专利名称：一种姬菇菌种的液体发酵培养方法
技术领域：
本发明属于食用菌培植技术领域，具体涉及一种姬菇菌种的液体发酵培养方法。
背景技术：
姬菇(Pleurotus cornucopiae)又叫黄白侧耳、紫孢侧耳、紫孢平菇、姬平菇。姬菇口感好，质地脆嫩，味道鲜美营养价值高，蛋白质含量高于一般蔬菜，含有人体所必需的八种氨基酸，其子实体入药有滋补强壮作用，可治疗多种疾病。姬菇不是分类上的名称，也不是菌种名，而是一种商品名，指采收子实体菌盖直径小于3厘米的一类平菇。姬菇一直使用固体菌种进行生产，但固体菌种具有明显的缺陷，主要表现在生长周期长、菌龄不一致、 发菌速度慢、栽培种需用量大、生产成本高等方面，显然不能满足大规模栽培使用需求。
发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种姬菇菌种的液体发酵培养方法，以满足高效培育姬菇的使用需求。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下一种姬菇菌种的液体发酵培养方法，包括以下步骤(1)取活化的0. 5cm2斜面母种接种到装有60 120mL液体培养基的250mL培养瓶中，控温21 27°C，90 180rpm振荡培养5 7d得一级摇瓶菌种，按接种量为5 10% 转接一级种子到二级培养液进行培养，再将培养好的二级摇瓶液体菌种转接到三级液体培养液进行培养，相同方法依次进行各级培养得种子液；其中，各级摇瓶培养条件相同，液体培养基配方为碳源，氮源 10 20g, KH2PO4 1 3g，MgSO4 ·7Η20 0· 5 1. Sg5VB1 10mg，水 1000mL,pH5 7 ；碳源为20 30g的可溶性淀粉、乳糖、果糖、葡萄糖、甘露醇或蔗糖；氮源为酵母膏、蛋白胨、玉米粉、氯化铵、硫酸铵或尿素；(2)将步骤(1)所得的种子液按5%的接种量接种至装有6L发酵培养基的IOL发酵罐进行发酵培养，25°C培养5 6d，即可；其中，发酵培养基配方为甘露醇30g，酵母膏 IOg,玉米粉 10g, KH2PO4 2g, MgSO4 · 7H20 0. 5g, pH 值 6· 0，水 1OOOmL0步骤(1)中，碳氮比优选为18 20 1 ；碳源优选为果糖或甘露醇，更优选为甘露醇。步骤(1)中，氮源优选为酵母膏、蛋白胨或氯化铵，更优选为酵母膏。步骤(1)中，液体培养基优选配方为30g甘露醇，IOg酵母膏，玉米粉10g，2g KH2PO4,0. 5g MgSO4 · 7H20, VB1 10mg，水 1OOOmL, pH6。步骤(1)中，优选培养条件装液量为90mL，控温25°C，150rpm振荡培养5 6d，
接种量为5%。有益效果与现有的固体培养姬菇菌种方法相比，本发明的姬菇菌种的液体发酵培养方法具有的明显优势包括生产周期短、菌龄一致、生产成本低、接种简便，液体菌种生长速度明显优于固体传统栽培种，菌种瓶中菌丝生长满瓶时间为16d，时间明显缩短，液体菌种接种的生长速度明显提高75%，完全可以在工厂生产中实际应用，具有很好的实用性， 能够产生很好的经济效益和社会效应。
图1是碳源对菌丝球生长量结果图；图2是氮源对菌丝球生长量结果图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例所使用的材料和方法为试验材料菌种为姬菇。按照有机肥料中国人民共和国农业行业标准NY525-2002测定各种原料含碳量和
含氮量。菌丝体生物量测定将生长良好、无污染的摇瓶培养发酵液，经4层纱布过滤，菌丝球生物量湿重为浙干后取固体物在电子天平上称重，菌丝球生物量干重则是直接过滤烘干称重。菌球直径测定取ImL发酵液用水稀释10倍，随机取20个菌球在培养皿中沿固定的直线排成一行，用卡尺测定总长度，重复3次，求其平均值。菌球密度测定取ImL均勻的发酵液用水稀释10倍，于培养皿下垫置黑色方格纸计数。pH值测定采用型酸度计测定pH值。还原糖测定取发酵液上清液按3，5- 二硝基水杨酸比色法测定还原糖。菌丝生长速度固体栽培种或是液体菌种相同接种量接种后，观察菌丝在菌种瓶中萌发，向下生长，直至生长至瓶底的时间，即满瓶时间。发酵罐参数测定IOL全自动气升式搅拌玻璃发酵罐装液量为6L，以摇瓶试验得出的最佳液体培养基配方配置液体发酵培养基，在发酵罐中经过空消和发酵罐自身蒸汽 121°C下灭菌30min，待罐内培养基温度下降至25°C左右，按照5%接种量接种已经活化好的液体菌种种子液，通入无菌空气开始控制培养发酵。按1 为间隔定时无菌取样，其菌丝球生物量、菌丝球密度、菌丝球直径，溶氧浓度和pH值以电极测量。实施例1取活化的斜面母种约0. 5cm2的小块接种到液体培养基中，于25°C恒温振荡培养得一级摇瓶菌种，再将培养好的一级摇瓶液体菌种转接到各处理的二级液体菌种摇瓶中，依次进行各级培养，若无特殊说明，各级摇瓶培养条件均为250mL三角瓶装液量IOOmL,接种量5% (V/V)，摇床转速150r/min，25°C振荡培养5 7d,同样，其余各级液体菌种也是相同的培养方式。姬菇液体菌种的液体培养基配方为氮源，碳源，KH2PO4 3g,MgSO4 ·7Η20 1. 5g， VB1 10mg，水lOOOmL，pH自然，121°C灭菌20min。用作姬菇斜面培养的PDA通用培养基配方马铃薯200g，蔗糖20g，水IOOOmL, pH自然，121°C灭菌20min，。(1)在液体培养基中，氮源为20g蛋白胨，碳源选择30g的可溶性淀粉(上海佳和生物科技有限公司)、乳糖、果糖、葡萄糖、甘露醇和蔗糖分别进行培养。对姬菇液体菌种菌丝球生物量进行分析，结果如图1所示，在所测碳源中，姬菇在甘露醇为碳源的培养基中生长最好，其余依次是果糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉，以甘露醇和果糖两个单糖利用率较好，因此，在生产中优选使用甘露醇和果糖。( 在液体培养基中，碳源为30g甘露醇，氮源选择20g的酵母膏、蛋白胨、玉米粉、 氯化铵、硫酸铵和尿素分别在25°C下摇瓶培养，测定姬菇液体菌丝球生物量，结果如图2所示，姬菇生长最优的氮源是酵母膏，其次是蛋白胨，氯化铵，最后是硫酸铵和尿素，酵母膏不但含有稳定的氮素含量，并且同时提供稳定的有机营养和生长因子类物质。姬菇可能偏向于利用较为复杂的有机营养物质作为自身生长合适的碳氮源，能够提供碳氮源需要的同时并提供必须的生长因子和代谢调控物质等，因此，优选以甘露醇作为姬菇液体培养基的碳源，以酵母膏为最佳氮源。(3)在液体培养基中，选用甘露醇、酵母膏分别作为碳氮源，磷酸氢二钾，硫酸镁为无机盐，PH自然，采用正交设计L9(34)进行培养实验，如表1所示，表中，A为甘露醇％ (质量百分比)，B为酵母膏％ (质量百分比)，C为KH2PO4^ (质量百分比)，D为MgS04*7H20% (质量百分比)。表1 L9 (34)因素表
权利要求
1.一种姬菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于，包括以下步骤(1)取活化的0.5cm2斜面母种接种到装有6(Tl20mL液体培养基的250mL培养瓶中，控温2广27°C，90^180rpm振荡培养5 7d得一级摇瓶菌种，按接种量为5 10%转接一级种子到二级培养液进行培养，再将培养好的二级摇瓶液体菌种转接到三级液体培养液进行培养，相同方法依次进行各级培养得种子液；其中，各级摇瓶培养条件相同，液体培养基配方为碳源，氮源 10 20g，KH2PO4 广3g，MgSO4 · 7Η200· 5 1. 5g，VB1 IOmg,水 IOOOmL, pH5 7 ；碳源为2(T30g的可溶性淀粉、乳糖、果糖、葡萄糖、甘露醇或蔗糖；氮源为酵母膏、蛋白胨、玉米粉、氯化铵、硫酸铵或尿素；(2)将步骤(1)所得的种子液按5%的接种量接种至装有6L发酵培养基的IOL发酵罐进行发酵培养，25°C培养5飞d，即可；其中，发酵培养基配方为甘露醇30g，酵母膏10g，玉米粉 10g, KH2PO4 2g, MgSO4 · 7H20 0. 5g, pH 值 6· 0，水 IOOOmL0
2.根据权利要求1所述的姬菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于步骤(1)中，碳氮比为18 20:1。
3.根据权利要求1所述的姬菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于步骤(1)中，碳源为果糖或甘露醇。
4.根据权利要求1所述的姬菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于步骤(1)中，碳源为甘露醇。
5.根据权利要求1所述的姬菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于步骤(1)中，氮源为酵母膏、蛋白胨或氯化铵。
6.根据权利要求1所述的姬菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于步骤(1)中，氮源为酵母膏。
7.根据权利要求1所述的姬菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于步骤(1)中，液体培养基配方为:30g甘露醇，IOg酵母膏，玉米粉10g，2g KH2PO4,0. 5g MgSO4 · 7H20, VB110mg,7jC IOOOmL, pH 6。
8.根据权利要求1所述的姬菇菌种的液体发酵培养方法，其特征在于步骤(1)中，培养条件装液量为90mL，控温25°C，150rpm振荡培养5 6d，接种量为5%。
全文摘要
本发明公开了一种姬菇菌种的液体发酵培养方法，包括(1)取斜面母种接种到装有60~120mL液体培养基的250mL培养瓶中，控温21~27℃，90~180rpm振荡培养5~7d得一级摇瓶菌种，按接种量为5~10%转接一级种子到二级培养液进行培养，再将培养好的二级摇瓶液体菌种转接到三级液体培养液进行培养，相同方法依次进行各级培养得种子液；(2)将种子液按5%的接种量接种至装有6L发酵培养基的10L发酵罐进行发酵培养，25℃培养5~6d，即可。该方法生产周期短、菌龄一致、生产成本低、接种简便，液体菌种生长速度明显优于固体传统栽培种，菌种瓶中菌丝生长满瓶时间为16d，时间明显缩短，液体菌种接种的生长速度明显提高75%，完全可以在工厂生产中实际应用。
文档编号A01G1/04GK102550294SQ20121002390
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月3日 优先权日2012年2月3日
发明者刘耀鸿, 刘辉, 华国栋, 孟德龙, 李冠喜, 温以斌, 王多明 申请人:连云港市农业科学院