本发明涉及一种生物酶法制备泼尼松龙的方法，属于生物制药和生物化工的技术领域。
背景技术：
泼尼松龙为肾上腺皮质激素类药物,主要用于各种急性严重细菌感染、严重过敏性疾病，胶原性疾病，风湿、类风湿性关节炎，严重支气管哮喘等。同时，泼尼松龙在甾体药物领域应用极为广泛，是合成曲安奈德、16α-羟基泼尼松龙等药物的重要中间体。其结构式如下：
目前，制备泼尼松龙的方法主要有以下几种：
(1)以甾体母核为原料通过多步化学反应制备泼尼松龙；例如，中国专利文献cn101397324a中公开了以17α-羟基-1,4,9-三烯孕甾-3.20-二酮为原料，经过多步的化学合成步骤得到泼尼松龙。其合成路线如下：
另外，中国专利文献cν101397324a、cν1361108a、cn105384790a等中公开了相似的多步化学合成制备泼尼松龙的方法。但是，此类方法普遍存在工艺路线、工艺流程复杂，生产周期比较长，总收率较低以及对环境不友好等缺点，正是这些短板使得泼尼松龙的生产成本居高不下。
(2)以氢化可的松为原料，通过1，2位脱氢工序制备泼尼松龙，其合成路线如下：
甾体的1，2位脱氢的方法一般包括化学法、生物发酵法等。化学法脱氢一般需要使用seo2，收率比较低，而且seo2是剧毒物对环境污染很大，目前已逐渐被生物法取代。
关于生物发酵法，在中国专利文献cn102206696a和cn101760495a中公开了微生物发酵和细胞转化制备产物，这些方法虽然避免了化学法的上述缺陷，但是，通常涉及菌种选择、发酵、转化和提纯等多个步骤，并且存在着底物浓度低、转化时间久(一般大于60小时)、转化率和收率都比较低、分离纯化比较困难等缺点。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是现有技术中的生物发酵法制备泼尼松龙的制备工艺复杂、耗时长、转化率低、产率低、精制难度高的问题，进而提供一种低成本、易于制备、转化率高、产率高、产品纯度高的生物酶法制备泼尼松龙的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种生物酶法制备泼尼松龙的方法，包括如下步骤：取氢化可的松溶解于缓冲溶液中，加入助溶剂、氢受体,再向其中加入催化酶，在25-35℃下反应，即得到的泼尼松龙。
需要说明的是，所述氢化可的松的cas号为50-23-7，其结构式如下所示：
本发明所述的生物酶法制备泼尼松龙的方法，合成路线如下：
优选地，所述催化酶为甾酮脱氢酶。
所述甾酮脱氢酶具有如seqidno.1所示的序列结构；所述seqidno.1为核苷酸序列，所述seqidno.1所示的序列结构如下：
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所述甾酮脱氢酶具有如seqidno.2所示的序列结构；所述seqidno.2为氨基酸序列，所述seqidno.2所示的序列结构如下：
mdwaeeydvlvagsgaggmagtytaareglsvclveagdkfggttaysggggawfpanpvllragtddtiedaleyyravvgdrtpadlqetyvrggaglvayleeddhfsfesypwpdyfgdapkarrdgqrhiiptplpvpsapelrevvrgpldndrlgtpqpddlfiggralvarfltalatyphatlvretalaelvvedgvvvgaivetdgvrrairarrgvllaaggfeandelrqkygvpgvardtmgpptnvgaahqaaiavgadtdlmgeawwspglthpdgrsafalwftggifvdgagrrfvnesapydrlgravidhlteggvtprywmvydhkegsippvratnvsmvdeeqyvaaglwhtadtlpelaaligvpadalvatvarfnelvadgydadfgrggeaydrffsggepplvsidegpfhaaafgisdlgtkgglrtdtsarvltadgtpigglyaagntmaapsgttypgggnpigtsmlfshlavrhmgtedar。
所述甾酮脱氢酶包括但不限于具有与序列1、2相对应的氨基酸序列的酶。具有序列的酶与序列1、2相对应或与序列1、2至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
优选地，所述缓冲溶液为ph值为7.0-9.0、浓度为0.01-0.2mol/l的pbs缓冲溶液。
需要说明的是，所述缓冲溶液包括但不限于pbs缓冲溶液，只要能够在酶催化反应时，起到保持盐平衡、调整的适宜ph的缓冲作用即可。所述pbs缓冲溶液是指磷酸盐缓冲溶液，其成分包括但不限于na2hpo4、kh2po4、nacl、kcl，本领域技术人员根据实际需求可对其成分进行调整。
优选地，向所述缓冲溶液中加入所述氢化可的松的同时，还加入甲萘醌、1,4-萘醌、5-甲基吩嗪硫酸甲酯、蒽醌、β-环糊精中的一种或多种。
进一步优选地，先将所述甲萘醌、1,4-萘醌、5-甲基吩嗪硫酸甲酯、蒽醌、β-环糊精中的一种或多种溶解于有机溶剂中，再加入所述缓冲溶液中。
优选地，所述有机溶剂为dmf或dmso。所述dmf是指二甲基甲酰胺；所述dmso是指二甲基亚砜。
优选地，本发明所述的生物酶法制备泼尼松龙的方法，具体包括如下步骤：取所述氢化可的松溶解于所述缓冲溶液中，再向其中加入催化酶，在25-35℃下搅拌反应，反应结束后抽滤，取滤饼，将滤饼洗涤，干燥，即得到的泼尼松龙。
优选地，所述抽滤在0℃下进行。
优选地，所述洗涤滤饼在0℃下进行，并采用乙酸乙酯洗涤滤饼。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
(1)本发明所述的生物酶法制备泼尼松龙的方法，生物转化所用的酶的量比较少，并且底物的浓度可以做到60克/升以上,与发酵法制备泼尼松龙相比，底物的浓度提高了30倍以上，大幅度降低了生产的成本，提高了反应效率；加之，本发明所述的生物酶法制备泼尼松龙的方法，能够在20小时内反应完全,与发酵法制备泼尼松龙相比，时间只需要其1/3，解决了其他制备泼尼松龙的方法耗时长的问题；
(2)本发明所述的生物酶法制备泼尼松龙的方法仅需一步催化反应即可得到泼尼松龙，操作简单，条件温和，转化率高(参见实施例)，反应的后处理简单，易操作，产生的三废量比较少，对环境友好，解决了泼尼松龙其他制备方法的操作复杂、收率低、分离纯化困难、污染大等缺点，适合大规模的工业化生产。
具体实施方式
以下结合实施例，对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。需要说明的是，实施例1-10中制备的所述泼尼松龙的合成路线如下所示：
实施例1
本实施例中制备所述泼尼松龙的方法具体为：
称取氢化可的松2.4克、甲萘醌1.4克，溶于240ml的ph值为8.0且浓度为0.1mol/l的pbs缓冲溶液，再向反应体系中加入甾酮脱氢酶粉0.12克(购自苏州引航生物科技有限公司，牌号为yh997，此处仅给出其中一种型号的产品予以阐述本发明的效果，市售各型号的产品之间效果并无差异，下同),保持30℃继续搅拌反应，反应结束即得到所述泼尼松龙。
作为本实施例的优选实施方式，采用hplc监控反应。在搅拌反应24小时后，hplc检测反应的转化率73％,延长反应时间转化率不再增加，即判断反应完毕。
作为本实施例的优选实现方式，将上述反应结束得到的含有所述泼尼松龙的反应液降至0℃减压抽滤，滤饼用0℃乙酸乙酯洗涤，收集滤饼减压干燥得到白色固体的泼尼松龙粗品，收率96％,粗品纯度70％。
需要说明的是，所述pbs缓冲溶液还可替换为其他缓冲溶液，只要能够在酶催化反应时，起到保持盐平衡、调整的适宜ph的缓冲作用即可。
作为本实施例可替换的实现方式，所述pbs缓冲溶液的ph值可替换为7.0-9.0中的任意值，浓度可替换为0.01-0.2mol/l中的任意值，并不影响本发明的目的的实现。同样地，所述搅拌反应的反应温度也可替换为25-35℃中的任意值。
实施例2-10中的缓冲溶液的ph值、浓度的选择以及搅拌反应的温度条件与本实施例相同，是可在上述范围内任意选择的，下文不再赘述。
实施例2
本实施例中制备所述泼尼松龙的方法具体为：
称取氢化可的松2.4克，甲萘醌1.4克,β-环糊精2.4克溶于240ml的ph值为8.0且浓度为0.1mol/l的pbs缓冲溶液，向反应体系中加入甾酮脱氢酶粉0.12克(购自苏州引航生物科技有限公司，牌号为yh997),保持30℃继续搅拌，hplc监控反应。24小时后，hplc检测反应的转化率85％,延长反应时间转化率不再增加。反应完毕，降至0℃减压抽滤，滤饼用0℃乙酸乙酯洗涤，收集滤饼减压干燥得到白色固体的泼尼松龙粗品，收率92％,粗品纯度83％。
实施例3
本实施例中制备所述泼尼松龙的方法具体为：
称取氢化可的松2.4克，甲萘醌1.4克溶于24ml的dmf置于一500ml的反应瓶中，在搅拌的同时控制体系温度在25-30℃缓慢滴加216ml的ph值为8.0且浓度为0.1mol/l的pbs缓冲溶液，滴加完毕向反应体系中加入甾酮脱氢酶粉0.12克(购自苏州引航生物科技有限公司，牌号为yh997),保持30℃继续搅拌，hplc监控反应。8小时后，hplc检测反应的转化率95％,反应完毕，降至0℃减压抽滤，滤饼用0℃乙酸乙酯洗涤，收集滤饼减压干燥得到白色固体的泼尼松龙粗品，收率96％,粗品纯度94％。
实施例4
本实施例中制备所述泼尼松龙的方法具体为：
称取氢化可的松2.4克，甲萘醌1.4克溶于24ml的dmso置于一500ml的反应瓶中，在搅拌的同时控制体系温度在25-30℃缓慢滴加216ml的ph值为8.0且浓度为0.1mol/l的pbs缓冲溶液，滴加完毕向反应体系中加入甾酮脱氢酶粉0.12克(购自苏州引航生物科技有限公司，牌号为yh997),保持30℃继续搅拌，hplc监控反应。8小时后，hplc检测反应的转化率98％,反应完毕，降至0℃减压抽滤，滤饼用0℃乙酸乙酯洗涤，收集滤饼减压干燥得到白色固体的泼尼松龙粗品，收率96％,粗品纯度97％。
实施例5
本实施例中制备所述泼尼松龙的方法具体为：
称取氢化可的松2克，蒽醌1.6克溶于20ml的dmso置于一500ml的反应瓶中，在搅拌的同时控制体系温度在25-30℃缓慢滴加180ml的ph值为8.0且浓度为0.1mol/l的pbs缓冲溶液，滴加完毕向反应体系中加入甾酮脱氢酶粉0.12克(购自苏州引航生物科技有限公司，牌号为yh997),保持30℃继续搅拌，hplc监控反应。16小时后，hplc检测反应的转化率93％,反应完毕，降至0℃减压抽滤，滤饼用0℃乙酸乙酯洗涤，收集滤饼减压干燥得到白色固体的泼尼松龙粗品，收率95％,粗品纯度90％。
实施例6
本实施例中制备所述泼尼松龙的方法具体为：
称取氢化可的松2克，5-甲基吩嗪硫酸甲酯2.5克溶于20ml的dmso置于一500ml的反应瓶中，在搅拌的同时控制体系温度在25-30℃缓慢滴加180ml的ph值为8.0且浓度为0.1mol/l的pbs缓冲溶液，滴加完毕向反应体系中加入甾酮脱氢酶粉0.12克(购自苏州引航生物科技有限公司，牌号为yh997),保持30℃继续搅拌，hplc监控反应。16小时后，hplc检测反应的转化率95％,反应完毕，降至0℃减压抽滤，滤饼用0℃乙酸乙酯洗涤，收集滤饼减压干燥得到白色固体的泼尼松龙粗品，收率97％,粗品纯度96％。
实施例7
本实施例中制备所述泼尼松龙的方法具体为：
称取氢化可的松2克，1,4-萘醌1.3克溶于20ml的dmso置于一500ml的反应瓶中，在搅拌的同时控制体系温度在25-30℃缓慢滴加180ml的ph值为8.0且浓度为0.1mol/l的pbs缓冲溶液，滴加完毕向反应体系中加入甾酮脱氢酶粉0.12克(购自苏州引航生物科技有限公司，牌号为yh997),保持30℃继续搅拌，hplc监控反应。16小时后，hplc检测反应的转化率97％,反应完毕，降至0℃减压抽滤，滤饼用0℃乙酸乙酯洗涤，收集滤饼减压干燥得到白色固体的泼尼松龙粗品，收率96％,粗品纯度96％。
实施例8
本实施例中制备所述泼尼松龙的方法具体为：
称取氢化可的松2.4克，甲萘醌0.7克溶于20ml的dmso置于一50ml的反应瓶中，在搅拌的同时控制体系温度在25-30℃缓慢滴加180ml的ph值为8.0且浓度为0.1mol/l的pbs缓冲溶液，滴加完毕向反应体系中加入甾酮脱氢酶粉0.12克(购自苏州引航生物科技有限公司，牌号为yh997),保持30℃继续搅拌，hplc监控反应。10小时后，hplc检测反应的转化率98％,反应完毕，降至0℃减压抽滤，滤饼用0℃乙酸乙酯洗涤，收集滤饼减压干燥得到白色固体的泼尼松龙粗品，收率95％,粗品纯度98％。
实施例9
本实施例中制备所述泼尼松龙的方法具体为：
称取氢化可的松6克，甲萘醌1.7克溶于24ml的dmso置于一500ml的反应瓶中，在搅拌的同时控制体系温度在25-30℃缓慢滴加216ml的ph值为8.0且浓度为0.1mol/l的pbs缓冲溶液，滴加完毕向反应体系中加入甾酮脱氢酶粉0.3克(购自苏州引航生物科技有限公司，牌号为yh997),保持30℃继续搅拌，hplc监控反应。16小时后，hplc检测反应的转化率98％,反应完毕，降至0℃减压抽滤，滤饼用0℃乙酸乙酯洗涤，收集滤饼减压干燥得到白色固体的泼尼松龙粗品，收率94％,粗品纯度98％。
实施例10
本实施例中制备所述泼尼松龙的方法具体为：
称取氢化可的松24克，甲萘醌6.8克溶于40ml的dmso置于一1l的反应瓶中，在搅拌的同时控制体系温度在25-30℃缓慢滴加360ml的ph值为8.0且浓度为0.1mol/l的pbs缓冲溶液，滴加完毕向反应体系中加入甾酮脱氢酶粉1.2克(购自苏州引航生物科技有限公司，牌号为yh997),保持30℃继续搅拌，hplc监控反应。20小时后，hplc检测反应的转化率98％,反应完毕，降至0℃减压抽滤，滤饼用0℃乙酸乙酯洗涤，收集滤饼减压干燥得到白色固体的泼尼松龙粗品，收率97％,粗品纯度98％。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。