一种辣椒花药直接获得植株的培养方法和培养基的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种辣椒花药直接获得植株的培养方法和培养基，属于植物细胞工程【技术领域】。所述培养方法包括：(1)、选取小孢子处于单核靠边期的花蕾；(2)、花蕾用70％酒精浸泡0.5～1分钟，12‰的氯化汞8～15分钟，无菌水冲洗3～5次，无菌滤纸吸干水分，得到单核靠边期的无菌花药；(3)、将单核靠边期的无菌花药漂浮于液体培养基中，黑暗震荡培养20～25天后转为光照震荡培养；(4)、光照震荡培养10～20天后，将形成的子叶型胚转至MSO固体培养基中培养，长成正常植株。本发明的培养方法具有以下优点：(1)、大大提高正常胚状体的诱导频率，显著提高正常植株的再生频率；(2)、操作过程简单，能够直接由自由散落于液体培养基的小孢子获得植株；(3)、适用于牛角椒、羊角椒、线椒、灯笼椒等多种类型的辣椒。
【专利说明】一种辣椒花药直接获得植株的培养方法和培养基
【技术领域】
[0001]本发明属于植物细胞工程【技术领域】，具体涉及一种辣椒花药直接获得植株的培养方法和培养基。
【背景技术】
[0002]尽管通过常规的花药培养，不少辣椒品种已获得了 DH植株，但是总体来说诱导频率还很低。所以如果能通过游离小孢子培养的方法获得大量胚状体，进而诱导发育成正常的再生植株，再通过人工加倍的方法获得DH植株，这将会大大提高育种效率。但是，要使目前的游离小孢子培养技术成为常规杂交育种手段的一部分，仍然存在很多问题，阻碍了其应用于大规模育种；其中最凸显的两个问题是:
[0003](I)、辣椒的小孢子胚诱导频率仍然处于较低水平。
[0004]如何提高辣椒的小孢子胚诱导频率，基因型被普遍认为是最重要的影响因素之一。小孢子的胚状体诱导频率因基因型不同而差异很大。Kim(2008年)将游离小孢子进行碳源饥饿培养，虽然获得了较高的胚状体诱导频率，但是只限于一个辣椒品种“Milyang-jare”。Koleva-Gudeva (2009年)等对21个不同基因型的辣椒进行花药培养，只有12个基因型诱导出胚状体。Nowaczyk等(200 9年)在19个辣椒品种中只有6个基因型得到胚状体，且诱导频率都较低。为了提高胚状体的诱导频率，Ge’mes Juha’sz等(2009年)尝试了不同基因型的辣椒和甜椒，并在小孢子诱导时期，加入麦芽糖以及与小麦的子房共培养，对于胚的诱导在数量及质量上都有促进作用。Lantos等(2009年)则是先饥饿培养花药，再游离小孢子，并与小麦或辣椒子房共培养来提高胚状体诱导频率。以上这些方法虽然一定程度上对小孢子胚状体诱导频率略有提高，但是畸形胚的比例并未减少，且方法繁琐，并不实用。因此建立一个诱导方法简单又具有较高胚状体诱导频率的辣椒小孢子培养体系成为当务之急。
[0005](2)、辣椒小孢子胚不能够正常发育，再生植株中正常植株的比例较低。
[0006]如何提高正常胚和正常再生植株的比例是辣椒花药和花粉培养中的另一重要问题。辣椒小孢子培养中，畸形胚的发生率较高，并存在球形胚发育停滞现象。在胚的发育过程中，从球形胚过渡到心形胚、子叶胚时，在解剖学及功能上都会出现不同程度的畸形，这是雄核发育过程中一个很突出的问题。目前，国际上运用较广泛的方法是Supena在2006年报道的固-液体双层培养法，但是利用该方法所获得的胚状体中，只有20%是正常胚，30%没有子叶及茎尖，50%只发育出幼根，平均一个花蕾只获得0.1棵植株(一个辣椒花蕾一般有6个花药)。Kim等(2008)、李春玲等(2008)和Parra-Vega等(2010)在辣椒游离小孢子培养过程中，都发现存在不能进一步发育成苗的球状胚和心形胚，以及大量无子叶或者无生长点的畸形胚的现象，且各种畸形胚比例高于正常胚。因此，如何降低胚状体诱导过程中畸形胚的比例成为当今辣椒单倍体育种中的一个重要课题。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于公开了一种辣椒花药直接获得植株的培养方法。
[0008]本发明的另一个目的在于公开了上述培养方法中培养无菌花药的培养基。
[0009]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0010]一种辣椒花药直接获得植株的培养方法，包括下述步骤:
[0011](I)、将单核靠边期的无菌花药漂浮于液体培养基中，黑暗震荡培养，20~25天后转为光照震荡培养；所述液体培养基的组成为:2500mg / L KN03、1025mg / L ΝΗ4Ν03、295mg / L CaCl2.2H20、325mg / L MgSO4.7H20、145mg / L KH2PO4,67mg / L(NH4)2SO4,75mg / L NaH2PO4.H2OUOOmg / L Ca (NO3) 2.4Η20、13mg / L KCl、13.9mg / L FeSO4.7Η20、18.65mg / L Na2.EDTA、0.695mg / L K1、3.15mg / L H3BO3,22.13mg / L MnSO4.H2O、3.625mg / L ZnSO4.7Η20、0.188mg / L Na2MoO4.2Η20、0.016mg / L CuSO4.5Η20、0.016mg /L CoCl2 *6H20> IOOmg / L 肌醇、5mg / L 烟酸、2mg / L 甘氨酸、0.5mg / L 盐酸硫氨素(维生素Bl)、0.5mg / L盐酸批卩多醇(维生素B6)、0.5mg/L叶酸、0.05mg / L生物素、800mg /L 谷氨酰胺、IOOmg / L 丝氨酸、30mg / L 谷胱甘肽(GSH)、0.1mg / L BA、0.1mg / L ΙΑΑ、
0.0lmg / L NAA,0.1%活性炭和6%蔗糖(即液体培养基是由Rm培养基的大量元素、Cm培养基的微量元素与铁盐、NLN培养基的有机成分、0.1mg / L BA、0.1mg / L ΙΑΑ、0.0lmg /L NAA、0.1 %活性炭和6%蔗糖组成，其中0.1 %活性炭和6%蔗糖是指IOOOml培养基中加入Ig活性炭和60g鹿糖)；
[0012](2)、光照震荡培养10~20天后，将形成的子叶型胚转至MSO固体培养基中培养，长成正常植株。
[0013]上述技术方案所述的一种辣椒花药直接获得植株的培养方法，其中，在所述方法之前还包括下述步骤:
[0014]⑴、选取小孢子处于单核靠边期的花蕾；
[0015](ii)、花蕾用70%酒精浸泡0.5~I分钟，1%。~2%。的氯化汞8~15分钟，无菌水冲洗3~5次，无菌滤纸吸干水分，得到单核靠边期的无菌花药。
[0016]上述技术方案所述的一种辣椒花药直接获得植株的培养方法，其中，将单核靠边期的无菌花药漂浮于液体培养基中的接种密度为5ml液体培养基中接种15~25个花药。
[0017]上述技术方案所述的一种辣椒花药直接获得植株的培养方法，其中，处于单核靠边期的花蕾是通过DAPI染色确定。
[0018]上述技术方案所述的一种辣椒花药直接获得植株的培养方法，其中，黑暗震荡培养和光照震荡培养时的摇床转速为40转 /分。
[0019]为了避免液体培养基在培养过程中因水分蒸发而改变渗透压，因此在上述技术方案的基础上，黑暗震荡培养和光照震荡培养中，每隔7~10天补足液体培养基至初始量。
[0020]上述技术方案所述培养方法中培养无菌花药的培养基，其中，所述液体培养基的组成为:2500mg / L KN03、1025mg / L NH4N03、295mg / L CaCl2.2H20、325mg / LMgSO4.7H20、145mg / L KH2PO4,67mg / L (NH4) 2S04、75mg / L NaH2PO4.H2O、IOOmg / LCa(NO3)2.4Η20、13mg / L KCl、13.9mg / L FeSO4.7Η20、18.65mg / L Na2.EDTA、0.695mg /L KI,3.15mg / L H3BO3,22.13mg / L MnSO4.H20,3.625mg / L ZnSO4.7H20、0.188mg /LNa2MoO4.2Η20、0.016mg / L CuSO4.5Η20、0.016mg / L CoCl2.6Η20、IOOmg / L 肌醇、5mg /L烟酸、2mg / L甘氨酸、0.5mg / L盐酸硫氨素(维生素BI)、0.5mg / L盐酸批卩多醇(维生素B6)、0.5mg / L叶酸、0.05mg / L生物素、800mg / L谷氨酰胺、IOOmg / L丝氨酸、30mg / L 谷胱甘肽(GSH) ,0.1mg / L BA,0.1mg / L IAA,0.0lmg / L NAA,0.1% 活性炭和6%鹿糖(即液体培养基是由Rm培养基的大量兀素、Cm培养基的微量兀素与铁盐、NLN培养基的有机成分、0.1mg / L BA、0.1mg / L ΙΑΑ、0.0lmg / L ΝΑΑ、0.I %活性炭和 6%鹿糖组成，其中0.1 %活性炭和6%蔗糖是指IOOOml培养基中加入Ig活性炭和60g蔗糖)。
[0021]本发明具有以下有益效果:
[0022]1、本发明的培养方法在前期采用了黑暗震荡培养，黑暗的环境有利于正常初胚的形成，同时震荡培养不仅有利于提高小孢子的释放率还能提高液体培养基的溶氧率，同时还能让释放出来的小孢子均匀地分布在液体培养基中，这些因素使正常胚状体的诱导频率大大提高，因而正常植株的再生频率也有显著提高；
[0023]2、本发明的培养方法操作简单，能够直接由自由散落于液体培养基的小孢子获得植株；
[0024]3、采用本发明的培养方法获得的胚状体及正常植株比例较高。
【具体实施方式】:
[0025]为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明一种辣椒花药直接获得植株的培养方法作进一步的说明。
[0026]实施例1:羊角型辣椒小孢子培养:
[0027]2012年6月从种植大棚取回花蕾，花粉经DAPI (4，6_联脒_2_苯基吲哚)染色确认发育时期为单核靠边期，花蕾的表面消毒是指经75 %酒精60秒，2%。升汞10分钟，无菌水冲洗5次。
[0028]小心将花药用小镊子取出，置于液体培养基中进行25°C黑暗震荡培养20-25天后转为光照震荡培养，黑暗震荡培养和光照震荡培养时的摇床转速为40转/分；该液体培养基的组成为:2500mg / L KN03、1025mg / L NH4N03、295mg / L CaCl2.2H20、325mg /L MgSO4.7H20、145mg / L KH2PO4,67mg / L (NH4) 2S04、75mg / L NaH2PO4.H2OUOOmg / LCa(NO3)2.4Η20、13mg / L KCl、13.9mg / L FeSO4.7Η20、18.65mg / L Na2.EDTA、0.695mg /L KI,3.15mg / L H3BO3,22.13mg / L MnSO4.H20,3.625mg / L ZnSO4.7H20、0.188mg / LNa2MoO4.2Η20、0.016mg / L CuSO4.5Η20、0.016mg / L CoCl2.6Η20、IOOmg / L 肌醇、5mg /L烟酸、2mg / L甘氨酸、0.5mg / L盐酸硫氨素(维生素BI)、0.5mg / L盐酸批卩多醇(维生素B6)、0.5mg / L叶酸、0.05mg / L生物素、800mg / L谷氨酰胺、IOOmg / L丝氨酸、30mg / L 谷胱甘肽(GSH) ,0.1mg / L BA,0.1mg / L IAA,0.0lmg / L NAA,0.1% 活性炭和6%鹿糖(即液体培养基是由Rm培养基的大量兀素、Cm培养基的微量兀素与铁盐、NLN培养基的有机成分、0.1mg / L BA、0.1mg / L ΙΑΑ、0.0lmg / L ΝΑΑ、0.I %活性炭和 6%鹿糖组成，其中0.1 %活性炭和6%蔗糖是指IOOOml培养基中加入Ig活性炭和60g蔗糖，液体培养基按照常规方法配制)；
[0029]黑暗震荡培养20-25天，肉眼可见胚性细胞团；转为光照震荡培养10-20天，已有胚状体产生。由于小孢子的诱导不同步，有些胚状体已到鱼雷期或是子叶期，还有些只是具有胚性结构的细胞团。挑出已分化出两片小子叶的胚状体转至MSO培养基，15-20天生长为正常的小植株，继而长成根系发达的正常完整植株，平均每20个花药产生15个胚状体，其中10个为正常胚状体，正常胚状体比例为67%，远远大于Supena在2006年报道的固液体双层培养法中20%的比例。在本实施例的黑暗震荡培养和光照震荡培养中，每隔7-10天补足液体培养基至初始量。
[0030]以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。 ·
【权利要求】
1.一种辣椒花药直接获得植株的培养方法，包括下述步骤: (1)、将单核靠边期的无菌花药漂浮于液体培养基中，黑暗震荡培养，20~25天后转为光照震荡培养；所述液体培养基的组成为:2500mg / L KN03、1025mg / L NH4NO3-295mg /L CaCl2.2H20、325mg / L MgSO4.7H20、145mg / L KH2PO4,67mg / L (NH4) 2S04、75mg /L NaH2PO4.H2OUOOmg / L Ca (NO3) 2.4H20、13mg / L KCl、13.9mg / L FeSO4.7H20、18.65mg / L Na2.EDTA、0.695mg / L K1、3.15mg / L H3BO3,22.13mg / L MnSO4.H2O、3.625mg / L ZnSO4.7Η20、0.188mg / L Na2MoO4.2Η20、0.016mg / L CuSO4.5Η20、0.016mg /L CoCl2.6H20> IOOmg / L 肌醇、5mg / L 烟酸、2mg / L 甘氨酸、0.5mg/L 盐酸硫氨素(维生素Bl)、0.5mg / L盐酸批卩多醇(维生素B6)、0.5mg/L叶酸、0.05mg / L生物素、800mg /L 谷氨酰胺、IOOmg / L 丝氨酸、30mg / L 谷胱甘肽(GSH)、0.1mg / L BA、0.1mg / L ΙΑΑ0.0lmg / L ΝΑΑ、0.I % 活性炭和 6% 鹿糖； (2)、光照震荡培养10~20天后，将形成的子叶型胚转至MSO固体培养基中培养，长成正常植株。
2.根据权利要求1所述的一种辣椒花药直接获得植株的培养方法，其特征在于，在所述方法之前还包括下述步骤: (i)、选取小孢子处于单核靠边期的花蕾； (ii)、花蕾用70%酒精浸泡0.5~I分钟，1%。~2%。的氯化汞8~15分钟，无菌水冲洗3~5次，无菌滤纸吸干水分，得到单核靠边期的无菌花药。
3.根据权利要求1或2所述的一种辣椒花药直接获得植株的培养方法，其特征在于:将单核靠边期的无菌花药漂浮于液体培养基中的接种密度为5ml液体培养基中接种15~25个花药。
4.根据权利要求1或2所述的一种辣椒花药直接获得植株的培养方法，其特征在于:处于单核靠边期的花蕾是通过DAPI染色确定。
5.根据权利要求1或2所述的一种辣椒花药直接获得植株的培养方法，其特征在于:黑暗震荡培养和光照震荡培养时的摇床转速为40转/分。
6.根据权利要求1或2所述的一种辣椒花药直接获得植株的培养方法，其特征在于:黑暗震荡培养和光照震荡培养中，每隔7~10天补足液体培养基至初始量。
7.权利要求1~6中所述培养方法中培养无菌花药的培养基，其特征在于:所述液体培养基的组成为:2500mg / L KN03、1025mg / L NH4N03、295mg / L CaCl2.2H20、325mg /L MgSO4.7H20、145mg / L KH2PO4,67mg / L (NH4) 2S04、75mg/L NaH2PO4.H2O、IOOmg / LCa(NO3)2.4Η20、13mg / L KCl、13.9mg / L FeSO4.7Η20、18.65mg / L Na2.EDTA、0.695mg /L KI,3.15mg / L H3BO3,22.13mg / L MnSO4.H20,3.625mg / L ZnSO4.7H20、0.188mg / LNa2MoO4.2Η20、0.016mg / L CuSO4.5Η20、0.016mg / L CoCl2.6Η20、IOOmg / L 肌醇、5mg /L烟酸、2mg / L甘氨酸、0.5mg / L盐酸硫氨素(维生素BI)、0.5mg / L盐酸批卩多醇(维生素 Β6)、0.5mg / L 叶酸、0.05mg / L 生物素、800mg / L谷氨酰胺、IOOmg / L 丝氨酸、30mg /L 谷胱甘肽(GSH)、0.Img / L BA,0.1mg / L IAA、0.01mg/LNAA、0.1%活性炭和 6%蔗糖。
【文档编号】A01H4/00GK103444542SQ201310414689
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月13日 优先权日:2013年9月13日
【发明者】邓晓梅, 李春玲, 张树根, 张军民, 张秦 申请人:北京海花生物科技有限公司, 北京市海淀区植物组织培养技术实验室