专利名称：一种生产棉花植株的组织培养方法
技术领域：
本发明涉及一种从植物的特异性组织体外产生大量能存活的棉花植株的组织培养方法。本发明提供了一种同步化体细胞胚发生的方法，开启了通过现代农业生物技术和遗传工程的方法，获得农学上改进的均一棉花植株群体的新的可能性。该方法提供了利用组织培养技术成功改进棉花项目中的一个重要步骤。
背景技术：
棉花是一种重要的全球作物，其种植主要为获得纤维。棉籽为家畜的重要食物来源。棉花影响全世界许多国家的经济发展。因此，通过农业生物技术的现代方法改进棉花的项目引起了全世界兴趣。这增加了发展组织培养以促进遗传工程的现代技术应用于棉花植株的重要性。尽管棉花具有重要的经济价值，由于缺乏重现性好、耗时少和效率高的方法高频再生棉花的机体组织和植株，通过遗传工程的棉花改进仅以相对缓慢的速度进行。
已很好地建立了通过组织培养技术再生植物。虽然植物细胞的全能性是众所周知的现象，但各种植物或植物各部分需要专业研究，以创造这种高效高频再生的条件。似乎多数人认为，成功诱导分化依赖于外植体的类型、外植体的生理条件和外植体在培养过程中的理化环境。因此，组织培养科学涉及优化来源植物的生理条件、外植体的类型、培养条件及植物生长调节剂或用于起始组织反应的其它培养基附加物。
在体外器官发生中或通过体细胞胚发生，已成功再生了各种各样的植物品种。选择的再生模式常基于植物品种遗传转化方法的相对情况、效率和适用性。不以分生组织为基础的方法，即体细胞胚发生的方法通常是一种优选的模式，因为其排除了假阳性或嵌合转化体的可能性。
通过体细胞胚发生从外植体再生包括几个生长时期。最常见的是，在无菌条件下给予来自成熟植物部分或器官或萌发籽苗的外植体以化学成分明确的营养培养基。培养时，在人工控制的光线、温度和光周期条件下，切除的植物部分将产生分化的细胞团块，称为愈伤组织。
在一系列合适的理化环境下，即营养物、光线、温度、光周期以及通过加入合适组合的和合适浓度的植物生长调节剂，或通过突然去除这些因素，作为这种条件下培养的结果，据报道一些植物品种的愈伤组织产生了胚形成愈伤组织，这些愈伤组织反过来又通过体细胞胚发生的过程形成体细胞胚。
体细胞胚是体细胞发育出来的胚芽。每个体细胞胚都是能发育成完整植株的有序组织团块。体细胞胚与种子发育的合子胚非常相似，除了它们的发育不包括减数细胞分裂(减数分裂)，并且尺寸常常更大。
一种或多种培养基成分浓度的变化可导致植物组织体外发育和分化的变化。有报道磷酸肌醇介导的信号途径会影响植物的发育和胚发生。在特定时期使组织肌醇饥饿一定时间可使组织发育同步化，而不降低其生存能力。然而，在完成植物或体外胚发育的同步化过程中以前未有使用肌醇的报道，其是本发明的最重要方面。
迄今，已有几篇关于棉花体细胞胚发生技术的报道已出版或授予了专利权。经过特定处理的外植体种体细胞胚发生频率通常较低。此外，从每个外植体获得的胚数不高。体外胚发生所需时间周期长和方法的基因型依赖性进一步增加了棉花体细胞胚发生的难度。
如果能开发一种用于棉花模式品种的方法以提供一套能改善体细胞胚发生频率的配方设计和条件，并且如果该方法需要较少的时间将是有利的。同步化发育利于收获更多数量的再生植株。同步化发育不仅生产大量的植株，而且同一生长期的所有植物群体均一。简化步骤和配方设计能进一步增强该方法的适用性。使用液体培养基进一步利于遗传转化(转基因植物发育)过程中的高效选择，因为在液体培养中的选择压力(例如，对抗生素的抗性)能更均匀地穿透细胞。所有这些方面在本发明中已实现。棉花胚的同步化发育以前未曾提及并且是本发明的一个重要方面。
现有技术的描述有几篇公布的报道研究了导致棉花胚发生和植物再生的组织培养条件。
Davidonis和Hamilton在Plant Sci.Letter(1983)3289-93和美国专利No.4,672,035(1987)中报道了2岁G.hirsutum愈伤组织中的体细胞胚发生。Shoemaker等人，1986年表征了17个棉花栽培品种中的体细胞胚发生和植株再生(Plant Cell Rep.3178-181)。Trolinder和Goodin(1987)及Finer(1988)报道了棉花悬浮培养中的体细胞胚发生(Plant Cell Rep 6231-234；Plant Cell Rep.7399-402)。这些方法花了几个月时间发育再生的植物。这些方法高度依赖于基因型(Trolinder和Xhixian，1989 Plant CellRep.8133-136)，因此，仅可应用于少数棉花栽培品种。由于培养时间长，这些方法发育的植物常报道为不育或具有细胞遗传学异常(Trolinder andGoodin，1987 Plant Cell Rep.6231-234)。Rangan(1993)在美国专利no.5,244,802和Rangan and Rajasekaran(1997)在美国专利No.5,695,999中报道了几种棉花变种中来自籽苗的外植体的胚发生。Gawel和Robacker(1990)在Plant Cell Tiss.Organ Cult.23201-204中比较了半固体和液体增殖培养基上棉花的体细胞胚发生。Kumar等人，1998年报道了利用改进的Trolinder和Goodin方法在Coker 310与印度棉花变种的F1杂种中的体细胞胚发生。Zhang等人，2000年在Plant Cell Tiss.Organ Cult.6089-94中描述了源于异常体细胞胚衍生的外植体的体细胞胚发生。
已将其中的几种方法或其改进用于Agrobacterium介导的棉花转化(Umbeck et al.，1987 Bio/Technology 5263-266；Firoozabady et al.，1987Plant Mol.Biol.10105-116)或粒子轰击介导的棉花转化(Finer andMcMullen，1990 Plant Cell Rep.8586-589)。已将某些细菌基因，如那些编码除草剂抗性的基因(Bayley et al.，1992 Theo.Appl.Genet.83645-649)以及苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)内毒素基因(Perlak et al.，1990Bio/Technology 8939-943)在转基因植物中成功表达。Strickland(1998)在美国专利No.5,846,797中报道了转化的外植体在不含生长调节剂的培养基上再生。一旦有可用的高效再生方法，特别是体细胞胚发生，就可将其便利地用于棉花的转化或遗传工程。
将以前的各种技术之间的比较提供如下表1表1 诱导体细胞胚发生的现有棉花再生技术的综述
表1中的报道4声称开发植物为不育的，而本申请描述的方法给出了可育的健康植物。相对于从田间生长的植株收集的籽苗外植体随机选择库，本方法给出了高频率的体细胞胚发生。这是在早期报道基础上的重要进步，其中外植体取自已经筛选而用于体细胞胚发生的样品(表1的报道11和12)。此外，至今未有公开报道描述棉花体细胞胚发生的同步化。此外，没有报道描述任何其它植物将肌醇饥饿法用作工具以在体细胞胚发育中诱导同步化。对于棉花来说，体细胞胚同步化发育在现有技术中是不可能的，而其是本发明的一个非常重要的成就。
本发明的成功依赖于用于在外植体诱导愈伤组织的植物生长调节剂的浓度和组合，以及使用本发明的包括短期肌醇饥饿阶段的方法培养愈伤组织的方式。一旦诱导出愈伤组织，该方法任何后续步骤中就不需要任何外源的植物生长调节剂或其它培养基添加剂(例如，报道4和6中额外的KNO3以及报道11和12中的活性炭)。体细胞胚在简化液体萌发培养基中发芽和生根，该培养基位于以非胶凝剂为基础的便宜且简单的载体(例如，蛭石)上。在这方面，本发明描述了适于商品化的简单且更便宜的方法。
本发明首次描述了肌醇影响体外生长的植物细胞的发育和分化。该方法详细描述了为了使体细胞胚同步化发育而在特定时间和时间段使用不含肌醇的培养基。当选择的胚发生细胞团块经受8-12天肌醇饥饿后，将培养物放回含有肌醇的基础培养基，此时发现几乎所有胚处于球形期。进一步生长10天后，绝大部分胚(92％)处于心形期。在随后的传代培养中约82％的胚处于鱼雷期。当胚发生团块经受8-12天2个周期的肌醇饥饿，在球形期后未观察到所述的发育同步化。此外，短期的肌醇饥饿不仅使胚发育同步化，而且最终回收的胚数令人惊讶地增加至4-5倍的高值。
关于棉花的本领域早期专利为美国专利No.4,672,035；美国专利No5,244,802；美国专利No.5,695,999；EP 344302和美国专利No.5,846,797，其中发明者公开了通过体细胞胚发生从棉花愈伤组织再生植株的方法；美国专利No.5,846,797；美国专利No.5,004,863；美国专利No.5,159,135及EP 344302，其中发明者公开了一种转化棉花的方法，包括基于体细胞胚发生的再生方法，以及WO A1 9215675，其中发明者公开了一种轰击介导的棉花胚轴转化方法，由此处发育转基因植物。
本发明中描述的方法非常简单，适于商品化；并且快速、具有重现性以及便于在植物遗传工程中应用。与本领域其它现有技术不同，本方法不会导致形态学和细胞遗传学异常的植物形成，不同于Stelly等人，1989，并且不会在转化试验中产生假阳性转化体，不同于Sunilkumar andRathore，2001。
发明目的本发明的一个重要目的是提供一种方法，其用于在发育学上同步化棉花体细胞胚发生，并支持从特定植物组织再生大量植株。
本发明的另一个目的是提供一种通过体细胞胚发生再生棉花的改进方法，在该方法中再生的植物生长、成熟并形成可育的植物。
本发明的另一个目的是提供一种简单且具有重现性的体细胞胚发生方法，至少涉及外部补充的植物生长调节剂和任何其它额外培养基添加剂。
发明概述本发明首次提供了一种通过发育学上同步化体细胞胚发生再生棉花植株的高效方法。本发明的方法简单、快速、具有重现性并且便于在植物遗传工程中应用。新颖性的最重要方面是通过肌醇饥饿的步骤实现了同步化体细胞胚发生。该重要方面在申请者已知的任何现有技术中未被提及或甚至未被暗示。
本发明的方法使用了不同于早期报道中所用的生长调节剂组合(2，4二氯苯氧基乙酸和苯甲基腺嘌呤)从籽苗外植体诱导愈伤组织。本发明的方法实现了愈伤组织介导的体细胞胚发生，其花费的时间更短，且产生更多数量的正常可育植物。
因此，根据本发明，提供了一种通过从下胚轴段或中胚轴段或子叶片同步化体细胞胚发生而再生大量能存活和可育棉花植株的方法，所述的方法包括-
(i)以消毒剂处理棉花种子，以去除任何有害的污染物。
(ii)将来自步骤(i)的处理过的种子培养于第一培养基中，以便发芽，该培养基由下述物质组成(a)任何传统培养基使用的盐，(b)任何传统培养基使用的维生素，(c)肌醇，以及(d)碳源pH范围为5.2-6.0，用高压锅灭菌培养基，将培养物于23-33℃温度光照(以30-60μmol/m2/s的强度)或黑暗中培育6-12天。
(iii)培养来自步骤(ii)中获得的籽苗的外植体。
(iv)在第二固体培养基中培养从步骤(iii)获得的外植体以诱导愈伤组织，该固体培养基由下述物质组成(a)任何传统培养基使用的盐，(b)任何传统培养基使用的维生素，(c)肌醇，(d)碳源，(e)2，4D和BA组合的植物生长调节剂，以及(f)胶凝剂在pH范围为5.4-6.2，用高压锅灭菌该培养基，将培养物培育于23-33℃、至少90μmol/m2/s强度的光照、16h光周期条件下；(v)继续培养3-5周时间直到从伤口边缘形成愈伤组织。
(Vi)将来自步骤2产生的愈伤组织以600-1000mg愈伤组织/50ml培养基的填充密度转移至第三液体培养基中，所述的培养基包括(a)任何传统培养基使用的盐，(b)任何传统培养基使用的维生素，(c)肌醇，以及(d)碳源pH范围为5.2-6.0，用高压锅灭菌培养基，将培养物于23-33℃、20-40μmol/m2/s强度的光照、16h光周期下培育12-32天，足以形成胚发生团块。
(vii)通过不同网孔大小的金属筛筛滤细胞悬浮液，选择筛目尺寸40上收集的细胞/团块，然后进一步将选择的团块传代培养于如步骤(vi)中的液体基础培养基中。
(viii)将胚发生的细胞/团块短时间(8-12天)传代培养于步骤(vi)的但不含有肌醇的液体基础培养基中，即第四培养基中。
(ix)进一步将胚发生的细胞/团块以8-12天的规则间隔传代培养于步骤(vi)的液体基础培养基中。
(x)将步骤(viii)和(ix)中的培养物以与步骤(vi)中的温度、光照、光周期相同的条件培育。
(xi)在旋转摇床上以110-130rpm摇动步骤(vi)、(viii)和(ix)的培养物。
(xii)将双极的成熟体细胞胚转移至第五胚萌发培养基上，该培养基包括(a)任何传统培养基使用的盐，(b)任何传统培养基使用的维生素，(c)减少至四分之一正常浓度的肌醇，以及(d)碳源pH范围为5.2-6.0，用高压锅灭菌培养基，将培养物培育于23-33℃、至少60μmol/m2/s强度的光照、16h光周期的条件，直到长出幼苗。
本发明中，术语外植体指子叶片或下胚轴或中胚轴段。
在本发明的优选实施方案中，所述的第一至第五培养基包括MS培养基的盐、Gamborg B5培养基的维生素以及碳源。
第一和第五培养基包括MS培养基的盐和Gamborg B5培养基的维生素的标准浓度的一半，而第二、三、四培养基包括这些成分标准浓度。MS培养基的最优选的盐及其标准浓度包括下述的表2中显示的成分表2Murashige和Skoog(1962)培养基的盐-成分浓度(mg/L)NH4NO31650KNO31900CaCl2.2H2O 440
MgSO4.7H2O370KH2PO4170KI 0.83H3BO36.2MnSO4.4H2O22.3ZnSO4.7H2O8.6Na2MoO4.2H2O 0.25CuSO4.5H2O0.025CoCl2.6H2O0.025Na2.EDTA 37.3FeSO4.7H2O27.8Gamborg B5培养基的优选维生素包括表3中所示的下述成分表3成分 浓度(mg/L)烟酸 1.0盐酸吡哆醇1.0盐酸硫胺 10第一培养基中的优选碳源选自蔗糖和葡萄糖，这种碳源使用浓度范围为1-3％wt./vol.。
第二、三、四培养基中的优选碳源基本为葡萄糖，这种碳源使用浓度范围为1.5-45.％wt./vol.。
第五培养基中的优选碳源基本为蔗糖，这种碳源使用浓度范围为1-3％wt./vol.。第二培养基中的优选胶凝剂选自琼脂(使用浓度范围为0.6-0.8％wt./vol.)和phytagel(使用浓度范围为0.15-0.29％wt./vol.)。第一、二、三和五培养基中的优选有机物基本为肌醇，在第一至三培养基中以100mg/L使用，在第五中以25mg/L使用。
在第二培养基中使用的植物生长调节剂选自作为植物生长素的2，4D和作为细胞分裂素的BA。
在另一优选实施方案中，本发明的方法包括(i)通过常规方法灭菌棉花植物种子，以去除污染物，如细菌/真菌；(ii)将灭菌的种子培养于表4中所示的培养基中，以便发芽；(iii)从步骤(ii)中获得的籽苗切下外植体；(iv)将步骤(iii)中获得的外植体培养于表5中所示的培养基中，pH范围为5.4-6.2，用高压锅灭菌培养基；(v)将外植体于23-33℃的温度、至少90μmol/m2/s强度的光照中以16h光周期培养3-5周时间，直到形成足够的愈伤组织；(vi)将愈伤组织转移至表6中所示的具有下述组合物的胚发生诱导培养基中，pH范围为5.2-6.0，用高压锅灭菌培养基；(vii)在23-33℃、20-40μmol/m2/s强度的光照、16h光周期下培养2-5周时间直到形成胚发生的团块；(viii)筛选胚发生的团块并转移至不含肌醇的具有表7中所示的组合物的培养基中，pH范围为5.2-6.0，用高压锅灭菌培养基，并于23-33℃的温度在20-40μmol/m2/s强度的光照中以16h光周期短时间培养8-12天；(ix)将渗透压休克的培养物转移至步骤(vi)的液体基础培养基中，继续在此培养基上培养，体细胞胚在此同步化；(x)将成熟的双极体细胞胚转移至表8中所示的胚萌发培养基中，pH范围为5.2-6.0，用高压锅灭菌培养基；(xi)包含于23-33℃、至少60μmol/m2/s强度的光照、16h光周期下培养，直到幼苗足以发育，使取出后能适应环境；(xii)使再生的植株适应盆栽混合物环境，该盆栽混合物包括2∶1∶1∶1的比例的栽培土壤∶沙子∶蛭石∶pectmoss；表4种子萌发培养基-a.较多的盐成分 浓度(mg/L)NH4NO3825KNO3950
CaCl2.2H2O220MgSO4.7H2O185KH2PO485b.较少的盐成分浓度(mg/L)KI 0.425H3BO33.6MnSO4.4H2O11.15ZnSO4.7H2O4.3Na2MoO4.2H2O 0.125CuSO4.5H2O0.0125CoCl2.6H2O0.0125Na2.EDTA 18.65FeSO4.7H2O13.9c.有机物肌醇 100d.维生素成分 浓度(mg/L)烟酸 0.5盐酸吡哆醇0.5盐酸硫胺 5e.碳源蔗糖或葡萄糖 20g/lpH范围为5.2-6.0，用高压锅灭菌培养基表5愈伤组织诱导培养基a.较多的盐成分 浓度(mg/L)NH4NO31650
KNO31900CaCl2.2H2O 440MgSO4.7H2O 370KH2PO4170b较少的盐成分浓度(mg/L)KI 0.83H3BO36.2MnSO4.4H2O 22.3ZnSO4.7H2O 8.6Na2MoO4.2H2O 0.25CuSO4.5H2O 0.025CoCl2.6H2O 0.025Na2.EDTA 37.3FeSO4.7H2O 27.8c.有机物肌醇100d.维生素成分浓度(mg/L)烟酸1.0盐酸吡哆醇 1.0盐酸硫胺10e.碳源葡萄糖 30g/lf.胶凝剂琼脂8g/l或Phytagel 2.2g/lg.植物生长调节剂植物生长素0.44至4.4μM细胞分裂素0.22μM至2.2μM
表6胚发生诱导培养基a.较多的盐成分 浓度(mg/L)NH4NO31650KNO31900CaCl2.2H2O440MgSO4.7H2O370KH2PO4170b.较少的盐成分 浓度(mg/L)KI 0.83H3BO36.2MnSO4.4H2O22.3ZnSO4.7H2O8.6Na2MoO4.2H2O 0.25CuSO4.5H2O0.025CoCl2.6H2O0.025Na2.EDTA 37.3FeSO4.7H2O27.8c.有机物肌醇 100d.维生素成分 浓度(mg/L)烟酸 1.0盐酸吡哆醇1.0盐酸硫胺 10e.碳源葡萄糖30g/l
表7缺乏肌醇的培养基a.较多的盐成分浓度(mg/L)NH4NO31650KNO31900CaCl2.2H2O 440MgSO4.7H2O 370KH2PO4170b.较少的盐成分浓度(mg/L)KI 0.83H3BO36.2MnSO4.4H2O 22.3ZnSO4.7H2O 8.6Na2MoO4.2H2O 0.25CuSO4.5H2O 0.025CoCl2.6H2O 0.025Na2.EDTA 37.3FeSO4.7H2O 27.8c.维生素成分浓度(mg/L)烟酸1.0盐酸吡多辛 1.0盐酸硫胺10d.碳源葡萄糖 30g/l表8胚萌发培养基
a.较多的盐成分浓度(mg/L)NH4NO3825KNO3950CaCl2.2H2O 220MgSO4.7H2O 185KH2PO485b.较少的盐成分浓度(mg/L)KI 0.425H3BO33.6MnSO4.4H2O 11.15ZnSO4.7H2O 0.43Na2MoO4.2H2O 0.125CuSO4.5H2O 0.0125CoCl2.6H2O 0.0125Na2.EDTA 18.65FeSO4.7H2O 13.9c.有机物肌醇25d.维生素成分浓度(mg/L)烟酸0.5盐酸吡哆醇 0.5盐酸硫胺5e.碳源蔗糖20g/l根据本发明的实施方案，基础的胚发生团块能经受进一步的多轮肌醇饥饿和随后的同步化胚发生及植株再生。
发明详述在本发明的方法中，体外培养前将种子表面灭菌以使其不带有细菌/真菌污染物。表面灭菌包括以包含任何一种消毒剂，如次氯酸钠、次氯酸钙、氯化汞、乙醇、溴化十六烷基三甲铵等的溶液处理种子。种子的表面灭菌可通过下述方法完成，即连续搅拌下以0.05-0.5％w/v氯化汞水溶液处理种子3-11分钟，然后以灭菌蒸馏水充分洗涤(4-8次)，再将种子浸入精馏酒精(50-100％v/v)中10-20sec，然后在酒精灯火焰中灼烧5-10sec。
表面灭菌的种子可置于滤纸船上发芽，滤纸船以种子萌发培养基浸润，该培养基包含浓度稀释至一半的Murashige和Skoog盐、浓度稀释至一半的Gamborg B5培养基、100mg/L肌醇以及任何碳源，如葡萄糖或蔗糖1-3％wt./vol.，再将培养基的pH至5.2-6.0，并用高压锅于121℃，16psi灭菌16min而使其无菌。
为了发芽，可将种子于23-33℃下光照(以30-60μmol/m2/s的强度)或黑暗中培育，直到种子发芽并形成成熟的籽苗。
优选地，于无菌环境，即本领域已知的层流中，以锋利的消毒解剖刀和刀片切下发芽后6-12d大的籽苗而获得外植体(子叶片、下胚轴段或中胚轴段)。
将切下的外植体置于培养基中，该培养基包含表2所示浓度的Murashige和Skoog盐、表3所示浓度的Gamborg B5维生素、100mg/L肌醇、优选为1.5-4.5％wt./vol.葡萄糖的碳源、优选为0.6-0.8％wt./vol。琼脂或0.15-0.29％wt./vol.phytagel的凝胶剂以及植物生长调节剂0.44-4.44μM的2，4D和0.22-2.22μM的BA。将培养基pH调节至5.4-6.2，然后于121℃、16psi灭菌16min。将用于诱导愈伤组织的培养基成分列于表5中。将培养物于23-33℃、至少90μmol/m2/s的白色荧光中以16h光周期培育3-5周时间。此时，从外植体切割边缘形成足够的愈伤组织。愈伤组织外表可为浅黄色至褐色，脆性质地。
可将从外植体的切割边缘长出的愈伤组织以600-1000mg愈伤组织/50ml培养基的填充密度转移至250ml瓶的液体基础培养基中，该培养基成分如表6所示。培养基不包括任何生长调节剂或胶凝剂，将其pH调节至5.2-6.0，然后于121℃、16psi灭菌16min。可将愈伤组织的细胞于该培养基中在旋转摇床上以110-130转/分钟摇动，摇床设置为23-33℃、20-40μmol/m2/s光强度、16hrs光周期。可将细胞于该培养基和该培育条件中培养12-32天时间，直到在细胞悬浮培养中形成胚发生的团块。
可筛选摇动的液体基础培养基中发育的细胞悬浮液以选择培养物中的胚发生细胞团快/群体。可穿过10、40和100筛目尺寸的金属筛的组合进行选择。筛目尺寸10的金属筛收集较大的组织块，100目的金属筛收集小的细胞悬浮物。在筛目尺寸40的金属筛上收集可转变为胚发生的含有较小团块的细胞部分。将选择的细胞部分转移至新鲜的液体基础培养基中，间隔8-12天规则地传代培养，或可将其转移至缺乏肌醇的培养基中8-12天时间，该培养基为液体基础培养基减去肌醇，成分列于表7中，然后将肌醇放回新鲜液体基础培养基，再以8-12天的间隔规则地传代培养。在这两种情况中，体细胞胚都能发育但具有不同的发育命运。在前者中，在每个8-12天的周期中可以获得相似频率的各个发育期的胚，在后者中，胚发育得以同步化，几乎所有的胚都保持在同一发育时期。本发明策略是选择第二种方法培养胚发生的团块。
此外，将成熟的双极鱼雷期胚取出悬浮液用于发芽后，基部的胚发生团块用于进一步的的循环，即肌醇缺失、发育同步化以及随后收获成熟胚用于发芽。
可将胚发生的团块和同步化的胚培养于110-130次摆动/分钟的旋转摇床上的摇动培养基中，温度为23-33℃，光的强度为20-40μmol/m2/s，光周期为16hrs.。
可将成熟的双极体细胞胚取出液体培养基，转移至固体支持物上，该支持物优选以胚萌发培养基饱和的蛭石，该培养基成分列于表8中。将培养基pH调节至5.2-6.0，然后于121℃、16psi灭菌16min。可将培养物于23-33℃、至少为60μmol/m2/s的光照中以16h的光周期培育。可向发芽胚中加入新鲜的液体培养基，每周一次。将胚生长于胚萌发培养基中一定时间，使其足以形成具有发育良好的根的4-5叶期(leaf stage)幼苗。此时，可取出幼苗转移至以2∶1∶1∶1比例的栽培土壤∶沙子∶蛭石∶泥煤苔的盆栽混合物中。使用透明聚乙烯袋覆盖植物，内表面洒水，给予新发育的幼苗良好的湿润条件。在这些条件以及23-33℃的温度、强度至少为90μmol/m2/s的荧光和16h的光周期下将幼苗培养一段时间，使其足以适应环境后，如果需要，可将植物转移至田间。
现在将参考下述非限制性的实施例对本发明进行更具体的描述。
实施例1外植体诱导体细胞胚发生的培养基依赖性效应将棉籽(Ghirsutum L.Coker 312)以0.1％w/v氯化汞处理7分钟，以灭菌蒸馏水洗涤6次，然后将种子浸入精馏酒精中10秒，再以火焰熏烧。灭菌的种子置于滤纸船上发芽，该滤纸船以种子萌发培养基浸润，该培养基包含浓度稀释至一半的Murashige和Skoog盐、浓度稀释至一半的Gamborg B5维生素、100mg/L肌醇以及2％w/v蔗糖(高压锅灭菌前调节培养基的pH至5.6)。为了发芽，将种子于28±2℃、白色荧光(30μmol/m2/s)下以16h的光周期培育。继续培养，直到种子发芽产生胚根和胚芽，具有伸展良好的子叶。
将9天大的籽苗用于提供作为外植体的下胚轴段和子叶片。用锋利、消毒的解剖刀切下外植体。将外植体置于愈伤组织诱导培养基CIM1上，该培养基包含Murashige和Skoog盐、Gamborg B5维生素、100mg/l肌醇、3％w/v葡萄糖、750mg/l MgCl2和0.22％w/v phytagel，补充了2.2μM2，4-D和0.88μM BA(高压锅灭菌调节培养基的pH至5.8)。
将外植体于该培养基上28±2℃、90μmol/m2/s强度的光照中以16h的光周期培育3-4周。将从外植体的切割边缘长出的愈伤组织切下，以800mg愈伤组织/50ml培养基的填充密度接种于250ml Ehrlenmeyer瓶的液体基础培养基中，该培养基包含Murashige和Skoog盐、Gamborg B5维生素、100mg/l肌醇、3％w/v葡萄糖，pH5.6。将培养基以高压锅于121℃、16psi灭菌16min。将培养物于旋转摇床上以120rpm摇动，温度为28±2℃、光的强度为30μmol/m2/s、光周期为16h。
用于诱导愈伤组织的外植体还可在培养基CIM2、CIM3和CIM4上培养，这些培养基包含Murashige和Skoog盐、Gamborg B5维生素、100mg/l肌醇、3％w/v葡萄糖、750mg/l MgCl2和0.22％w/v phytagel，补充了不同的生长调节剂组合，如0.45μM 2，4-D加上2.32μM Kin.(CIM2中)；10.7μM NAA加上4.64μM Kin.(CIM3中)；2.68μM NAA加上2.4μM 2iP(CIM4中)。将培养物培育于相同的温度和光照条件中。将愈伤组织转移至液体基础培养基中并以类似的方式培养。
培养物在液体培养基中生长20-22天后，产生的悬浮物过不同筛孔尺寸(10、40和100目，SIGMA化学公司，St.Louis)的金属筛进行筛选。弃去筛目尺寸10上收集的较大团块和筛目尺寸100上收集的小悬浮物。将筛目尺寸40上收集的较小细胞/团块传代培养于新鲜的液体基础培养基中并记录体细胞胚的存在。在胚发生团块存在的基础上，计算诱导体细胞胚发生(SE)的频率，并相应地记录各种培养基组合中的每个外植体获得的体细胞胚数。获得的结果总结于表9中。
表9在选择的培养基组合物下不同外植体类型的胚发生效应
*显示胚发生的愈伤组织诱导的外植体百分比体细胞胚发生(SE)诱导和成熟胚形成的临界差，对于子叶外植体分别为17.69和3.43(n＝5，重复2次)，对于下胚轴外植体分别为13.14和2.16(n＝6，重复3次)。
从结果看来，很明显，生长调节剂组合和浓度方面的变化导致体细胞胚发生诱导频率和每个外植体获得的成熟体细胞胚数方面的不同效应。因此，可将该发现用于开发棉花植物再生的最佳条件。
实施例2重复实施例1的方法，除了将种子于黑暗中发芽和生长9天，直到黑暗中发育出胚根和胚芽，并具有伸展良好的子叶。基本上获得了相同的结果。
实施例3重复实施例1的方法，除了种子萌发培养基包含2％w/v葡萄糖作为碳源。获得了相同的结果。
实施例4重复实施例2的方法，除了种子萌发培养基包含2％葡萄糖以取代蔗糖。获得了相似的结果。
实施例5以棉花变种Coker 310重复实施例1和2的方法。获得了相似的结果。
实施例6在一定程度上重复实施例1的方法，直到在悬浮物中获得胚发生团块，该悬浮物来源于在2，4-D和BA的组合上产生的愈伤组织。将胚发生团块传代培养于缺乏肌醇的液体基础培养基(BM)中。将传代培养于包含肌醇的液体基础培养基中的胚发生团块作为对照。将团块以约800mg细胞/50ml培养基的填充密度接种，并在旋转摇床上以实施例1中的光照、温度和光周期条件培育。在缺乏肌醇的培养基中进行1-2次的10天传代培养后，将培养物返回到包含肌醇的基础液体培养基中。记录两种条件下每单位重量中不同发育时期胚的频率和数量。将获得的数据显示于表10中。
表10使用肌醇饥饿法的体细胞胚发生的同步化
从结果可明显看出，在无肌醇缺乏时，获得了不同步的胚发生。因此，胚发生团块在包含肌醇的基础培养基中的连续传代培养产生了几乎相似频率的处于各个发育时期的胚。然而，当将胚发生团块传代培养于不含肌醇的基础培养基中一个10天的单循环，然后返回到包含肌醇的基础培养基时，产生了体细胞胚的同步化发育(在基础培养基上的一次传代培养后，处于球形期的胚占100％；在基础培养基上的2次传代培养后，处于心形期的胚占91.66％；以及在3次传代培养后，处于鱼雷期的胚占81.99％)。每个外植体产生的成熟胚的总数增高4-5倍。当传代培养于不含肌醇的培养基中2个循环时，胚发生团块在胚发育时期的均一性出现减小。因此，需要单循环的肌醇饥饿诱导高水平的胚发生同步化。
实施例7
如实施例1，将棉籽(G.hirsutum L.Coker)灭菌和发芽。将外植体浸入Agrobacterium(土壤杆菌属)悬浮液中10-15分钟，擦干，然后接种于共培养培养基中，该培养基包括Murashige和Skoog盐、Gamborg B5维生素、100mg/l肌醇、3％w/v葡萄糖、750mg/l MgCl2和0.22％w/v phytagel，补充了2.2μM 2，4-D和0.88μM BA(高压锅灭菌将培养基的pH调节至5.8)。将培养物于28±2℃、90μmol/m2/s的光照中以16h的光周期培育3天。3天后，将外植体以无菌水洗涤，再次擦干，然后接种于培养基中，该培养基具有类似于共培养培养基的成分，除了补充了250mg/l沃格孟汀(augmentin)和50mg/l卡那霉素。按照实施例1和实施例6进一步培养外植体。在体细胞胚发生和转化植物的再生方面获得了相似的结果。
用于本试验的Agrobacterium株是一种普通的试验株LBA 4404，荷载二元载体pIG衍生物，其具有作为选择标记物的nptII和作为报告基因的具有内含子的gusA。
从转化的外植体获得的再生来看，很明显，当所有回收胚为GUS+ve并在组化试验后显示均一蓝色时，在选择试剂(在此试验中为卡那霉素)存在下培养液体培养基中的推定转化细胞更不易产生假阳性选择体(selectant)。此外，以转化的外植体获得体细胞胚发生诱导频率和每个外植体的成熟体细胞胚数，用与不用Agrobacterium tumefaciens(根瘤土壤杆菌)处理的结果相似。
实施例8重复实施例7的方法，除了将外植体在黑暗中共培养。基本上获得了相似的结果。
权利要求
1.一种通过体细胞胚发生、采用短期肌醇饥饿后基本同步化胚发育而再生棉花的方法，所述的方法包括下述步骤(i)从萌发的棉花籽苗上切下外植体，该外植体选自子叶、下胚轴、中胚轴及其混合物；(ii)为了诱导愈伤组织，将所述外植体培养于第一固体培养基中，包含作为碳源的葡萄糖，补充了Gamborg B5维生素、2，4-D和BA以及肌醇的培养用培养基中，温度为23-33℃，光强度为至少90μmol/m2/s，光周期为16h，时间为3-5周，以使从所述外植体形成去分化的愈伤组织；(iii)将愈伤组织从第一固体愈伤组织诱导培养基转移至包括基础培养基的液体培养基中，该基础培养基包含作为碳源的葡萄糖，并补充了Gamborg B5维生素，然后将其产生的悬浮物在23-33℃、20-40μmol/m2/s降低的光强度、光周期为16h条件下培养足以形成胚发生团块的一段时间；(iv)通过不同筛孔尺寸的金属筛筛选所述细胞悬浮物，以选择胚发生细胞和/或团块，并将包含体细胞胚的所述胚发生愈伤组织传代培养于所述的基础培养基中；(v)将所述胚发生块/团块传代培养于所述的缺乏肌醇的基础培养基中一段足够的时间以让其经受肌醇缺乏，然后将该培养物返回到包含肌醇的培养基中，以使所述体细胞胚在发育上同步化；(vi)将双极的体细胞胚转移至支持物上的胚萌发培养基，然后让所述胚于胚萌发培养基中生长发育至足够能转移至土壤的幼苗期；(vii)进一步将所述幼苗转移至盆栽混合物中以适应环境，然后再转移至田间。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的外植体来源于棉花或任何其它植物籽苗。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述的外植体来源于棉花栽培品种Coker 312，并且所述的籽苗以下述方法发育(i)将棉花种子于0.1％HgCl2的灭菌液中灭菌5-10min，优选7min，(ii)以灭菌水洗涤种子4-6次，(iii)将所述种子于酒精灯火焰中熏烧5-10秒，(iv)将所述种子接种于种子萌发培养基上，(v)让所述种子于种子培养基中在光照或黑暗中于23-33℃生长6-12天时间，优选9-10天，(vi)从所述籽苗切下所述外植体。
4.如权利要求3所述的方法，其中种子萌发培养基为液体培养基，包括一半浓度的Murashige和Skoog盐和Gamborg B5维生素。
5.如权利要求3所述的方法，其中种子萌发培养基中的碳源选自1-3％wt./vol.范围内的蔗糖和葡萄糖。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述的第一固体愈伤组织诱导培养基包括Murashige和Skoog培养基的下列成分成分 浓度(mg/L)a.Murashige和Skoog(1962)培养基的盐NH4NO31650KNO31900CaCl2.2H2O 440MgSO4.7H2O 370KH2PO4170KI 0.83H3BO36.2MnSO4.4H2O 22.3ZnSO4.7H2O 8.6Na2MoO4.2H2O 0.25CuSO4.5H2O 0.025CoCl2.6H2O 0.025Na2.EDTA37.3FeSO4.7H2O 27.8b.有机物肌醇 100。
7.如权利要求1所述的方法，其中Gamborg B5维生素，无论在什么情况下都包括成分浓度(mg/L)烟酸1.0盐酸吡哆醇 1.0盐酸硫胺10。
8.如权利要求1所述的方法，其中第一固体愈伤组织诱导培养基中作为外源提供的植物生长素的2，4-D选自0.44至4.4μM的范围，优选1.76至2.64μM。
9.如权利要求1所述的方法，其中第一固体愈伤组织诱导培养基中作为外源提供的细胞分裂素的BA选自0.22μM至2.2μM的范围，优选0.66μM至1.00μM。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述的第一固体愈伤组织诱导培养基中的胶凝剂选自0.6-0.8％wt./vol.范围、优选0.7％的琼脂以及0.15-0.29％wt./vol.范围、优选0.22％wt./vol.的phytagel。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述的第一固体愈伤组织诱导培养基包含作为首要碳源的葡萄糖。
12.如权利要求1所述的方法，其中将所述的外植体培养于所述的愈伤组织诱导培养基中，温度为23-33℃，优选27-29℃，光强度为至少90μmol/m2/s，光周期为16h，时间不超过3-5周，以使去分化的愈伤组织能从任何所述的外植体形成。
13.如权利要求1所述的方法，实质上包括下述步骤，即将愈伤组织从所述的第一固体愈伤组织诱导培养基转移至Ehrlenmeyer瓶中的液体培养基，填充密度为600至1000mg愈伤组织/50ml培养基，优选800mg/50ml，然后于旋转摇床上以110-130rpm摇动此步骤和随后所有步骤中的培养物，直到将体细胞胚取出用于发芽。
14.如权利要求1和13所述的方法，其中所述的胚发生诱导培养基为基础液体培养基，包括M&S盐、Gamborg B5维生素、肌醇和作为碳源的葡萄糖。
15.如权利要求1和13所述的方法，其中将液体培养基中的植物细胞悬浮物胚发生团块及其产生的体细胞胚在23至33℃的温度，优选27-29℃、光强度为20-40μmol/m2/s，典型地为27-33μmol/m2/s、光周期为16h的条件下培育。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述的胚发生块/团块于肌醇缺乏的培养基中经受肌醇缺乏8-12天时间，优选为10天，所述肌醇缺乏培养基包括MS基本的盐、Gamborg B5维生素、作为碳源的葡萄糖，但没有肌醇，导致体细胞胚的发育同步化。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述的第一固体愈伤组织诱导培养基的pH范围为5.4-6.2，所述方法中的全部液体培养基的pH范围为5.2-5.8，并于121℃，16psi高压灭菌16分钟而无菌。
18.如权利要求1所述的方法，其中盆栽混合物包括2∶1∶1∶1比例的栽培土壤∶沙子∶泥煤苔∶蛭石。
19.如权利要求1所述的方法，其中将体细胞胚发生的发育同步化用于优良棉花栽培品种的繁殖或转基因棉花栽培品种的发育。
20.如权利要求1所述的方法，其中将所述的肌醇缺乏用于除棉花以外的植物品种，以增强组织培养中的胚发生。
21.如权利要求1所述的方法，其中所述的培养用培养基和基础培养基包括Murashige和Skoog培养基。
22.如权利要求1所述的方法，其中所述的足以形成胚发生团块的时间为12-32天。
23.如权利要求1所述的方法，其中所述的包含体细胞胚的胚发生愈伤组织传代培养于所述基础培养基以8-12天的间隔进行。
24.如前述任一项权利要求所述的方法，其中将所述的胚发生块/团块经受肌醇缺乏8-12天时间，优选为10天。
25.如权利要求1所述的方法，其中用于所述的胚萌发培养基的所述支持物包括蛭石。
全文摘要
本发明公开了一种通过发育同步化的体细胞胚发生在棉花中再生植株的方法。本发明简单、快速、重现性好并且便于应用于植物遗传工程中，通过肌醇饥饿步骤实现了同步化的体细胞胚发生。
文档编号A01H4/00GK1886041SQ200380110957
公开日2006年12月27日 申请日期2003年12月31日 优先权日2003年12月31日
发明者拉克什·图丽, 米西勒什·库马尔 申请人:科学与工业研究委员会