专利名称：大麦花药快速培养法及所用培养基的制作方法
技术领域：
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及大麦花药培养的优化培养基及其简单快速的培养方法。
背景技术：
大麦是世界第四大禾谷类作物，其种植面积和总产量仅次于小麦、水稻和玉米，主要用于动物饲料、麦芽制造、食品制造和医药等方面，培育优良品种是大麦育种研究的重要目标。大麦花药培养是一种单倍体育种新技术，它可以简化育种程序，加快育种的进程，加倍单倍体育种产生纯系所需的时间通常比常规育种所需的时间节省3-4个世代，而且对质量性状和数量性状的选择更可靠、有效，加倍单倍体群体还是建立遗传图谱及基因定位的极好材料。另外，大麦的花药及其诱导的愈伤组织还可以作为转基因的理想受体，用于大麦转基因研究。大麦花药培养最早于1973年获得成功，随后人们在供体植株生长条件、花药预处理方式、培养基成分和培养条件等进行了一系列的研究，明显提高了大麦花药培养的模式品种“Igri”的组培效率。但是由于大麦花药培养是农作物中难以诱导再生植株的作物之一，迄今为止大多数基因型的绿苗再生率仍小于3%。而且目前所用的大麦花药培养方法一般都经过4步培养，依次为花药的预处理、诱导愈伤培养、分化培养和生根壮苗培养，后面 3步都需要配制相应的培养基，增加了大麦花药培养的成本和工作量，而且所用的培养时间较长，一般完成整个培养过程需要15周左右。这些都限制了大麦花药培养技术的应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一套大麦花药培养的培养基及相应的操作方法， 采用该方法减少了组培所用的时间，一般8周左右即可完成整个培养过程，同时减少了组培的工作量和成本。而且采用该方法不同品种/品系的大麦基因型都可产生再生植株，绿苗再生率达到10%左右，显著提高了大麦花药培养的效率。为了解决上述技术问题，本发明提供一种大麦花药培养基，包括预处理培养基、诱导培养基以及分化/生根培养基；预处理培养基由以下含量的组分组成甘露醇(Mannitol)175 185g/L,琼脂(Agar) 14 16g/L,其余为蒸懼水；所述诱导培养基的制备方法如下每升诱导基液先调节至pH为5. 7 5. 9,然后加入14 16g的琼脂；接着进行高温灭菌处理(为常规的高温灭菌，一般为在I. I个大气压，121°C下灭菌20min)，待温度回落至50 60°C时，再加入过滤灭菌后的浓度为740 760mg/ml的谷氨酰胺(Glutamine) 溶液、浓度为90 110mg/ml的肌醇(Inositol)溶液、浓度为O. 35 O. 45mg/ml的维生素 B1 (Thiamine, VB1)溶液、浓度为 O. 9 I. lmg/ml 的卩引哚乙酸(Indole-3-acetic acid, IAA) 溶液和浓度为O. 9 I. lmg/ml的6-节基氛基嘿呤(6_benzylaminopurine, BAP)溶液各Iml ；诱导基液由以下含量的组分组成KNO31850 1950mg/L，NH4N03160 170mg/L，CaCl2 · 2H20 430 450mg/L， KH2PO4160 180mg/L, MgSO4 · 7H20 360 380mg/L, NaFeEDTA 35 45mg/L, Η3Β036· 0 6. 4mg/L, MnSO4 · 4H20 22 22. 5mg/L, ZnSO4 · 7H20 8. 5 9. Omg/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 20 0. 30mg/L, KI 0. 80 0. 90mg/L, CuSO4 · 5H20 0. 020 0. 030mg/L, CoCl2 · 6H20 0. 020
0.030mg/L,麦芽糖90 llOg/L,其余为蒸懼水；分化/生根培养基的制备方法为在每L MS基本培养基内加入蔗糖 (Sucrose) 18 22g后，先调pH至6. 4 6. 6,再加入植物凝胶(Phytagel) 3. 5 4. 5g ;最后高温灭菌(为常规的高温灭菌，一般为在11个大气压，121°C下灭菌20min)。作为本发明的大麦花药培养基的改进预处理培养基由以下含量的组分组成甘露醇182g/L,琼脂15g/L,其余为蒸懼水；诱导培养基的制备方法中谷氨酰胺溶液的浓度为750mg/ml、肌醇溶液的浓度为 100mg/ml、维生素B1 (VB1)溶液的浓度为0. 4mg/ml、吲哚乙酸(IAA)溶液的浓度为I. Omg/ ml，6-苄基氨基嘌呤(BAP)溶液的浓度为I. 0mg/ml ;琼脂的加入量为15g ；诱导基液由以下含量的组分组成KN031900mg/L, NH4N03165mg/L, CaCl2 · 2H20 440mg/L, KH2PO4170mg/L, MgSO4 · 7H20 370mg/L, NaFeEDTA 40mg/L, H3B036. 2mg/L, MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L, ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L, KI 0. 83mg/L, CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L, CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L, 麦芽糖100g/L，其余为蒸馏水；分化/生根培养基的制备方法中蔗糖的加入量为20g，植物凝胶的加入量为4g。本发明还同时提供了利用上述大麦花药培养基所进行的大麦花药快速培养法，依次包括以下步骤I)、在田间取小孢子发育处于单核中期的麦穗，在无菌操作台上灭菌、晾干后，用灭菌刀片取出叶鞘中的穗子，再用尖头镊子取出穗子里的花药，放入位于培养皿内的预处理培养基上，封上封口膜；20 25°C黑暗环境下培养3 5天；得预处理后花药；2)、将预处理后花药转移到位于培养皿内的诱导培养基上，用封口膜封好培养皿， 20 25°C黑暗环境下培养4 5周；3)、将步骤2)诱导所得的愈伤组织和苗转移至分化/生根培养基上；于22 25°C 光照培养，光照时间每天12小时，光照强度为40 60 μ mol/m2/s ;培养3 4周后，得生根绿苗。在本发明的大麦花药快速培养法,步骤I)的灭菌为常规灭菌法,例如可采用70% (v/v)的酒精灭菌；一个75xl5_的灭菌培养皿中一般放60 70个花药。在本发明的大麦花药培养基的制备过程中预处理培养基经11个大气压，121°C条件下灭菌20min的常规高温灭菌后，倒入 75x15mm的灭菌培养皿中，待凝固后用封口膜封好，常温下保存备用。诱导培养基的制备过程中，可用IM KOH调pH。所得的诱导培养基倒入75x15mm的灭菌培养皿中，待降至室温后用封口膜封好，4°C冰箱中保存备用。分化/生根培养基的制备方法中在高温灭菌后,将其倒入60xl20_的灭菌培养瓶中，待凝固后用封口膜封好，室温保存备用。在本发明的大麦花药快速培养法中步骤I)中，使用醋酸洋红染色的方法在显微镜下观察花药的生长时期，本发明认为小孢子发育处于单核中期的花药最适宜做大麦的花药培养。在田间取小孢子发育处于单核中期的麦穗，去掉叶片，在无菌操作台上，使用70% (v/v)的酒精消毒，晾干后，用灭菌刀片取出叶鞘中的穗子，再用尖头镊子取出穗子里的花药，放入预处理培养基上，每个培养皿中放60-70个花药，封上封口膜。20-25°C黑暗环境下预培养3_5天。步骤2)中，在预处理培养基上培养3-5天后，用镊子将花药转到诱导培养基上，在转的时候动作要轻，尽量不要挤压花药，每个培养皿中放30-40个花药，保证花药诱导的愈伤组织有足够的生长空间。用封口膜封好培养皿，20-25 °C黑暗环境下培养4-5周。 步骤3)中，4-5周后，将在诱导培养基上诱导出的愈伤组织和苗转至分化/生根培养基上。22 25°C光照培养(光照时间每天12小时，光照强度为40 60 μ mol/m2/s) 3-4 周后，得生根绿苗。直接将生根绿苗移栽到盆钵中，大约3-4天待苗恢复生长后，即可移入大田或继续在温室中生长直至植株成熟收获。本发明的有益效果是I)本发明与传统的大麦花药培养方法相比，操作相对简单，传统的大麦花药培养一般需要转3次不同的培养基，而本发明只需转2次培养基，同时培养基的用量大大减少， 这样不仅减少了组培的工作量，而且大大减少了组培的成本。传统的大麦花药培养一般需要15周左右完成整个组培过程，而本发明只需8周左右的时间，使用本发明明显的缩短了组培的周期，提高了组培的效率。本发明不仅适用于一些大麦花药培养的模式品种，而且适用于不同基因型的F1杂交组合，并且均能获得较高的绿苗率。本发明促进了大麦花药培养作为一种单倍体育种技术在大麦新品种选育上的应用，同时为大麦转基因研究奠定了技术基础。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图I为本发明实施例2中“Gairdner/浙啤33”Fi代花药培养情况图；图中A为“Gairdner/浙啤33”Fdf花药在诱导培养基上暗培养4周后，诱导的愈伤组织和苗，B为“Gairdner/浙啤33”Fi代花药诱导的愈伤组织和苗在分化/生根培养基上光照培养4周后的再生苗。
具体实施例方式实施例I、一种大麦花药培养基，由预处理培养基、诱导培养基、分化/生根培养基组成I)、预处理培养基甘露醇(Mannitol):182g/L,琼脂(Agar) : 15g/L,其余为蒸懼水。其制备方法如下称取甘露醇(Mannitol) 182g和琼脂(Agar) 15g,用蒸懼水定容至IL ;然后在I. I个大气压，121°C条件下灭菌20min。倒入75x15mm的灭菌培养皿中，待凝固后用封口膜封好，常温下保存备用。2)、诱导培养基其制备方法如下I)、谷氨酰胺，肌醇，VB1, IAA和BAP分别用蒸馏水配制，0.2 μ m微孔膜过滤灭菌 (I. I个大气压，121°c条件下灭菌20min)后，分别得谷氨酰胺溶液(浓度为750mg/ml)、肌醇溶液(浓度为100mg/ml)，VB1溶液(浓度为O. 4mg/ml)，IAA溶液(浓度为I. Omg/ml)和 BAP溶液(I. Omg/ml)。保存备用。II)、称取 KNO3 38g、NH4NO3 3. 3g、CaCl2 · 2H20 8. 8g、KH2PO4 3· 4g、MgSO4 · 7Η20 7. 4g，分别用蒸馏水溶解后，再混合用蒸馏水定容至1L，配成20倍的母液A保存备用。再称取 H3BO3 I. 24g、MnSO4 · 4H20 4. 46g、ZnSO4 · 7H20 I. 72g、KI 0. 166g、Na2MoO4 · 2H20 0. 05g、 CuSO4 · 5H20 0. 005g、CoCl2 ·6Η20 0. 005g，分别用蒸馏水溶解后，再混合定容至1L，配成200 倍的母液B保存备用。称取NaFeEDTA 4g，蒸馏水溶解定容至1L，配成100倍的母液C保存备用。III)、称取IOOg麦芽糖，加50ml母液A，5ml母液B和IOml母液C，用蒸馏水溶解定容至1000ml，得诱导基液；诱导基液用IM KOH调pH至5. 8，再加入15g琼脂(Agar)，进行常规的高温灭菌(11 个大气压，121°C下灭菌20min)，待灭菌后温度降至55°C左右时，再加入上述过滤灭菌后的谷氨酰胺溶液，肌醇溶液，VB1溶液，IAA溶液和BAP溶液各1ml。IV)、步骤III)所得物倒入75x15mm的灭菌培养皿中，待降至室温后用封口膜封好，4°C冰箱中保存备用。3)、分化生根培养基其制备方法如下在每L MS基本培养基内加入蔗糖20g，用IM KOH调pH至6. 5，再加入植物凝胶 (Phytagel)4g,然后进行常规的高温灭菌(11个大气压，121 °C下灭菌20min)，将其倒入 60x120mm的灭菌培养瓶中，待凝固后用封口膜封好，室温保存备用。实施例2、一套大麦花药培养的方法，使用实施例I中的相应培养基，以大麦杂交组合“Gairdner/浙啤33”Fdf (该材料在自然条件下，大田种植)为材料依次进行以下步骤I)、在大麦孕穗未开花前取花药，使用醋酸洋红染色的方法在显微镜下观察花药的生长时期，待大部分麦穗的小孢子发育处于单核中期时，根据大麦旗叶和倒二叶的距离， 在田间取处于这一时期的麦穗，在无菌操作台上，使用70% (v/v)的酒精消毒，晾干后，用灭菌刀片取出叶鞘中的穗子，再用尖头镊子取出穗子里的花药，放入预处理培养基上，每个培养皿中放60-70个花药，封上封口膜。20-25°C黑暗环境下培养3 5天。2)、将步骤I)所得的培养后花药转到诱导培养基上，每个培养皿中放30-40个花药，从而保证花药诱导的愈伤组织有足够的生长空间。用封口膜封好培养皿，20-25°C黑暗环境下培养4-5周。3)、将步骤2)诱导所得的愈伤组织和苗转移至分化/生根培养基上；22 25°C光照培养(光照时间每天12小时，光照强度大约50 μ mol/mVs) 3-4周；得生根绿苗。直接将生根的绿苗移栽到盆钵中，大约3-4天待苗恢复生长后，即可移入大田或继续在温室中生长直至植株成熟收获。在诱导培养基上大约2周后，即可出现诱导的愈伤组织和小苗(因为此时为黑暗培养，所以诱导的小苗为白色，转到光照培养条件下大多数白色小苗可转为正常绿色)，随着诱导时间的延长愈伤组织和幼苗不断增殖。如图IA所示，为“Gairdner/浙啤33” F1代花药在诱导培养基上培养4周后出愈表现。将这些愈伤组织和小苗转到分化/生根培养基上，光照培养大约I周后即可见绿苗，继续培养2-3周，让其生根壮苗形成完整植株(如图 IB所示)即可炼苗移栽。使用该方法杂交组合“Gairdner/浙啤33$代一共做了 315个花药，最后得到61 株绿苗，所得绿苗再生率高达19. 4%。实施例3、按照实施例2的方法，对杂交组合“昆仑12/花30”的F1代进行花药培养，一共培养了 500个花药，共获得77株绿苗，绿苗再生率达到15.4%。实施例4、按照实施例2的方法，对杂交组合“黄岩野大麦/浙秀12”的F1代进行花药培养，一共培养了 385个花药，共获得58株绿苗，绿苗再生率达到15. 1%。实施例5、按照实施例2的方法，对杂交组合“花30/云啤2号”的F1代进行花药培养，一共培养了 2891个花药，共获得446株绿苗，绿苗再生率达到15.4%。实施例6、按照实施例2的方法，对杂交组合“驻大麦4号/Sunyin21(日本品种)”的F1代进行花药培养，一共培养了 2423个花药，共获得301株绿苗，绿苗再生率达到 12. 4%。对比实验I、以杂交组合“Gairdner/浙啤33 ” F1代材料为例，依照文献记载 (A Jahne-Gartner^B H Lorz , 1999, Plant Cell Culture Protocols Methods in Molecular Biology 111 :269-279)的方法，取小孢子发育处于单核中、后期的花药，将穗子保存在
4-6°C，高湿度环境下2-5周，然后取出花药接种到文献所述的诱导培养基上，按照文献所述方法培养获得绿苗。使用该方法培养“Gairdner/浙啤33” F1代的花药，完成整个培养过程大概需要12周左右的时间，一共接种了 203个花药，得到绿苗36株，绿苗再生率仅为 2. 5%。对比实验2、将实施例I中的预处理培养基中的甘露醇(Mannitol)由182g/L改成 200g/L，其余完全同实施例I。在实施例2使用该预处理培养基，其余等同于实施例2。一共接种了 207个花药，获得绿苗14株，绿苗再生率为6.9%。对比实验3、将实施例I中的预处理培养基中的甘露醇(Mannitol)由182g/L改成 160g/L，其余完全同实施例I。在实施例2使用该预处理培养基，其余等同于实施例2。一共接种了 223个花药，获得10株绿苗，绿苗再生率为4. 5 %。对比实验4、将实施例I中的诱导培养基作以下更改卩引噪乙酸(Indole-3-aceticacid, IAA)由 I. 0mg/L 改成 2. 0mg/L, 6_ 节基氛基嘿呤(6-benzylaminopurine,BAP) I. 0mg/L改成2. 0mg/L,诱导培养基的其余成分含量和制作方式同实施例I。其余完全同实施例I。在实施例2使用该诱导培养基，其余等同于实施例2。一共接种了 228个花药，获得8株绿苗，绿苗再生率为3.5%。对比实验5、将实施例I中的诱导培养基作以下更改口引噪乙酸(Indole-3-acetic acid, IAA)由 I. 0mg/L 改成 0. 5mg/L, 6_ 节基氛基嘿呤(6-benzylaminopurine,BAP) I. Omg/L改成O. 5mg/L,诱导培养基的其余成分含量和制作方式同实施例I。其余完全同实施例I。在实施例2使用该诱导培养基，其余等同于实施例2。一共接种了 218个花药，获得5株绿苗，绿苗再生率为2.3%。对比实验6、将实施例I中的分化/生根培养基作以下更改将鹿糖(Sucrose) 20g改成30g,分化/生根培养基的其余成分含量和制作方式同实施例I。其余完全同实施例I。在实施例2使用该分化/生根培养基，其余等同于实施例 2。一共接种了 240个花药，获得16株绿苗，绿苗再生率为6. 7%。对比实验7、将实施例I中的分化/生根培养基作以下更改将鹿糖(Sucrose) 20g改成IOg,分化/生根培养基的其余成分含量和制作方式同实施例I。其余完全同实施例I。在实施例2使用该分化/生根培养基，其余等同于实施例
2。一共接种了 236个花药，获得8株绿苗，绿苗再生率为3.4%。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.大麦花药培养基，其特征是包括预处理培养基、诱导培养基以及分化/生根培养所述预处理培养基由以下含量的组分组成甘露醇175 185g/L，琼脂14 16g/L，其余为蒸馏水；所述诱导培养基的制备方法如下每升诱导基液先调节至pH为5. 7 5. 9，然后加入14 16g的琼脂；接着进行高温灭菌处理，待温度回落至50 60°C时，再加入过滤灭菌后的浓度为740 760mg/ml的谷氨酰胺溶液、浓度为90 110mg/ml的肌醇溶液、浓度为O. 35 O. 45mg/ml的维生素BI溶液、 浓度为O. 9 I. lmg/ml的吲哚乙酸溶液和浓度为O. 9 I. lmg/ml的6-苄基氨基嘌呤溶液各Iml ；所述诱导基液由以下含量的组分组成KN031850 1950mg/L，NH4N03160 170mg/L, CaCl2 ·2Η20 430 450mg/L, ΚΗ2Ρ04160 180mg/L, MgSO4 · 7H20 360 380mg/L，NaFeEDTA 35 45mg/L，Η3Β036· O 6. 4mg/L, MnSO4 · 4H20 22 22. 5mg/L, ZnSO4 · 7H20 8. 5 9. Omg/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 20 0. 30mg/ L, KI 0. 80 0. 90mg/L, CuSO4 · 5H20 0. 020 0. 030mg/L, CoCl2 · 6H20 0. 020 0. 030mg/ L，麦芽糖90 110g/L，其余为蒸馏水；所述分化/生根培养基的制备方法为在每L MS基本培养基内加入蔗糖18 22g后， 先调pH至6. 4 6. 6，再加入植物凝胶3. 5 4. 5g ;最后高温灭菌。
2.根据权利要求I所述的大麦花药培养基，其特征是所述预处理培养基由以下含量的组分组成甘露醇182g/L,琼脂15g/L,其余为蒸懼水；所述诱导培养基的制备方法中谷氨酰胺溶液的浓度为750mg/ml、肌醇溶液的浓度为 100mg/ml、维生素B1 (VB1)溶液的浓度为O. 4mg/ml、吲哚乙酸(IAA)溶液的浓度为I. Omg/ ml，6-苄基氨基嘌呤(BAP)溶液的浓度为I. Omg/ml ;琼脂的加入量为15g ；所述诱导基液由以下含量的组分组成KN0319 0 0mg/L, NH4N03165mg/L, CaCl2 · 2H20 440mg/L, KH2PO4170mg/L, MgSO4 · 7H20 370mg/L, NaFeEDTA 40mg/L, H3B036. 2mg/L, MnSO4 · 4H20 22. 3mg/L, ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L, KI 0. 83mg/L, CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L, CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L, 麦芽糖100g/L，其余为蒸馏水；所述分化/生根培养基的制备方法中蔗糖的加入量为20g，植物凝胶的加入量为4g。
3.利用如权利要求I或2所述的大麦花药培养基所进行的大麦花药快速培养法，其特征是依次包括以下步骤1)、在田间取小孢子发育处于单核中期的麦穗，在无菌操作台上灭菌、晾干后，用灭菌刀片取出叶鞘中的穗子，再用尖头镊子取出穗子里的花药，放入位于培养皿内的预处理培养基上，封上封口膜；20 25°C黑暗环境下培养3 5天；得预处理后花药；2)、将预处理后花药转移到位于培养皿内的诱导培养基上，用封口膜封好培养皿，20 25°C黑暗环境下培养4 5周；3)、将步骤2)诱导所得的愈伤组织和苗转移至分化/生根培养基上；于22 25°C光照培养，光照时间每天12小时，光照强度为40 60 μ mol/mVs ;培养3 4周后，得生根绿苗。
全文摘要
本发明公开了一种大麦花药培养基，包括预处理培养基、诱导培养基以及分化/生根培养基。本发明还同时提供了利用上述大麦花药培养基所进行的大麦花药快速培养法，包括以下步骤1)在田间取小孢子发育处于单核中期的麦穗，取出穗子里的花药，放入预处理培养基上黑暗环境下培养3～5天；2)将预处理后花药转移到诱导培养基上黑暗环境下培养4～5周；3)将步骤2)诱导所得的愈伤组织和苗转移至分化/生根培养基上；于22～25℃光照培养，光照时间每天12小时，光照强度为40～60μmol/m2/s；培养3～4周后，得生根绿苗。采用本发明的方法能显著提高大麦花药培养的效率。
文档编号A01H4/00GK102577946SQ201210024418
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月3日 优先权日2012年2月3日
发明者华为, 尚毅, 朱靖环, 杨建明, 林峰, 汪军妹, 贾巧君, 顾玉坤 申请人:浙江省农业科学院