专利名称：：通过在释放胞内酶前灭活胞外酶来鉴别样品中的细胞的制作方法
技术领域：
：本发明属于细胞分析领域，尤其属于临床诊断微生物学。
背景技术：
：临床微生物学经常涉及检测体液中的细菌。除了包含细菌，这些体液还可能包含患者自身的细胞。宿主和病原体细胞的相对比例变化很大，例如尿样可以包含许多细菌(〉100,000每ml)而几乎不含宿主细胞，而血液样品可以包含过量(107或者等多)宿主细胞。尽管一些诊断性检验可以轻易区分宿主细胞与细菌细胞(例如革兰氏染色，PCR)，其他则不能。例如，一些诊断性检验依赖的标记物也存在于宿主细胞中，因此两种细胞的存在会干扰检验。这类干扰发现于龈沟液(GCF)检测中。已经认为在病态的GCF样品中，蛋白例如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶和乳酸脱氢酶被发现升高，但是所有这些酶可能来自宿主或者细菌[l]。对于必须在较大宿主细胞背景下鉴定细菌细胞的情况，而且使用非特异的胞内标记物，就需要一种从宿主背景区分细菌标记物的方法。更特别的，当临床血液样品中关注的标记物来自血细胞、细菌细胞甚至血清，需要在它们之间鉴别其不同来源。本发明的描述发明人已经发现一种特定检测样品中胞内微生物标记物的方法，即使样品还包含宿主细胞和/或游离溶液中的标记物。通过采用差异细胞裂解方法，裂解宿主细胞但保留完整的微生物，释放宿主细胞标记物，然后灭活大量溶液中的标记物。在来自宿主细胞和溶液的标记物被灭活之后，微生物裂解释放标记物，就可以不受干扰的进行检测。这种技术不仅可用于宿主细胞背景中的微生物，还可用于任何细胞类型的混合物，其中细胞可进行差异裂解。因此本发明提供一种检测液体样品中关注的细胞存在与否的方法，其中(a)样品(i)包括胞外介质，所述介质包含具有可测活性的酶；和(ii)被怀疑包含关注的细胞，所述细胞包含具有所述可测活性的胞内酶；(b)所述方法包括以下步骤(i)用试剂处理液体样品，所述试剂灭活胞外介质中的所述可测活性，但不灭活所述关注细胞中的可测活性；(ii)裂解所述关注的细胞释放胞内酶；和(iii)检测所述可测活性。在步骤(iii)中检测到可测活性表明关注的细胞存在于样品中；相反，可测活性的缺失表明细胞是不存在的。在灭活胞外活性之后，但在(b)的步骤(ii)裂解之前，可以培养关注的细胞让其生长。在一个典型实施方案中，本发明的方法涉及用蛋白酶处理由选择性裂解产生的组合物(例如血液样品，其中血细胞已经被裂解但微生物保存完整)，所述蛋白酶能够消化可测的酶。例如，人腺苷酸激酶(AK)已经被确定对胰蛋白酶处理敏感，因此血液中的背景AK活性可以在微生物裂解前被消除，然后微生物自己的AK活性可以不受血液AK干扰的用于检验目的。当发明人发现即使样品开始就包含与血液中相同的过量的活性，所述方法也可以检测微生物的酶活性，该方法是特别有利的。因此本发明提供一种检测血液样品中微生物存在与否的方法，包括以下步骤(i)用试剂处理血液样品，所述试剂裂解血液样品中的血细胞，但不裂解血液样品中的任何微生物，从而从所述血细胞中释放腺苷酸激酶；(ii)用蛋白酶处理所述裂解产物以灭活血液样品中的腺苷酸激酶而不灭活微生物中的腺苷酸激酶；(iii)裂解微生物以释放腺苷酸激酶；和(iv)检测微生物释放的腺苷酸激酶活性。在步骤(ii)和(iii)之间，可以培养一些或者全部的微生物使其生长，并且可进行可能效的抗微生物处理。本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括蛋白酶，和下列试剂中至少一种(例如1，2，3，4，5，6，7种)ADP;二价金属阳离子的可溶性盐；荧光素酶；荧光素；皂角苷；消泡剂；和/或抗凝血剂。二价金属阳离子优选Zn++或者Mg++。消泡剂优选聚丙二醇。抗凝血剂优选polyanetholsulphonate。皂角苷是优选的成分。试剂盒优选包括以下所有试剂ADP;二价金属阳离子的可溶性盐；荧光素酶；和荧光素。本发明还提供一种包含裂解试剂和蛋白酶的反应容器。所述容器通常是一次性的管，并且适合于接收血液样品进行一步法血液裂解和腺苷酸激酶灭活步骤。本发明此外提供还包括血细胞(通常是裂解的)的反应容器。可测的酶活性本发明依赖于关注细胞中可测酶活性的存在。酶活性对于关注的细胞不是特异的，但是，因此可能受到其他来源的所述活性的干扰。本发明因此灭活胞外介质中的所述活性，然后释放具有所述活性的胞内酶，这样检测释放的酶的活性时可以不受现在-灭活的胞外酶的干扰。灭活的酶和释放的酶具有相同的可测活性，但是它们无须是相同的酶。例如，酶可以是同功酶，这样它们催化相同反应，即使它们也许具有不同的酶参数(比如KM和kcat)。在任何场合，但是，酶共享一种活性，所述活性能够在检验中被检测，这样两种酶的存在将干扰检验的结果。为检测细菌细胞，可以使用不同的酶活性。本发明使用还在其他生物体例如动物细胞(和尤其是血细胞)或者植物细胞中存在的活性，而不是细菌独有的活性。合适的酶活性包括那些普遍存在的活性，例如糖酵解途径、转录等等的活性。乳酸脱氢酶(LDH)在许多身体组织中被发现，尤其是心脏，肝，肾，骨骼肌，脑，血细胞(包括红细胞、白细胞和血小板)和肺，并且参与基本细胞代谢。存在多个LDH同功酶，它们均存在于血清中。还在微生物中发现了LDH。因此血液样品可能包含三个来源的LDH:血清；人胞内；和微生物胞内。本发明能够将微生物LDH活性和血清及人胞内LDH活性进行区分。LDH是有关酶使用的一个合适的活性，因为血液中LDH活性的检验已经可以方便的作为标准血液病理检测的一部分。参考文献2-7公开一种检测细胞的方法，所述方法基于细胞裂解后胞内腺苷酸激酶(AK)的释放。AK被发现于血液细胞和微生物以及血清中，但是本发明能够有利地将微生物AK活性与血清和人胞内AK活性进行区分。参考文献8已经报道利用加热、极端pH、极端盐浓度或者超声的变性去除不需要的背景AK活性。但是这些方法不适合本发明的使用，因为它们可能破坏关注的细胞，或者当病症恢复正常时它们可能是可逆的，在这种情况下干扰活性重现。本发明最优选的酶活性是AK活性。AK具有EC编号E.C.2.7.4.3，还称为肌激酶，腺苷激酶和adenylokinase。它可以催化从两个ADP分子产生ATP和AMP，从一个ADP上转移磷酸盐到另一个，也可以催化从ADP和Pi产生ATP。酶利用二价金属阳离子，通常是镁离子或者锌离子。因此利用ADP和Mg++/Zn++来源，AK可以从外源ADP产生ATP。这种反应效率很高，一个AK酶可以在IO分钟内从ADP催化产生400,000分子的ATP。本发明的方法因此涉及添加ADP和合适二阶阳离子的来源。阳离子的摩尔浓度优选的等于或者大于ADP的摩尔浓度，这样所有的ADP分子可以结合至少一个阳离子。利用荧光素酶反应可以方便的检测ATP。利用AK从外源添加的ADP产生ATP比利用内源ATP驱动荧光素酶反应要敏感100倍，并显示和细胞数目更好的关联。因此AK和荧光素酶结合可用于细胞数目的定量测量。本发明的方法因此涉及在ATP产生期间，或优选在ATP产生之后，添加荧光素和荧光素酶，任选随后检测样品发出的荧光素酶产生的光值。因此AK活性通过荧光素酶反应间接检测。关注的细胞本发明的方法能够在其他细胞背景之上检测关注的细胞，即使使用的酶标记物对两种细胞类型是共有的。通过裂解干扰细胞、灭活裂解步骤中释放的标记物，然后裂解关注的细胞，本发明实现区别检测。优选关注的细胞是细菌，包括但不限于葡萄球菌(Staphylococci),比如金黄色葡萄球菌(S.aureus)(更特别的是甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌，或者"MRSA");肠道球菌(Enterococci)比如屎肠球菌(E.faecium)和粪肠球菌(E.faecalis)(更特别的是万古霉素抗性的粪肠球菌)；链球菌比如酿脓链球菌(S.pyogenes)，肺炎链球菌(S.pneumoniae)(更特别的是青霉素抗性的肺炎链球菌)，和无乳链球菌(S.agalactiae);肠细菌类例如E.coli，克雷伯氏杆菌(Klebsiella)类(例如产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca))，变形菌(Proteus)类(例如普通变形杆菌(P.vulgaris))，和肠道细菌(Enterobacter)类(例如阴沟肠杆菌(E.cloacae));肠道有机体像沙门氏菌(Salmonella)类(例如肠炎沙门氏菌(S.enteritidis))，志贺氏杆菌(Shigella)类，和弯曲杆菌(Campylobacter)类；奈瑟氏菌(Neisseria)类例如脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)，淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae);不动杆菌(Acinetobacter)类例如鲍曼不动杆菌(A.baumanii);沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷菌(S.marcescens);假单胞菌(Pseudomonas)，例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa);和特异病原体比如洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)，炭疽杆菌(Bacillusanthracis)，肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)，耳卩尔森氏菌属鼠疫(Yersiniapestis)，白喉棒杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)禾口百曰咳杆菌(Bordetellapertussis)。本发明也可以用于酵母，例如白念珠菌(C.albicans)。它也可以被用于寄生虫例如恶性疟(P.falciparum)，利什曼虫(Leishmania);螺旋菌；裂体吸虫；等等。这个目录不是穷尽的，而是用于说明利用本发明可以检测的致病微生物的广谱性。液体样品本发明可以处理不同液体样品，所述样品可能包含关注的细胞，所述细胞共享关注的标记，例如血液样品，精液样品，尿样品，粪便，食物样品，等等。本发明对检测血液中的细菌细胞非常有用。因此用于本发明方法的液体样品通常是血液样品。血液样品可以直接来自患者，或者可能经过处理，例如肝素化、离心、裂解，等等。血液样品可能是预期用于输血。血液包括血清和细胞。血清和细胞都可能包含关注的酶活性(例如LDH在血细胞和血清内均存在)。这两个来源都会干扰微生物中所述活性的检测，而本发明可以同时除去这两个来源，通过裂解血细胞，这样血液结合标记物被释放。因此用于本发明的方法分析的典型液体样品将是血液样品，其中血细胞已经被裂解，但任何微生物都保存完整。这个样品因此包括(i)包括血清和血细胞裂解产物的胞外介质，和(ii)存在于原始样品中的任意微生物。用于优选裂解样品中的血细胞(包括红细胞、白细胞和血小板)并保持微生物细胞完整的方法是本领域公知的，尤其来自于临床微生物分析系统和寄生虫血液感染的诊断，包括例如皂角苷裂解、RB缓冲液的使用和表面活性剂和渗透压冲击的使用等方法DOxoid的Isolator系统利用裂解血液中的白细胞和红细胞而不损伤细菌的试剂，基于纯化皂角苷的使用。还使用聚丙二醇阻断皂角苷的发泡倾向，并且sodiumpolyanetholsulphonate的作用是(i)用作抗凝血剂(ii)中和血液的杀菌性质和(iii)抑制吞噬作用。RB缓冲液是本领域公知的(例如40mMMOPS,lOmM醋酸钠，1mMEDTA，pH7.0;或者0.5mMMgCl2，1mMEGTA，禾口0.1MMES-KOH,pH6.8)，用于Cambio(Cambridge,UK)禾卩Microzone(HaywardsHeath，UK)出售的"microLYSISforInfectedBlood"系统。如果白细胞无须被裂解，则RB缓冲液可以用TE缓冲液替换。优选的利用皂角苷裂解血细胞。优选利用非离子型表面活性剂，例如TritonX-100和/或M-Per，裂解血小板。差异裂解方法的其他例子包括但不限于利用参考文献9公开的方法差异裂解红细胞和白细胞；活化的杀伤细胞(LAK)克隆可差异裂解肿瘤细胞[10];在法医学分析中，差动裂解用于从其他细胞鉴别精细胞，尤其从上皮细胞。酶的灭活本发明的方法涉及一个步骤，所述步骤中液体样品用灭活酶活性的试剂处理。但是所述灭活方法不灭活关注细胞中的可测活性，所述细胞也存在于液体样品中。因此关注细胞中的活性可以在本方法的更迟阶段进行测量。为了选择性灭活胞外活性而不灭活胞内活性，通常不使用例如热变性[8]的方法，因为它们将破坏关注细胞内的活性。而是使用化学或者物理方法，典型的灭活方法将使用可以作用于胞外材料但是不能进入完整细胞的试剂。因此选择性来自关注细胞的膜对试剂的不渗透性。灭活优选的是不可逆转的。因此用抑制剂、温和化学变性剂，等等的处理不是优选的。灭活酶活性的试剂能或者不能杀伤关注的细胞。对于一种检测，其中取自血液的微生物随后将生长(例如用于抗菌敏感性检测)，将使用非致死的灭活试剂。一类试剂是酸和碱。已经发现添加酸灭活胞外AK。但是，pH不应该显著的降低或者升高使得关注细胞内的可测酶也会被变性(或者，在灭活之后需要活的关注细胞时，pH变化太大细胞会死亡)。在灭活后，以及在关注细胞的裂解之前或者之间，应当调节pH避免释放的酶的灭活。一个优选的不可逆转的处理涉及蛋白水解酶的利用。合适的蛋白酶包括但不限于胰蛋白酶；糜蛋白酶；菠萝蛋白酶；弹性蛋白酶；木瓜蛋白酶；胃蛋白酶；凝乳酶；血纤维蛋白溶酶原；枯草杆菌蛋白酶；凝血酶；胰酶制剂；组织蛋白酶；无花果蛋白酶；蛋白酶K等等。蛋白酶例如胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，糜蛋白酶，蛋白酶K，胃蛋白酶和凝乳酶是优选的，因为它们分布较广，成本较低。可以通过常规生化检验进行检测特定蛋白酶灭活选择的标志酶的能力，和/或当提供序列信息时，可以根据靶标的氨基酸序列和蛋白酶的识别序列进行预测。如果特定蛋白酶在特定环境(例如参见参考文献11和12)下效率不高，可容易地找到替代的蛋白酶。可选择具有特异性质的蛋白酶用于特异环境，例如选择的蛋白酶是热稳定的、非常低或者高的最适pH值、可以耐受特定化合物的存在，等等。发明人已经发现利用胰蛋白酶，可以方便的灭活血清AK和从血细胞释放的AK，而不杀伤微生物或者灭活它们的AK。胰蛋白酶先前已经被用于消化(和因此灭活)AK用于生化研究(例如参考文献13)，但是其用于胞外AK的选择性灭活还没有报道。与预期相反，已经发现胰蛋白酶不损害血液中携带的细菌(它们在处理之后保持生长能力)，据认为这种恢复可能来自无须在最低限定生长培养基中维持细菌。此外，已经发现胰蛋白酶不灭活细菌内的AK。此外，胰蛋白酶没有显著地干扰下游AK检验，因此不需要在微生物裂解后除去，只要AK/荧光素酶检验在不久后进行。AK/荧光素酶检验非常快，可以在5-10分钟之内给出所有结果，在这个时间段内胰蛋白酶对微生物AK的效果是可以忽略的。尽管如此，通过(a)添加胰蛋白酶抑制剂，和/或(b)改变pH和/或温度以远离胰蛋白酶的最适值、但接近AK/荧光素酶最适值，禾口/或(c)在裂解试剂内包括灭活胰蛋白酶的化学物质，胰蛋白酶对微生物AK的效果可进一步有益的被最小化。蛋白酶的最适pH可能相同、类似(例如在2个pH单位内)或者不同于裂解后待测的酶的最适pH。通过选择具有不同最适pH的蛋白酶(例如当使用AK/荧光素酶反应时，一种最适pH低于5.5或者高于IO的酶)，和通过调整pH以适合可测酶的最适pH(例如在裂解关注的细胞之前或者期间)，有可能减少蛋白酶灭活从细胞释放的酶的风险。因此利用一种酶例如胃蛋白酶(最适pH的范围在2-4之间)灭活例如AK的酶，然后可以调节pH以适于AK分析(例如大约7.5)，在胃蛋白酶存在的条件下可以裂解细胞释放它们的AK，但是胃蛋白酶不会有活性。用蛋白酶灭活通常涉及样品与蛋白酶的简单混合，然后孵育使蛋白水解消化得以进行。可以选择孵育条件以满足蛋白酶的偏好(例如pH,温度，离子，缓冲液，等等)，但是这些条件不应该改变为使胞内酶被不可逆的灭活，或者使关注的细胞被杀死，如果下游步骤还需要它们的话，例如特定蛋白酶可能具有最适温度55°C，关注的细胞可能不能耐受这个温度，因此应使用一个较低的温度作为折中。因此在蛋白酶消化之前或者期间，本发明的方法可能涉及温度调节和/或pH调整。如上所述，温度和/或pH也可以在蛋白酶消化结束后调节，禾口/或添加蛋白酶抑制剂以阻止进一步的蛋白水解消化。蛋白酶抑制剂是公知的，可以轻易获得，例如BPTI，等等。用于灭活的蛋白酶浓度取决于不同的参数，包括待消化的酶的浓度、灭活时间、下游分析需要的时间(在此期间蛋白酶可能仍然存在)，等等。这些参数可以毫无困难地选择和优化。消化直到12小时是常见的，例如直到6小时，直到4小时，等等。抗微生物敏感性检测本发明的方法非常适合于对从患者样品提取的微生物进行抗微生物敏感性检测(AST)[14到16]。在一个实施方案中，提取关注的细胞，这些提取的细胞用于AST检测。在另一个实施方案中，培养患者样品，进行细胞的多次提取。在两个实施方案中，可测活性随时间的增加表示微生物生长增加，表明感染的存在。第一个实施方案是优选的。在第一个实施方案中，本发明提供一种检测液体样品中关注的细胞存在与否的方法，其中.-(a)样品(i)包括胞外介质，所述介质包含具有可测活性的酶；和(ii)被怀疑包含关注的细胞，所述细胞包含具有所述可测活性的胞内酶；(b)所述方法包括以下步骤(i)用试剂处理液体样品，所述试剂灭活在胞外介质中的所述可测活性，但不灭活所述关注的细胞中可测活性；(ii)建立在步骤(i)之后残留的关注细胞的培养物；和(iii)从所述培养物中提取一个或多个样品。如此处所述，在(b)步骤(iii)中提取的样品均可用于关注细胞(例如细菌)的裂解，以释放胞内酶(例如AK)，然后测量所述可测的活性。步骤(iii)中提取的样品可以用抗微生物处理用于AST分析。如果样品在不同时间检测，活性随时间的增加表明细胞的生长。步骤(iii)中提取的样品也可以，或者替代的，进行鉴定存在的(如果有的话)微生物的步骤。在第二个实施方案中，患者样品在允许微生物生长的条件下孵育，子样品可以通过n次取出(其中n是2或者更大的整数，例如2、3、4、5、6、7、8、9或者10)。每个子样品被灭活，裂解和测量。因此本发明提供一种检测液体样品中关注的细胞存在与否的方法，其中O)样品(i)包括胞外介质，所述介质包含具有可测活性的酶；和(ii)被怀疑包含关注的细胞，所述细胞包含具有所述可测活性的胞内酶；(b)所述方法包括以下步骤(i)在允许微生物生长的条件下孵育样品；(ii)在第一个时间点从样品提取第一个子样品；(iii)用试剂处理第一个子样品，所述试剂能够灭活胞外介质中的所述可测活性，但不灭活所述关注细胞中的可测活性；(iv)裂解所述关注的细胞释放胞内酶；和(V)检测所述可测活性；(Vi)在第二个时间点从样品提取第二个子样品；(vii)用试剂处理第二个子样品，所述试剂能够灭活胞外介质中的所述可测活性，但不灭活所述关注细胞中的可测活性；(viii)裂解所述关注的细胞释放胞内酶；和(ix)检测所述可测活性，其中在所述第一个时间点和所述第二个时间点之间的可测活性的增加表明所述关注细胞在所述时间点之间的生长。通过对平行样品实施所述的方法，这些方法可用于抗微生物敏感性检测，其中一种样品是用抗微生物剂处理。未处理的样品作为对照，表明样品中的正常生长；在用抗微生物剂处理的样品中，微生物生长可以与对照的生长进行比较，更低的生长率(包括没有生长，或者甚至降低)表明微生物对抗微生物剂敏感，相应的可以做出对患者治疗的决定。这个方法在图1中说明，并且它可以对一系列抗菌剂平行进行。为检测微生物数量随时间是上升、下降还是保持不变，优选的使用定量技术。AK/荧光素酶分析满足这个要求。本发明类似地可以用于产生杀伤曲线，其中在给定浓度的抗微生物剂效果随时间变化。如果抗微生物剂在不同浓度检测，本发明可用于鉴定抗微生物剂的最低抑制浓度(MIC)(即可以抑制给定微生物生长的特定抗微生物剂的最低浓度)或者最小杀菌浓度(即杀死给定微生物的最低浓度)。根据本发明，可以检测多个抗微生物剂(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或者更多)。此外，优选的可以检测各抗微生物剂的多个浓度(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或者更多)，并且优选的在4和8个之间(例如6)。优选浓度范围在0.05到150mg/ml之间，更优选的在0.125到16mg/1之间，或者甚至直到128mg/ml。所述范围优选的跨越一种抗微生物剂的己知折点(break-point)。通常，对单一AST、MIC或者MBC检测，本发明的方法可能涉及向样品中添加预定浓度的抗微生物剂；在抗微生物剂存在的条件下孵育样品预定的时间段(例如大于在无抗微生物剂存在条件下的生长的21og的s时间段)；在所述时间段的末尾检测样品中微生物的数百。对完整的AST检测，本发明的方法可以涉及向多个不同的子样品中添加预定浓度的多个不同抗微生物剂；在抗微生物剂存在的条件下孵育子样品预定的时间段；在所述时间段末尾检测子样品中的微生物数目。对完整的MIC或者MBC检测，本发明的方法可以涉及向多个不同的子样品中添加多个预定浓度的抗微生物剂；在抗微生物剂存在的条件下孵育子样品预定的时间段；在所述时间段末尾检测子样品中的微生物数目。为进行杀菌曲线检测，本发明的方法可以涉及向子样品中添加预定浓度的抗微生物剂；在抗微生物剂存在的条件下孵育子样品预定的时间段；在所述时间段内多个时间点检测子样品中的微生物数目。检测可能包括在零时间检测子样品中微生物数目的步骤。在第一个实施方案中，这可能发生在培养物建立之前、期间或者之后。本发明的方法可能还包括使用抗菌检测步骤的结果计算患者样本中给定微生物的MIC禾Q/或MBC值。MIC值可以表示为真实MICs，简化MICs，或者计算MICs。如上面所解释，抗菌检测通常伴随对照分析，其中微生物在无抗微生物剂存在的条件下孵育。此外，本发明的方法可能包括对照检测。典型的阴性对照可以在基本培养基上进行所述方法，等等。通常，在特定时间所取的样品中微生物数目的测定不是立即进行的。因此一旦将进行检测，典型的方法需要抑制子样品中的进一步生长。通过添加"终止溶液"例如叠氮化物，通过冷却或者速冻，通过裂解，等等，进一步生长可以被抑制。孵育步骤优选的发生在预定温度，例如37士2"C。如果需要可以使用更高的温度，例如在4rc大肠杆菌倍增时间是7分钟，与此相对在37。C是20分钟，所以更高的温度可以加快分析。更高的温度也有利于一些生长迟缓的生物体。不同微生物的温度偏爱在微生物学中是公知的，本发明使用的温度可以相应改变。术语"抗微生物剂"是指能够杀伤或者抑制微生物生长的任意物质(通常是有机化合物)。所述术语包括天然和合成的化合物。它包括其范围内的抗生素，抗真菌药和抗病毒药，抗生素是抗微生物剂的优选亚组。可能被检测的抗微生物剂类型包括beta-内酰胺，氨基糖苷类，氟喹诺酮类，磺胺，糖肽，碳青霉烯类，唑类，噁唑烷酮类，大环内酯，喹诺酮类，四环素，等等。本发明使用的典型抗微生物剂青霉素，羟氨苄青霉素，环丙沙星，头孢噻吩素，氨苄青霉素，安美汀，利奈唑胺，庆大霉素，flucluxacimn，万古霉素，氯霉素，四环素，美满霉素，磺胺，噁唑烷酮类，氟康唑，硝化呋喃托英，甲氧苄氨嘧啶，萘啶酸，两性霉素，卡那霉素，链霉素，阿糖腺苷，阿昔洛韦，更昔洛韦，AZT(叠氮胸苷)，3TC(拉米夫定)，等等。本发明还可以用于检测两种或更多抗微生物剂的混合物的效果。检测组合可以鉴定抗微生物剂之间对特异提取的微生物的阳性或者阴性协同作用。不同的抗微生物剂通常具有不同的活性谱，例如它们可能是缓慢-或者快速-作用。各种抗微生物剂检测因此是不同的。本发明涉及已知抗微生物剂的使用，但是，本发明可以根据任意特定抗微生物剂的模式改变。如果使用的抗微生物剂是对一种特定类型的微生物(例如对革兰氏阴性细菌特异，或者是对特定生物体的细胞溶解酶或者噬菌体特异，例如溶葡萄球菌素)特异的，则灭活后裂解可以发生在多个阶段，例如第一阶段其中第一个亚群的关注细胞被裂解和分析，第二阶段其中第二个亚群的关注细胞被裂解和分析，等等。因此在初始裂解和灭活后残留的不同细胞类型可以被鉴别，再次通过特异的裂解。其他方法步骤除了包括处理液体样品以灭活可测活性、裂解关注的细胞以释放胞内酶和检测释放活性的步骤，本发明的方法可以包括其他步骤。如上所述，在关注的细胞被裂解前，它们可以被培养增加细胞数目。不同的生物体通常具有不同的最适生长条件(培养基，好氧/厌氧，温度，等等)。例如，链球菌在Todd-Hewitt培养基上生长良好，而金黄色葡萄球菌偏好蛋白胨。因此本发明可以利用许多不同的条件，但是为简单起见，优选折衷采用"通用"培养基例如BHI(脑心浸液)。生长培养基的选择最终取决于待分析的微生物的选择，这种选择是本领域技术人员熟知的。生长培养基的选择可能依赖地理位置，例如EU和USA具有不同的标准方法。本发明的方法可能包括微生物鉴定的步骤，例如以在AST前检测样品中微生物的类型。这种鉴定可以基于表型(例如形态学，生长特点，等等)，而且基于基因型的技术是现有的[17]，允许根据核酸序列鉴定微生物(例如PCR的使用已经被广泛描述[例如参考文献18到23])，并且这些技术快捷、灵敏和特异。在裂解关注的细胞前，本发明的方法可能涉及检测可测的活性。因此，例如样品中血细胞的数目也可以被测定。裂解后，可以在固相支持物上俘获核酸用于分析。固相支持物可以是用于初始分离的颗粒，或者可以是独立的支持物。核酸可以是DNA，RNA或者任意其天然存在或者合成的修饰物，及其组合。但是优选核酸是DNA，它可以是单链或者双链或者任意其他形式，例如线性或者环状。如果希望从DNA除去RNA，这可以通过添加RNase或者碱例如NaOH来完成。本发明还提供一种筛选血液样品(例如预期用于输血)中病原体存在的方法，包括对样品施行本发明的方法的步骤。如果所述方法得出阴性结果(即关注的细胞不存在)，则血液样品可以被批准用于输血；如果它得出阳性结果(即关注的细胞存在)，则血液样品不能用于输血。在筛选中，鉴定特定病原体的存在可能是不重要的，因为任意病原体的存在都表示样品应该是不合格的。部分方法
技术领域：
：本发明的方法包括灭活，裂解和测量这三个基本步骤，这些可以发生在不同的时间和地方。例如，本领域或者医院的医生提取和灭活血液样品。微生物的生长和测量可能在别处的实验室进行。因此本发明提供一种检测液体样品中关注的细胞存在与否的方法，其中-(a)样品(i)包括已经用试剂处理的液体样品，所述试剂灭活胞外介质中的可测活性，但不灭活所述关注细胞中的可测活性；和(ii)被怀疑包含关注的细胞，所述细胞包含具有所述可测活性的胞内酶；(b)所述方法包括以下步骤(i)裂解所述关注的细胞以释放胞内酶；和(ii)检测所述可测的活性。类似地，本发明提供一种处理液体样品的方法，其中(a)样品(i)包括胞外介质，所述介质包含具有可测活性的酶；和(ii)被怀疑包含关注的细胞，所述细胞包含具有所述可测活性的胞内酶；(b)所述方法包括以下步骤(i)用试剂处理液体样品，所述试剂灭活胞外介质中的可测活性，但不灭活所述关注细胞中的可测活性。本发明类似的部分方法是显而易见的。通用术语术语"包括"意指"包含"以及"由…组成"，例如"包括"X的组合物可能仅由X组成，或者可能包括一些其他物质例如X+Y。单词"基本的"不排除"完全的"，例如一种"基本上不含"Y的组合物可能完全不含Y。当必要时，单词"基本的"可以在本发明的定义中被忽略。与数值X相关的术语"大约"表示，例如X±10%。除非特别声明，一个包括混合两种或更多成分步骤的方法不需要特定混合顺序。因此成分可以任意顺序混合。当存在三种成分时，先是两种成分互相混合，然后组合物再与第三种成分混合，等等。当酶被描述为"胞内"，这个术语通常用于表示"非胞外"，其意义是酶在灭活期间对位于胞外的灭活试剂而言是不可接近的。胞内酶可能在胞内定位不同，包括在细胞外膜的内表面上、在外膜的外表面上但是在灭活期间例如通过生物体包膜得到保护、在内膜里、在细胞周质里、在细胞器里，等等。附图简述图1说明本发明用于抗微生物敏感性的检测。图2和3显示当与胰蛋白酶孵育时，AK活性的下降。图2显示细菌AK活性，图3显示裂解血液中的AK活性。图3B是图3A底部的放大。图4到14显示AK存在条件下的细菌生长。细菌是(4)大肠杆菌;(5)粪肠球菌；(6)铜绿假单胞菌；(7)金黄色葡萄球菌；(8)肺炎克雷伯菌;(9)阴沟肠杆菌；(IO)产酸克雷伯氏菌；(ll)普通变形杆菌；(12)鲍曼不动杆菌；(13)肠炎沙门氏菌;和(14)粘质沙雷菌。图15显示胰蛋白酶消化造成的血液AK活性降低。图2到15中的Y轴显示"RLU"(相对光单位)值。X轴显示以分钟(图2和3)或者小时(图4-15)为单位的时间。图16显示pH对AK活性的影响。图17显示胰蛋白酶消化造成的血小板AK活性降低，以及AK活性随时间的变化。淡阴影是血小板，浓阴影是血小板+胰蛋白酶。图18显示胰蛋白酶消化和不同的离心持续时间造成的血小板AK活性的降低。1=1分钟离心，无胰蛋白酶裂解；2=3分钟离心，无胰蛋白酶裂解；3=1分钟，胰蛋白酶裂解；和4二3分钟，胰蛋白酶裂解。图19到24显示从与不同的蛋白酶孵育的不同细菌提取的腺苷酸激酶。细菌是(19)表皮葡萄球菌(S.epidermis)(AC086),(20)金黄色葡萄球菌(AC082),(21)大肠杆菌(AC024)，(22)粪肠球菌(AC012)，(23)铜绿假单胞菌(AC044)和(24)MRSA(AC145)。图25对30显示在粘菌素、环丙沙星和苯唑青霉素存在的培养条件下，不同蛋白酶对细菌的影响。细菌是(25)金黄色葡萄球菌(AC082)，(26)表皮葡萄球菌(AC086)，(27)MRSA(AC145),(28)大肠杆菌(AC024),(29)铜绿假单胞菌(AC044)和(30)粪肠球菌(AC012)。图19到30中的Y轴显示"RLU"(相对光单位)值，校准为到t=0。校准化是通过将每个时间点的平均值除以t-0时的平均值得到的。X轴显示以分钟为单位的时间。施行本发明的方式实验工作使用腺苷酸激酶产生的ATP驱动荧光素/荧光素酶活性，得到作为定量测量初始ATP水平的RLUs结果。所有AK检验在pH7.5和37'C进行。分析结果在室温下读数。在预实验中，通过降低pH进行腺苷酸激酶灭活。在后面的实验中，灭活使用pH7.5的猪胰蛋白酶。pH降低永久地灭活血液AK，而不影响胞内细菌AK，但是使用胰蛋白酶更高效并且更方便。因此，现在的分析规程是添加lml皂角苷/sps/ppg至lj10ml全血中一允许完全裂解(10-15分钟)。5,000rpm离心45分钟。除去悬浮物。在合适培养基(例如通常使用MH肉汤)中制备胰蛋白酶的10x浓縮液(10，000U/ml)存储液。在30-40mlMH中重悬沉淀(如果需要对于高背景样品这里可以包括第二次离心/重悬浮("洗涤"步骤))。以1/10稀释比例添加胰蛋白酶存储液到最终重悬浮样品中(得到终浓度1,000U/ml)。在37'C孵育所需孵育步骤的时间段一通常4-5小时，但是取决于细菌生长速率。检测AK活性(见下文)。降低pH灭活AK为评价pH对AK活性的影响，在不同pH条件下孵育纯化的酶1小时，用pH7.5作为对照(正常分析条件)。利用生物发光的荧光素/荧光素酶检测AK产生的ATP，检测AK活性。结果如下(图16):<table>complextableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>在其他实验中，检测了三种处理条件(i)対-照，在pH7.5进行，无pH改变；(ii)在分析前短暂的pH下降，pH降低到pH4然后回到pH7.5;禾P(iii)酸孵育，pH降低到pH4保持15分钟。然后检定AK活性。在平行检测中，评定这些pH条件对大肠杆菌和粪肠球菌活性的影响。结果如下(％):<table>complextableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>因此在pH4的孵育可以基本上灭活AK(例如活性降低10倍)，而对相同样品中的细菌活性不会造成实质性损伤，不会灭活它们的胞内AK。因此酸性条件可以用于灭活胞外AK，而不破坏胞内AK的下游分析。胰蛋白酶对照在预实验中，评定胰蛋白酶对生物发光系统的影响。不同浓度的胰蛋白酶样品，在Mueller-ffinton(MH)肉汤中稀释，与ATP混合。结果如下<table>complextableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>因此几乎没有或者没有与胰蛋白酶相关的背景ATP产生活性，尽管在5000单位/ml(U/ml)信号显示"升高"。当胰蛋白酶水平<1000U/ml时，对生物发光反应只有最小量影响/无影响。胞内细菌AK的胰蛋白酶消化104和105cfu/ml浓度的大肠杆菌和粪肠球菌与包含1000、200和0(对照)U/ml胰蛋白酶的MH肉汤混合。立即进行分析。结果如下.-<table>Complextableseetheoriginaldocumentpagex</column></row><table>因此裂解细菌产生的AK信号只有大约10-20%在AK反应期间由于胰蛋白酶消化而损失。随时间由胰蛋白酶引起的AK降低在用MH肉汤稀释的5000、1000、200和0(对照)U/ml胰蛋白酶("胰蛋白酶/MH")中，纯化的AK(B.stearothermophilus)或者皂角苷裂解的血液的10—3稀释液在37。C孵育1小时。在0、15分钟、30分钟和1小时取出等分试样进行分析。细菌AK随时间活性的下降如图2所示。裂解的血细胞的AK活性随时间的下降如图3所示。因此裂解的血液中的AK被胰蛋白酶快速消化。即使在零时间(即取出等分试样和分析样品的时间长度)，在更高的胰蛋白酶浓度可以观察到信号的显著降低。当胰蛋白酶被添加到裂解血液中时，随时间显示到达更低的平台期，这在纯化的细菌AK中是不显著的，表明血液中的小比例AK难以被胰蛋白酶接近(例如在未裂解细胞内)。这个平台期还源于细胞ATP的存在，所述ATP不受蛋白酶的影响。裂解血液中的AK降解发生得明显比纯化的细菌AK更快。此外，己经发现Gram-ve细菌的AK比Gram+ve细菌的AK降解的更快。尽管细菌AK被降解，但并没有裂解血液中的AK降解发生的那样剧烈或者迅速。综合上面给定的结果，在从裂解细菌释放后细菌AK只降低10-20%,这些数据表明细菌AK比哺乳动物血液AK对胰蛋白酶降解更不敏感，这在使用胰蛋白酶灭活血液来源的AK时提供额外的优势，不用受胞内细菌酶的干扰。这个效果可能与作为纯化的AK来源的起源生物体的嗜热性质有关。不同蛋白酶对不同生物体随时间AK的降低实验按照如上所述的类似方式进行，描述如下。细菌腺苷酸激酶的回收和检领iJ1.从板上刮下细菌，接种在大约20ml肉汤中。这些在37T:孵育过夜。2.10x酶存储液在肉汤中制备a.10mg16，000U/mg胰蛋白酶添加到16ml肉汤中得到10，000U/mlUOx)存储液。b.25mg4U/mg木瓜蛋白酶添加到1ml肉汤中得到100U/ml(10x)存储液。c.10mg7.5U/mg蛋白酶K添加到3ml肉汤中得到25U/ml(10x)存储液。d.10.5/xl239U/ml糜蛋白酶添加到239.5/>d肉汤中得到10U/ml存储液。3.然后接种物在大约14030RCF离心1小时。4.取出上清液，检测腺苷酸激酶活性(如下所述)，只有如果需要用肉汤稀释得到大约105cpm/ml。5.然后在零时间点分析上清液的腺苷酸激酶活性，一式三份，取平均值。6.用正确浓度的酶，或者肉汤作为对照制备上清液的1.5ml溶液。这些在37t:孵育。7.取出样品，在10、30、60和120分钟处一式三份检测腺苷酸激酶活性。8.取三份平均值，通过除以零时间点的平均值而校准。腺苷酸激酶分析(只有AK，没有细胞)1.添加100Ml样品到试管中。2.添加50Ad试剂1(只有ADP;没有裂解试剂)，短暂涡旋振荡。3.5分钟后，试管放入光度计中。4.直接向样品中添加50/xl试剂2(稀释液和荧光素/荧光素酶)。5.立即读数RLU。从不同生物体提取AK，用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶或者蛋白酶K处理。各种蛋白酶降解AK的方式与胰蛋白酶相似。结果如图19(表皮葡萄球菌)，20(金黄色葡萄球菌)，21(大肠杆菌)，22(粪肠球菌)，23(铜绿假单胞菌)和24(MRSA)所示。胰蛋白酶仍然是蛋白酶的选择，因为其对G+和G—细菌是一致的。胰蛋白酶对生物体的影响为评定胰蛋白酶是否影响细菌生长，10、fu/ml生物体加入1000、200和0(对照)U/ml胰蛋白酶/MH样品。这些混合物在37。C孵育3小时，在0、1、2和3小时处取等分试样分析。结果如图4到14所示。因此胰蛋白酶在1000和200U/ml处对检测的11种生物体具有最小(如果有的话)的影响。金黄色葡萄球菌的结果起初表明生长被胰蛋白酶抑制，但是进一步检査显示情况不是这样，明显的生长抑制起因于抽样误差。因此，对所有ll种细菌，胰蛋白酶可以在整个细菌孵育期间存在而不影响生长。不同浓度裂解血液中AK的胰蛋白酶消化皂角苷裂解血液被系列稀释，与1000或者200U/ml胰蛋白酶/MH混合。混合物在37"C孵育4小时，在0、1、2、3和4小时取等分试样分析。AK分析的结果如图15所示。利用10"稀释的血液和1000U/ml胰蛋白酶，在4小时内背景从大约108减少到4,000RLU，降低25,000倍。在1000U/ml处大部分的AK消化看起来发生在最初2小时内。背景的减少然后减慢，稳定在一定水平，平台期似乎取决于起始背景水平。这表明一部分哺乳动物AK或者难以接近或者不受胰蛋白酶影响，或者信号不是AK相关的。利用胰蛋白酶检查在裂解血液背景下的生物体生长大约102cfu/ml生物体添加到用MH10"稀释的裂解血液，包含1000U/ml胰蛋白酶。这在37。C孵育4小时，在0、1、2、3禾B4小时取等分试样分析。结果如下<formula>complextableseeoriginaldocumentpage28</formula>基于这些102cfu/ml的起始生物体浓度，使用1000U/ml胰蛋白酶，2小时内大肠杆菌和粪肠球菌将在大约106RLUs的初始背景中可见，铜绿假单胞菌将在4小时内可见。因此即使存在高的AK背景，少量生物体也可在血液中相对高背景在<4小时内被检测到。检查血小板的胰蛋白酶处理向0.5mL己污染的血小板试样中添加40pL5%TritonX-100溶液和15(^1P-Per，然后在室温轻轻振荡孵育10分钟。然后将混合物在13000rpm离心3.5分钟。然后除去上清，通过重复吸取将沉淀重悬于1.5ml无菌水中。然后将混合物在13000rpm离心3.5分钟。然后除去上清，沉淀重悬于含有1000U/ml胰蛋白酶的0.5mlLB肉汤中，在37。C孵育20分钟。然后如上所述以最长4小时的间隔检测AK活性。结果(图17和18)表明所述分析可用于在低至10、1()S生物体/ml水平上检测血小板的污染。蛋白酶对抗生素中全体细菌生物体的影响进行分析(如下所述)判断蛋白酶存在对抗生素活性的影响。细菌腺苷酸激酶的回收和检测1.从板上刮下的细菌接种于lml肉汤，在37r孵育1小时。2.通过向200ml肉汤中添加3个抗生素片(粘菌素、环丙沙星和苯唑青霉素)制备抗生素肉汤。3.靶菌株(例如MRSA)或者抗性菌株(例如S.epidermidis)被稀释到大约105cpm/ml，而非耙或者敏感菌株被稀释到大约106cpm/ml。4.在抗生素肉汤中建立酶储液(如上所述)。5.如下所示建立1.98ml溶液，在37'C孵育1小时。<table>complextableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>6.细菌稀释液(来自步骤3)然后被稀释100倍，一式三份分析腺苷酸激酶活性，取平均值。这被用作零时间点的平均值。7.然后向溶液(来自步骤5)中添加20Ml合适的细菌稀释液(来自步骤3),在37。C孵育。8.—式三份在指定时间点分析样品的腺苷酸激酶。9.取三份平均值，通过除以零时间点的平均值而校准。结果(参见图25-30)证明抗生素不受蛋白酶的影响，仍然能够杀伤和裂解，部分或者完全的取决于抗生素和靶细菌、不需要的非靶细菌。尤其是，含酶的样品通常给出比对照更低的RLU，因为释放的AK被降解。这对于革兰氏阴性细菌(大肠杆菌和铜绿假单胞菌)来说尤其是更值得关注的，因为蛋白酶降解它们AK的效率更高。S.epidermidis也深受酶的影响。粪肠球菌生长缓慢但显示不受酶影响。它是有抗性的，因此生长，不能裂解充分使酶到达AK并降低RLU。更重要的，MRSA生长显示不受酶和抗生素影响。因此，所述结果显示蛋白酶不干扰抗生素。应该理解本发明只是通过示例的方式进行描述，只要在本发明的范围和实质内就可以做出修改。参考文献(其内容在此引入作为参考)http:〃www.altcorp.com/AffinityLaboratory/introgcf.htmWO94/17202.WO96/02665.Squirrell等人.(1994)Adenylatekinaseasacellmarkerinbioluminescentassays.In:CampbellAK，KrickaLJ，StanleyPE(editors).BioluminescenceandChemiluminescence:FundamentalsandAppliedAspects.Chichester:JohnWileyandSons,pages486-9.Sanders(1994)ArapidbioluminescenttechniqueforthedetectionandidentificationofListeriamonocytogenesinthepresenceofListeriainnocua.Pages454-7ofsamevolumeasforref.4.WO00/700S2.Blasco等人(1998)JournalofAppliedMicrobiology[8]WO00/46357.[9]W099/23489.Bean等人.(1992)InternationalJournalofCellCloning10:190-5.Konstantinova(1972)DoklAkadNaukSSSR203:1204-6.Perrier等人.(1998)JBiolChem273:19097-101.Fraser等人.(1997)BiochemJ323:711-8.Balows(1974)Currenttechniquesforantibioticsusceptibilitytesting.ISBN:0398028869.Smaill(2000)CanJGastroenterol14:871-875.Baquero(1990)EurJClinMicrobiolInfectDis9:492-495.Baselski(1996)ClinLabMed.16:49-60.Kassimi等人.(2002)JVirolMethods101:197-206.Zhang&Weint認b(1998)JClinMicrobiol36:3545-3548.Dowd等人.(1998)ApplEnvironMicrobiol64:333-336.Li等人.(1996)JClinMicrobiol34:1903-1907.Shetab等人.(1998)JClinMicrobiol36:1729-1732.Homes等人.(1991)JClinMicrobiol29:2375-2379.权利要求1.一种检测液体样品中关注的细胞存在与否的方法，其中(a)样品(i)包括胞外介质，所述介质包含具有可测活性的酶；和(ii)被怀疑包含关注的细胞，所述细胞包含具有所述可测活性的胞内酶；(b)所述方法包括以下步骤(i)用一种试剂处理液体样品，所述试剂能够灭活胞外介质中的所述可测活性，但不灭活所述关注细胞中的可测活性；(ii)裂解所述关注的细胞释放胞内酶；和(iii)检测所述可测活性。2.权利要求l所述的方法，其中关注的细胞是微生物细胞。3.权利要求2所述的方法，其中关注的细胞是细菌细胞。4.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中液体样品是血液样叩o5.权利要求4所述的方法，其中血液样品是其中血细胞已经被裂解而微生物细胞保存完整的血液样品。6.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中可测的酶活性是腺苷酸激酶活性。7.权利要求6所述的方法，其中腺苷酸激酶活性是ATP产量，并通过荧光素酶/荧光素反应检测。8.上述权利要求中任意一项所述的方法，其中试剂是蛋白酶。9.权利要求8所述的方法，其中蛋白酶是胰蛋白酶。10.—种试剂盒，包括蛋白酶，和下列试剂中的至少一种ADP;可溶性镁盐；可溶性锌盐；荧光素酶；荧光素；皂角苷；和/或消泡剂，例如聚丙二醇。11.一种包括裂解试剂和蛋白酶的反应容器。所述容器通常是一次性的管，并且适合于接收血液样品进行一步法血液裂解和腺苷酸激酶灭活步骤。全文摘要一种检测液体样品中关注的细胞存在与否的方法，其中(a)样品(i)包括胞外介质，所述介质包含具有可测活性的酶；和(ii)被怀疑包含关注的细胞，所属细胞包含具有所述可测活性的酶；和(b)所述方法包括以下步骤(i)用试剂处理液体样品，所述试剂灭活胞外介质中的所述可测活性，但不灭活所述关注细胞中的可测活性；(ii)裂解关注的细胞释放胞内酶；和(iii)检测所述可测活性。因此胞内酶的检测可以不受胞外酶干扰。利用基于腺苷酸激酶活性的检测方法，本发明尤其有利于被细菌感染的血液的处理。文档编号C12Q1/06GK101198705SQ200680015423公开日2008年6月11日申请日期2006年5月3日优先权日2005年5月3日发明者罗伯特·韦森索尔,马克·格林申请人:阿柯立特拜奥麦迪卡有限公司