源的，以致它们能够在细胞内彼此杂交/重组。测定这类序列如何部分同源以获得所述细胞内的重组是本领域技术人员的常识。
实例可以是将与染色体DNA序列部分同源的单股寡核苷酸序列放置在细胞内，或者将包含错配(例如包含在载体内)的双链DNA序列放置在细胞内。见下关于这些例子的进一步说明。
将这些DNA序列放置在丝状细胞内的具体实验方法可以按照多种适当技术中的任一种进行，例如转化技术。
按照本发明第三方面步骤(b)，术语“将(a)群体生长一段时间，使群体中单个目的DNA序列在错配修复系统基因已被灭活的条件下复制至少一次”表示，在个体细胞已经自我复制至少一次之后，错配修复系统可以被重新激活，而不丧失该方法的优点。图1阐述了其中的技术原因。本例中，将包含单一错配的双链DNA序列放置在丝状细胞中。当细胞已经在错配修复系统基因已被灭活的条件下复制一次之后，双链DNA内两种不同的单股DNA序列分别被复制，得到两种不同的双链序列，每个复制细胞中含有其一，没有任何错配。因此，由于这样的细胞不包含具有错配的目的双链DNA序列，因此不存在维持错配修复系统灭活的技术需要。
下面描述本发明优选的实施方案，仅供例证。


图1本图阐述将包含单一错配的双链DNA序列放置在丝状细胞中的实例。当细胞已经在错配修复系统基因已被灭活的条件下复制一次之后，双链DNA内两种不同的单股DNA序列分别被复制，得到两种不同的双链序列，每个复制细胞中含有其一，没有任何错配。相反，在错配修复系统是活性的细胞中，双链内的错配被纠正了。
图2本图显示从所克隆的PCR片段衍生的三种不完全米曲霉多肽序列‘msh2’Ao-co110/13/15。将这三种不完全多肽序列与其他两种已知错配修复蛋白人错配修复蛋白，即msh2-human.p；和酿酒酵母错配修复蛋白，即S.c.msh2的不完全多肽序列对比排列。图中带下划线的序列衍生自PCR片段的构建。
图3本图显示公认的(putative)米曲霉错配修复蛋白(Ao.MSH2)的推定(proposed)多肽序列与三种已知的错配修复蛋白人类来源(msh2-human.p)、鼠类来源(msh2-mus.p)和酵母来源(S.c.msh2)多肽序列的排列。
发明的详细说明如本文所述的丝状真菌细胞，其中如本文所述参与错配修复系统的基因已被灭活。
参与错配修复系统的基因的灭活如本文所述参与错配修复系统的新型基因可以通过技术人员已知的多种已知技术之一加以灭活。
本发明的实施方案涉及如本文所述的丝状真菌细胞，其中参与错配修复的基因是有缺陷的。
当DNA序列已知时，大量使基因缺陷的方法都是技术人员已知的。这些方法包括删除基因的一部分DNA序列；通过删除或插入核苷酸引入移码突变；引入终止密码子等。
本发明优选的实施方案涉及如本文所述的丝状真菌细胞，其中参与错配修复的基因已被暂时灭活。
与上述类似，可做到这一点的大量方法都是技术人员已知的，包括在基因上游插入可调节的启动子，或者例如永久删除染色体上该基因的一部分，然后将载体(例如质粒)插入到包含该基因的细胞中。质粒可以在基因上游包含可调节的启动子，或者当错配修复系统需被暂时灭活时，质粒可以从细胞中除去，然后当错配修复系统需被重新激活时，可以重新插入到细胞中。
出于具体技术目的而选择适当的策略是技术人员的常识。
制备如本文所述能够暂时灭活错配修复系统的丝状真菌细胞的优选方法是，首先如本文所述永久灭活细胞染色体上的错配修复基因，然后将质粒插入到包含该基因的细胞中，其中该质粒的特征在于它包含适合的复制起始序列和适合的选择性标记。
优选地，适合的复制起始序列是AMA1(Gems，D.等(1991)《基因》9861-67)。
下面立即提供适合的复制起始序列和适合的选择性标记的更详细说明，本文工作例4提供了这种策略的实例，使用包含AMA1的质粒作为复制起始序列，使用AmdS作为选择性标记。
复制起始序列本文所用的术语“真菌的复制起始序列”被定义为这样一种核酸序列，它能够支持真菌宿主细胞中的染色体外分子、例如质粒或DNA载体的自我复制，通常不发生质粒的结构重排或向宿主细胞基因组的整合。复制起始序列可以是任意来源的，只要它能够介导真菌细胞中的复制引发活性即可。
优选地，复制起始序列来自丝状真菌细胞，更优选为曲霉属、镰孢属或链格孢属的菌株，进而更优选为构巢曲霉、米曲霉、黑曲霉、尖孢镰孢或互格链格孢。
复制起始序列可以通过本领域熟知的方法加以鉴定。例如，可以从选定生物衍生的基因组片段中鉴定出能够在酵母中的持续自我复制的序列(Ballance和Turner《基因》36(1985)，321-331)，其预示丝状真菌细胞中的自我复制能力。指定序列的真菌复制引发活性还可以这样测定，用所选质粒复制子转化真菌，选择具有不规则形态的菌落，其指示分段质粒的丧失，该分段质粒会引起在选择性培养基上筛选质粒上发现的基因时的生长缺乏(Gems等《基因》98(1991)61-67)。AMA1是以这种方式分析的。分析复制起始序列的另一种方式是分析天然存在的质粒(例如Tusge等所公开的，《遗传学》146(1997)111-120，关于互格链格孢)。
复制起始序列的实例包括但不限于构巢曲霉的ANS1和AMA1序列，例如分别描述于Cullen，D.等(1987《核酸研究》159163-9175)和Gems，D.等(1991《基因》9861-67)。
术语“复制引发活性”在本文中使用其常规含义，也就是表示序列能够支持真菌细胞中的染色体外分子、例如质粒或DNA载体的自我复制。
术语“不发生质粒的结构重排”在本文中用于表示既没有删除质粒的一部分或插入该质粒的另一部分，也没有任何宿主基因组DNA插入到质粒中。
丝状真菌选择性标记术语“选择性压力”在本文中被定义为在有或没有有效量的适当选择剂的存在下，培养含有DNA载体的丝状真菌细胞，该载体含有可操纵连接在目的多核苷酸序列上的真菌选择性标记基因。有效量的选择剂在本文中被定义为足以从不含选择性标记的细胞中选择出含有选择性标记的细胞的量。
在优选的实施方案中，真菌选择性标记选自，编码能够提供对杀生物剂或病毒毒性的抗性、对重金属毒性的抗性或原养型变为营养缺陷型的产物的基因。
在更优选的实施方案中，原养型是从选自这样一组代谢途径的酶获得的，这些代谢途径是由核苷酸合成、辅因子合成、氨基酸合成、乙酰胺代谢、脯氨酸代谢、硫酸代谢和硝酸代谢组成的。
在进而更优选的实施方案中，在本发明的方法中，真菌选择性标记是这样一种基因，其选自argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、amdS(乙酰胺酶)、bar(膦丝菌素乙酰基转移酶)、hemA(5-氨基乙酰丙酸合成酶)、hemB(胆色素原合成酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、prn(脯氨酸通透酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)、pyroA、riboB、sC(硫酸腺苷酸转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)。
将真菌细胞在适合的培养基中、在适合筛选或选择携有变异的目的多核苷酸序列的转化体的条件下培养，该序列具有或编码所需的特征。培养可以按照本领域熟知的用于筛选多核苷酸变体文库的方法进行。
丝状真菌细胞如本文所述的丝状真菌细胞包括真菌亚门(Eumycota)和卵菌亚门(Oomycota)的所有丝状形式。丝状真菌的特征是菌丝壁由壳多糖、纤维素、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、甘露聚糖和其他复杂的多糖组成。营养生长借助于菌丝的伸长，碳的分解代谢为专性需氧型。相反，酿酒酵母等酵母的营养生长借助于单细胞原植体的芽殖，碳的代谢可以是厌氧发酵的。在优选的实施方案中，丝状真菌细胞是下列物种的细胞，支顶孢属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、链孢霉属、青霉属、小柱孢霉属(Scytalidium)、草根霉属、Tolypocladium和木霉属，但不限于此。
用在本发明中的丝状真菌细胞实例包括曲霉属细胞、支顶孢属细胞、镰孢属细胞、腐质霉属细胞、毛霉属细胞、毁丝霉属细胞、链孢霉属细胞、青霉属细胞、草根霉属细胞、Tolypocladium细胞和木霉属细胞。
更具体地，丝状真菌细胞是泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞；杆孢状镰孢、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、玫瑰色镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusariumvenenatum的细胞或Fusarium venenatum细胞(Nirenberg sp.nov)；Humicolainsolens细胞或Humicola lanuginosa细胞；米赫毛霉细胞；嗜热毁丝霉细胞；粗糙链孢霉细胞；产紫青霉细胞；Thielavia terrestris细胞；Trichodermaharzianum、康宁氏木霉、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或绿色木霉细胞。
根据本发明第三方面制备包含DNA文库的丝状真菌细胞群体的方法按照本发明第三方面方法的步骤(a)，分别将不同的目的DNA序列放置在丝状真菌细胞群体中如上所述，将这些DNA序列放置在丝状真菌细胞内的具体实验方法可以按照多种适当技术之一进行，例如转化技术。参见普通的真菌教科书《真菌遗传》(1996，ISBN 0-8247-9544-X)关于这些标准技术的进一步说明。
实例可以是将与染色体DNA序列部分同源的单股寡核苷酸序列放置在细胞内。参见Calissano等《真菌遗传通讯(Fungal genetic newsletter)》4315-16(1995)关于这一点的进一步说明。
另一种实例可以是将包含错配的双链DNA序列(例如图1所示，包含在载体内)放置在细胞内。
在优选的实施方案中，将不同的目的DNA序列包含在质粒中，其中该质粒的特征在于，它包含如上所述的适当复制起始序列和适合的选择性标记。
优选地，适合的复制起始序列是AMA1(Gems，D.等(1991)《基因》9861-67)。
按照本发明第三方面的步骤(b)，将步骤(a)的群体生长一段时间使群体中的单个目的DNA序列在错配修复系统基因已如本文所述被灭活的条件下复制至少一次。
群体的生长可以在多种适合的已知用于生长丝状真菌细胞的培养基之任一中进行。选择这样一种适合的培养基是技术人员的常识。
上文已经解释过，群体中的单个细胞必须能在错配修复系统基因已如本文所述被灭活的条件下复制至少一次。
所述细胞当然可以在错配修复系统基因已被灭活的条件下复制一次以上。
由于错配修复系统的灭活通常将导致细胞内染色体DNA上突变的累积，由此可能成为细胞的致死突变，因此实际优选的上述复制周期次数将取决于这些潜在的致死突变出现得有多快。
确定优选的复制周期有多少是技术人员的常识。
由于这些潜在的致死突变，优选步骤(b)下的错配修复系统已经被暂时灭活。
在根据第三方面步骤(b)的适合的复制周期之后，重新激活暂时灭活的错配修复系统，目的是避免丝状真菌细胞本身中的这些致死突变。这种暂时灭活的策略可以是任意上述策略。
另一种限制突变引入到染色体上的策略是在错配修复缺陷的条件下暂时停止染色体的复制，而复制染色体外元件。这可以通过在仅为染色体复制所必需的元件中引入突变加以实现。
优选的策略是使用这样的丝状真菌细胞，其中如本文所述参与错配修复系统的基因在细胞染色体上被永久灭活，然后插入质粒到包含该基因的细胞中，其中该质粒的特征在于它包含适合的复制起始序列和适合的选择性标记。见上关于这种策略的进一步解释。
优选地，适合的复制起始序列是AMA1(Gems，D.等(1991)《基因》9861-67)。
进一步的实施方案涉及本发明第三方面的方法，其中步骤(b)下的错配修复系统是有缺陷的。
在进一步的实施方案中，本发明涉及如本文所述的方法，其中在本发明第三方面的步骤(b)下，存在部分同源的目的DNA序列的体内基因间重组。
由于本发明的总体概念是提供涉及错配系统灭活的方法，当然优选所述部分同源的DNA序列能够体内形成包含错配的双链DNA序列。
按照本发明的第四方面制备目的多肽的方法，其包括本发明第三方面的步骤且其中目的DNA序列编码目的多肽按照第四方面的步骤(c)，从第三方面步骤(b)所得丝状真菌细胞群体中选择所需的目的多肽。
所需的目的多肽可以是包含所需技术特征的任意多肽，所述技术特征例如提高了的稳定性；所需的特异性活性；所需的最佳pH；在洗涤剂中的改进的洗涤性能；等。
用于选择这种所需的目的多肽的特殊策略可以是技术人员已知的大量选择策略之任一，例如平板筛选试验、基于微滴板的试验等。
本发明的实施方案涉及本发明第四方面的方法，进一步包括下列步骤(d)可选的步骤，其包括根据进一步的特定需要修饰按需要选择的目的多肽的氨基酸序列；(e)将编码第四方面步骤(c)的目的多肽或步骤(d)的修饰型目的多肽的DNA序列放置到适合于大规模制备该目的多肽的丝状真菌细胞中；(f)在允许目的多肽表达的条件下，在至少10000m3的发酵罐中培养步骤(e)的丝状真菌细胞；(g)分析目的多肽。
该实施方案涉及与工业化密切相关的方法，其中所选择的目的多肽是大规模制备的。
可选的步骤(d)涉及这样一种情形，其中选择例如所需的目的多肽，目的例如是鉴定根据本发明第三方面步骤(c)的、在洗涤剂中具有改良的洗涤性能的多肽。这种多肽尽管在洗涤剂中具有改进的洗涤性能，但作为商业产品可能不够稳定。因此，可能需要该选定的多肽中进行一些进一步的氨基酸取代，例如适合的脯氨酸取代，目的是获得足够的稳定性，以使这种多肽商品化。
进一步的实施方案涉及刚才的实施方案的方法，其中适合于大规模制备所述实施方案步骤(e)的目的多肽的丝状真菌细胞是不同于本发明第三方面步骤(a)的丝状真菌细胞的另一种丝状真菌细胞。
该实施方案涉及这样一种情形，其中用于选择目的多肽的丝状真菌细胞不同于用于大规模制备的丝状真菌细胞。
进一步的实施方案涉及如本文所述的方法，其中目的多肽是从丝状真菌细胞衍生的多肽。
术语“从丝状真菌细胞衍生”应当被理解为目的多肽的氨基酸序列信息是从得自丝状真菌细胞的多肽衍生的。
所以，它可以是野生型丝状真菌多肽的变体和/或可以是两种或更多不同的丝状真菌多肽的重组/改组产物。
在进而进一步的实施方案中，本发明涉及如本文所述的方法，其中目的多肽是一种酶，例如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、磷脂酶。
实施例材料用作缓冲剂和底物的化学品是至少为试剂级的商业产品。
实施例1适合于测定如本文所述的丝状真菌细胞是否在错配修复系统中被灭活的凝胶这种凝胶移动(shift)试验的原理是，细胞提取物从下列制成(a)丝状真菌细胞，其中如本文所述参与错配修复系统的基因是灭活的；和(b)相应的丝状真菌细胞，其中的基因不是灭活的。
这些提取物然后与含有碱基对错配的G∶T、G∶A、G∶G、A∶C的寡核苷酸和超螺旋的TG的二核苷酸结合/混合，在非变性凝胶上进行测定。
如果凝胶移动(shift)试验证明所含基因未灭活的对照丝状真菌细胞包含与任意上述寡核苷酸结合的任意蛋白质，并且这些结合蛋白在所含如本文所述参与错配修复系统的基因已灭活的丝状真菌细胞中没有见到，那么确认后者错配修复系统是灭活的。
实验方案细胞提取物的制备如Nagata等所述进行(Mol.Gen Genet(1993)237251-260；见材料和方法)。
基本上如文献所述进行寡核苷酸的退火、细胞提取物与含有错配的双链寡核苷酸的结合、以及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Stephenson和Karran；来自人类细胞的蛋白质与DNA碱基对错配的选择性结合；《生物化学杂志》2642177-21182(1989))。
不过，凝胶电泳是在TAE缓冲液、而不是TBE缓冲液中进行的。为了获得双链寡核苷酸，使寡核苷酸U被放射性标记，并与任意未标记的寡核苷酸L-G.T、L-G.A、L-G.C、L-A.C、L-T.G或L-HOM退火。寡核苷酸序列是从Aquilina等《美国国家科学院院报》918905-8909(1994)获得的。
U5′-GGGAAGCTGCCAGGCCCCAGTGTCAGCCTCCTATGCTC-3′(SEQ ID NO 3)；L-G.T5′-GAGCATAGGAGGCTGACATTGGGGCCTGGCAGCTTCCC-3′(SEQ ID NO 4)(导致G.T错配)；
L-G.A.5′-GAGCATAGGAGGCTGACAATGGGGCCTGGCAGCTTCCC-3′(SEQ ID NO 5)(导致G.A错配)；L-G.G.5′-AGCATAGGAGGCTGACAGTGGGGCCTGGCAGCTTCCC-3′(SEQ ID NO 6)(导致G.G错配)；L-A.C.5′-GAGCATAGGAGGCTGACACCGGGGCCTGGCAGCTTCCC-3′(SEQ ID NO 7)(导致A.C错配)；L-TG5′-GAGCATAGGAGGCTGACACTGTGGGGCCTGGCAGCTTCCC-3′(SEQ ID NO 8)(导致超螺旋的TG二核苷酸)；L-HOM5′-GAGCATAGGAGGCTGACACCGGGGCCTGGCAGCTTCCC-3′(SEQ ID NO 9)(导致同源双链)。
所有实验均包括两倍过量的未标记的同型双链竞争性寡核苷酸。
实施例2参与米曲霉细胞错配修复系统的基因的克隆如本例所述被克隆的基因显示在SEQ ID NO 1(DNA序列)和SEQ IDNO 2(翻译的氨基酸序列)中。
来自不同生物的错配修复蛋白的若干序列是已知的，下面仅用到其中的三种酿酒酵母(M84170)、H.sapiens(L47580)和小鼠(U21011)。
所示数字是公众可以获得的GenBank数据库的查询数。
基于已知错配修复蛋白之间的C-端同源性，设计了一组简异引物，目的是扩增米曲霉同系物的不完全序列Pr117858(SEQ ID NO 10)P-GGCNCARATHGGNTGYTTYGTNCCPr117859(SEQ ID NO 11)P-GCCCANGCNARNCCRAANCC利用来自米曲霉菌株JaL142(WO96/29391)的染色体DNA作为模板以及上述引物，在八种MgSO4浓度(0.5mM至4.0mM，按照制造商的建议；Boehringer M.)下进行下列基于50μl PWO聚合酶的PCR反应。发现1mMMgSO4是最优的，得到约230bp的单一带，是预计序列中不含内含子的结果。
PCR循环为[96℃2min-(94℃15s；50℃15s；72℃30s)循环30次-72℃7min-4℃维持]。
230bp PCR片段经钝端连接在pUC19的BamH1位点。pUC19在牛小肠碱性磷酸酶的存在下经BamH1裂解，然后通过klenow聚合酶和dNTP补平粘性末端。从上述连接反应的大肠杆菌XL1转化体中分析携有插入片段的三个质粒，并测序。对克隆的PCR片段翻译的多肽进行排列揭示了它与已知的错配修复蛋白序列具有较高同源性(见图2)。
图2中带下划线的序列是从上述共有PCR引物衍生的序列。
图2的三种曲霉属序列等于SEQ ID NO 2之683-758位所示序列，但其中685位在最终所克隆的序列中是Thr(T)，而不是所示的Ile(I)。这是由上述共有引物中的序列引起的。
图2所示排列清楚地证明，所克隆的片段来自错配修复蛋白的米曲霉同系物。
为了克隆完整的基因，通过PCR生成所克隆片段的放射性标记探针，即，使用0.5mg pUC19′msh2′-13(见上)作为模板，在100ml中与Taq聚合酶、30pmol pUC正向与反向引物、0.2mM dG-、dC-、dTTP和0.2mM dATP+32P-dATP反应。所生成的放射性标记探针通过EcoR1-Hind3消化作用从pUC19序列中释放出来，然后进行所得293bp片段的凝胶纯化。
使探针与来自米曲霉菌株A1560(JaL142的父代)(WO96/29391)基因组DNA的膜格点(gridded)粘粒文库杂交。通磷酸成像仅(Phosphoimager)中分析而鉴定滤膜上的阳性克隆为λ31A2。
繁殖λ31A2粘粒DNA，使用上述相同的放射性标记引物进行Southern分析。鉴定了大约9Kb Pst片段，其被BstX(以前在所克隆的PCR片段中发现)分裂为5.8和3.2kb片段，均因携有探针而发出信号，将该9kb片段克隆至已用Pst切割的pUC19，得到名为pUC19msh2P的质粒。从表明以前测定过的序列的引物开始按顺序对插入片段测序，以下是基于最后一轮所测序列的引物130740(SEQ ID NO 12)GCTCGAAACATCCAACATCC130741(SEQ ID NO 13)GCTGTGAATCACTTGCACC131928(SEQ ID NO 14)CTTCATAAACTGCGACAAATCATGC131929(SEQ ID NO 15)GGAGGAGCATCTTCGC131930(SEQ ID NO 16)GGAACTTGAAGACTTTACTTCATCC134608(SEQ ID NO 17)CCAGAAACTCGCTAACACC134609(SEQ ID NO 18)GTGCTTTGCGGACGC134610(SEQ ID NO 19)CAGGACAGTAGGACGC
135320(SEQ ID NO 20)CGAGCGATGAACTCTGC135321(SEQ ID NO 21)GCGTTGGTGGATTATCC136105(SEQ ID NO 22)CGTTGCATCTATCATATACC136106(SEQ ID NO 23)GGTATATGATAGATGCAACGC据此测定的3825bp序列(SEQ ID NO 1)在以前在PCR片段中测定的框架中翻译。所得蛋白质(SEQ ID NO 2)被称为Ao.MSH2，将其与图3中已知错配修复蛋白的蛋白质序列排列。从图3所示排列可以看出，所克隆和测序的DNA清楚地涵盖了酵母、人和小鼠错配修复蛋白的同源物的编码序列，其在N-端部分有一个内含子。按照标准的剪接规则推断内含子的位置，并且构成唯一的可能性。
实施例3破坏米曲霉细胞染色体上实施例1所克隆的基因关于破坏实验，通过PCR从pUC19msh2P(见实施例2)中删除msh2CDS，引入NotI位点以代之。进行该反应的引物是137208(SEQ ID NO 24)5′P-CCGCGTCTCCAACAAGATGAATGG137207(SEQ ID NO 25)5′P-CCGCTTTCTCGGGGTCATAGC在与2.5mM MgSO4和50pg pUC19msh2P所进行的基于Pwo聚合酶的PCR反应(按照制造商建议的条件)中PCR循环为[96℃2min-(94℃30s；52℃30s；72℃3min)循环4次-(94℃30s；59℃30s；72℃3min)循环25次-72℃10min]。
分析所得约8.9Kb的PCR产物，将其连接至pUC19，然后转化大肠杆菌XL1。从所得转化体分析pMsh2Δ，通过测序[引物138149(SEQ ID NO26)CCTTTCCACTTTAATCCTAAGC](X11/pMsh2ΔLac3073)验证新接合及其周围点的正确性。
将米曲霉pyrG(WO96/29391)插入该构建体的NotI位点。
通过利用这种构建体，可按本领域已知的关于通过同源重组在染色体上使这类删除基因交叉(crossing)的标准技术在米曲霉细胞中删除所述染色体基因(Miller，B.L.等，1985《分子与细胞生物学》51714-1721)。
实施例4包含如SEQ ID NO 1所示错配修复基因、AMA1复制起始序列及AmdS选择性标记的质粒的构建
如下所述构建的质粒非常适合于制备所含错配修复系统已暂时灭活的丝状真菌细胞，其中当错配修复系统应当被激活时，可将这种质粒插入到实施例3的已错配破坏的菌株中，当错配修复系统应当被灭活时，可将这种质粒从菌株中删除。
错配修复基因的破坏可以导致新染色体突变的蓄积，因此这样的菌株可能是遗传上不稳定的。所以，决定在下述菌株中进行染色体破坏，所述菌株中错配修复基因由染色体外元件表达，当需要错配修复缺失型表型时该元件能很轻易地丢失。
这里，染色体外元件是包含AMA1作为复制起始序列和AmdS作为选择性标记的质粒。
为此，将错配修复基因(SEQ ID NO 1)克隆到携有一个AMA1重复序列的自我复制型构建体中。
从pMT1505(见下实施例5关于pMT1505的说明)中分离下列片段，并将它们连接在一起5.16kb NotI-[Hind3]*＋3.515kb[Sal]*－BamH1＋757bp BamH1-NotI[]*表示该位点已用klenow-聚合酶和dNTP补平通过该连接反应分析出pMT1505DHS(LaC 3212)，将错配修复表达盒作为BamH1-Mun1片段引入pMT1505DHS的相应位点，得到质粒pAma-msh2(LaC3216)。
将米曲霉JaL250(见实施例5)用pAma-msh2转化为AmdS+，检查未被选择的转化体(转化体的50％)丢失amdS性状的能力，说明这种质粒是作为染色体元件维持的。(LaC3244保持在乙酰胺＋尿苷上)。
实施例5实施例4所用质粒pMT1505的构建质粒pMT1505如下实施例5所述构建pHelpl含有米曲霉pyrG基因作为选择性标记，还含有能在构巢曲霉中自我复制的AMA1序列，如Gems，D.等(1991.《基因》9861-67)所述pToC68如EP0 531 372(Novo Nordisk A/S)所述菌株JaL250米曲霉A1560的衍生物，其中pyrG基因已灭活，如WO98/01470所述DH5a大肠杆菌宿主细胞，购自GIBCO BRL(Life Technologies，Inc.，Rockville MD)pMT1466通过将来自pHelpl的SphI/NarI片段插入到pToC68中而构建。pMT1489通过用SphI和StuI消化pMT1466，然后重新连接而构建。pMT1500通过用AatII和NarI消化pMT1489，再连接一个接头而构建。pMT1504通过用NheI消化pMT1500，然后重新连接而构建。
pMT1505通过将含有构巢曲霉基因组DNA中amdS编码基因的2.7kbXbaI片段(Corrick，C.M.等1987《基因》5363-71)插入已用NheI切割的pMT1504中而构建。
实施例6染色体上一部分mshII基因的删除将质粒p418MsHII(来自lac3159)用SalI和XhoI切割，再用牛小肠磷酸酶处理。以这种方式剪出msHII基因的一部分。从1％琼脂糖凝胶中分析含有载体和大部分msHII基因的大带(6400bp)。
质粒pJal554通过将pS02的SpeI/SspBI切割片段(5330bp)与pS02的Asp718/NheI切割片段(316bp)连接而构建。将质粒pJal554用SalI切割，在1％琼脂糖凝胶上分析含有pyrG基因的2350bp带。将含有pyrG的2350bp带与切割的p418MsHII质粒连接，转化到大肠杆菌中。通过限制性分析鉴定正确的大肠杆菌转化体，从该转化体制备质粒制剂。
将所制备的质粒用EcoRI切割，目的是使质粒在转化到例如米曲霉Jal250之前线性化。在基本平板上选择转化体。
发生双遗传交换的转化体是这样鉴定的，制备曲霉属染色体DNA制剂，然后利用适当引物对全长mshII基因进行PCR筛选。利用被适当的酶随机片段化的染色体DNA以及适当的针对被删除之msHII片段(不复存在)的探针以及阳性对照探针进行Southern印迹分析。
为了测定具有灭活的msHII基因的菌株中所增加的突变频率，筛选niaD基因中的突变。这一点是通过在平板上培养母体菌株曲霉Jal250和msHII灭活型菌株来实现的。
制备孢子悬液，将孢子试样接种在含有氯酸盐的平板上，如Unkles等所述(S.E.Unkles，E.C.Campbell.Y.M.J.T.de Ruite Jacobs，M.Broekhuisen，J.A.Macro，D.Carrez，R.Contreras，C.A.M.J.J.van den Hondel J.R.Kinghorn.基于硝酸盐同化途径的米曲霉同源转化系统的开发用于丝状真菌转化的方便和通用的选择系统，《分子与普通遗传学》V218 p 99-104(1989))。
没有MsHII蛋白表达的菌株将比对照菌株具有更高频率的niaD突变(更多的氯酸盐抗性克隆)。
实施例7使用TAKA启动子驱动反义mRNA的转录从而制备抑制msHII mRNA翻译的体内反义msHII RNA反义RNA表达是已知体内下调任意基因表达的方式(反义RNA的设计，Georg Sczakiel，反义与核酸药物开发V.7P.439-444(1997))。
使用下列oligo000120j2(SEQ ID NO 27)TCTGCGAATCGCTTGGATCCCGAACGCGACAACAC、000120j4(SEQ ID NO 28)GAGCTCAGATCTCTTAGGTTCTGGACGAGAAGA并以pUC19msh2P作为模板制备PCR片段。该PCR片段含有msHII基因的5’末端，包括5’msHII mRNA的假定部分。使用下列oligo000120j3(SEQ ID NO 29)GTTGTCGCGTTCGGGATCCAAGCGATTCGCAGAAG、1298-TAKA(SEQ ID NO 30)GCAAGCGCGCGCAATACATGGTGTTTTGATCAT并以pENI1298作为模板(PCTDK99/00552)制备另一种PCR片段。两次PCR反应都是按照制造商手册(Boehringer-Mannheim)并使用PWO聚合酶进行的。
PCR片段用Qiagen PCR纯化试剂盒(Qiagen)加以纯化。将两种PCR片段混合，利用引物1298-TAKA和000120j4进行第三次PCR反应。以这种方式装配所述两种PCR片段。
装配后的PCR片段用BssHII和BglII切割，从1.5％琼脂糖凝胶上纯化，再与pENI1298连接，后者已用BssHII和BglII切割(从1％琼脂糖凝胶上纯化)。将连接混合物转化到大肠杆菌中。制备所得每种大肠杆菌转化体的DNA制剂。对装配后的PCR片段进行测序，以确认在操作期间没有引入所不需要的突变。正确的构建体含有TAKA启动子，它驱动msHII反义mRNA的转录。
以pENI1298作为对照，将所得质粒转化到例如米曲霉Jal250，在基本平板上选择转化体。在基本平板上分析所得转化体，在37℃下培养，直到它们形成孢子。
为了测定菌株(其中msHII mRNA的翻译因msHII反义RNA的表达而受到阻抗)中所增加的突变频率，进行niaD基因中突变的筛选。制备对照转化体(pENil298)和msHII反义RNA转化体的孢子悬浮液，将等量孢子接种在含有氯酸盐的平板上，如Unkles等所述(S.E.Unkles，E.C.Campbell.Y.M.J.T.de Ruite Jacobs，M.Broekhuisen，J.A.Macro，D.Carrez，R.Contreras，C.A.M.J.J.van den Hondel J.R.Kinghorn.基于硝酸盐同化途径的米曲霉同源转化系统的开发用于丝状真菌转化的方便和通用的选择系统，《分子与普通遗传学》V218 p 99-104(1989))。
无或低MsHII蛋白表达的菌株将比对照菌株具有更高频率的niaD突变(更多的氯酸盐抗性克隆)。
权利要求
1.丝状真菌细胞，其中参与错配修复系统的基因已经被灭活，该参与错配修复系统的基因包含(a)编码SEQ ID NO 2之683-758位所示多肽序列的DNA序列；或(b)编码至少70％等同于SEQ ID NO 2之683-758位的多肽序列的DNA序列。
2.丝状真菌细胞，其中参与错配修复系统的基因已经被灭活，该参与错配修复系统的基因包含(a)编码SEQ ID NO 2之1-940位所示多肽序列的DNA序列；或(b)编码至少70％等同于SEQ ID NO 2之1-940位的多肽序列的DNA序列。
3.权利要求1或2的丝状真菌细胞，其中该参与错配修复的基因是有缺陷的。
4.权利要求1或2的丝状真菌细胞，其中该参与错配修复的基因已经被暂时灭活。
5.在先权利要求中任一项的丝状真菌细胞，其中该丝状真菌细胞是镰孢属菌株，或者更优选为曲霉属菌株。
6.制备丝状真菌细胞群体的方法，其中群体中的个体细胞分别包含代表目的DNA文库的不同目的DNA序列，该方法包括下列步骤(a)分别将不同的目的DNA序列放置在包含权利要求1或2的丝状真菌细胞的丝状真菌细胞群体中；(b)将(a)群体生长一段时间，使群体中单个目的DNA序列在 1或2的错配修复系统基因已被灭活的条件下复制至少一次。
7.权利要求6的方法，其中步骤(b)下的该错配修复系统是有缺陷的。
8.权利要求6的方法，其中步骤(b)下的该错配修复系统已经被暂时灭活。
9.权利要求6-8中任一项的方法，其中该丝状真菌细胞是镰孢属菌株，或者更优选为曲霉属菌株。
10.权利要求6-9中任一项的方法，其中在权利要求6的步骤(b)下，存在部分同源的目的DNA序列的体内基因间重组。
11.生产目的多肽的方法，其包括权利要求6的步骤，且其中所述目的DNA序列编码目的多肽，该方法进一步包括下列步骤(c)从权利要求6步骤(b)所得丝状真菌细胞群体中选择所需的目的多肽。
12.权利要求11的方法，其进一步包括下列步骤(d)可选的步骤，包括根据进一步的特定需要修饰所需的所选择的目的多肽的氨基酸序列；(e)将编码权利要求11步骤(c)的目的多肽或步骤(d)的修饰型目的多肽的DNA序列放置到适合于大规模制备目的多肽的丝状真菌细胞中；(f)在允许目的多肽表达的条件下，在至少10000m3的发酵罐中培养步骤(e)的丝状真菌细胞；(g)分离目的多肽。
13.权利要求12的方法，其中适合于大规模制备权利要求12步骤(e)的目的多肽的丝状真菌细胞是不同于权利要求6步骤(a)的丝状真菌细胞的另一种丝状真菌细胞。
14.权利要求11-13中任一项的方法，其中所述目的多肽是从丝状真菌细胞衍生的多肽。
15.权利要求11-14中任一项的方法，其中所述目的多肽是一种酶，例如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、磷脂酶。
全文摘要
使用参与丝状真菌细胞错配修复系统的新颖的克隆基因制备丝状真菌细胞DNA文库的方法。
文档编号C12N15/80GK1341146SQ00804283
公开日2002年3月20日 申请日期2000年2月17日 优先权日1999年2月24日
发明者托本·V·博彻特, 拉斯·克里斯琴森 申请人:诺维信公司