专利名称：一种转基因棉花胚性愈伤分化培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及转基因棉花组织培养领域，具体是一种转基因棉花胚性愈伤分化培养基。
背景技术：
棉花转基因的目的是将外源目的基因转入常规棉花中，利用组织培养生物技术，培育具有抗病、抗虫、耐逆性强和品质优良等目的的棉花新种质资源，其常规组织培养方法为首先，利用携带外源目的基因的农杆菌侵染受体棉花下胚轴，共培养48小时后，经过愈伤诱导，愈伤诱导成胚状体(胚性愈伤)，胚性愈伤分化生成再生株(胚性愈伤分化成苗)，再生株移植等步骤。其中，在整个培养过程中，胚性愈伤分化成苗是最为关键步骤，其常规培 养基制作方法有两种，一种为添加MS大量元素、微量元素、葡萄糖，调整pH至6. 8，添加固化剂Phytagel (吉兰糖胶)，所述的固化剂Phytagel的浓度为2. 0 2. 5g/L ;另一种为添加MS大量元素、微量元素、葡萄糖,调整pH至6. 8,添加固化剂Phytagel,所述的固化剂Phytagel的浓度为2. (T2. 5g/L，该培养基表面添加有灭菌滤纸。培养方法为用透气膜包扎封口培养基，高压灭菌，接种转基因棉花胚性愈伤组织或处于分化萌芽状态的愈伤组织，培养间常规培养。一般情况下，愈伤诱导分化的胚性愈伤很多，但胚性愈伤分化成苗率较低。造成此结果的原因为采用第一种培养基培养，分化成苗玻璃化程度较高(卷曲畸形，透明质脆，生长不良)，导致胚性愈伤分化成苗率较低；采用第二种培养基培养，易分化，但分化成苗玻璃化程度也较高，且易产生污染现象(灭菌滤纸上易形成霉菌或其他杂菌)，尤其在夏季多雨季节,导致胚性愈伤分化成苗率较低。为了解决上述技术难点，迫切需要研究出一种适宜胚性愈伤分化成苗率较高，且分化成苗程度较低的转基因棉花胚性愈伤分化培养基。
发明内容
本发明为了解决现有转基因棉花胚性愈伤分化成苗率较低的问题，提供了一种转基因棉花胚性愈伤分化培养基。本发明是通过以下技术方案实现的一种转基因棉花胚性愈伤分化培养基，其制作方法为添加MS大量元素、微量元素、葡萄糖，调整pH值至6. 8，添加固化剂PhytagelJf述的固化剂Phytagel的浓度为4. (T4. 5g/L。本发明所述的MS大量元素、微量元素、葡萄糖的种类和添加量，以及调整pH的方法为本领域技术人员公知常识。所述的固化剂Phytagel的浓度单位g/L，为质量体积比，其体积为添加固化剂Phytagel之前的培养基的总体积。转基因棉花胚性愈伤分化培养基由于通常采用常规固化剂Phytagel使用浓度为
2.(T2. 5g/L，玻璃化现象较严重，即使培养基表面添加灭菌滤纸，玻璃化程度也较高，且易污染。引起分化成苗玻璃化现象的原因至今不明，比较统一的观点是细胞内含物如原生质体等得不到充分发育，液泡内水分含量过大，细胞内充满水分。针对玻璃化现象控制的主要方法是调节培养基水分含量制作培养基时增加固化剂用量，提高培养基凝固程度，降低培养基中的水势，达到在水份释放时以一种较缓慢的速度供给胚性愈伤生长发育的需要。以转基因棉花组织培养理论为基础，根据转基因棉花胚性愈伤分化对营养物质的需求，所以需要在常规固化剂Phytagel使用浓度基础上提高固化剂Phytagel使用浓度，但是如何掌握适宜的Phytagel使用浓度,并无相关的研究资料可以直接借鉴。若采用的Phytagel使用浓度太低，则胚状体细胞内的水份较高，其玻璃化现象较严重；若采用的Phytagel使用浓度太高，则培养基过硬，培养基中的营养物质难以扩散到培养物中。本发明经过大量的实验筛选出适宜的固化剂Phytagel浓度,大胆的打破了常规的固化剂Phytagel使用浓度,显著提高了固化剂的使用浓度，用于转基因棉花胚性愈伤分化的培养，使培养基对培养物(愈伤组织)之间产生水分胁迫，降低了胚性愈伤组织细胞内水份含量，可有效地控制玻璃化与污染等现象，提高胚性愈伤分化成苗率。另外，固化剂Phytagel浓度的提高，加大了对培养基中水份的束缚，有效的减少了由于培养基中水份蒸发后在瓶口及瓶壁冷凝回流对培养基造成的污染现象。本发明所述的转基因棉花胚性愈伤分化培养基通过显著提高固化剂Phytagel的 浓度，不易产生污染现象，有利于胚性愈伤的生长发育，可有效的改善分化幼苗的玻璃化现象，从而显著提高了胚性愈伤分化的成苗率。
图I为固化剂Phytagel的浓度为2. 0 g/L的胚状体的生长状况。图2为固化剂Phytagel的浓度为2. 5 g/L的胚状体的生长状况。图3为固化剂Phytagel的浓度为2. 0 g/L且培养基表面添加灭菌滤纸的胚状体的生长状况。图4为固化剂Phytagel的浓度为2. 5 g/L且培养基表面添加灭菌滤纸的胚状体的生长状况。图5为固化剂Phytagel的浓度为4. 0 g/L的胚状体的生长状况。图6为固化剂Phytagel的浓度为4. 5 g/L的胚状体转化再生株的生长状况。
具体实施例方式—种转基因棉花胚性愈伤分化培养基，其制作方法为添加MS大量兀素、微量兀素、葡萄糖，调整pH值至6. 8,添加固化剂Phytagel,所述的固化剂Phytagel的浓度为4.0g/L,4. 05 g/L,4. 10 g/L,4. 15 g/L,4. 20 g/L,4. 25 g/L,4. 30 g/L,4. 35 g/L,4. 40 g/L、4. 45 g/L、4. 5 g/L。I.材料与方法
I.I试验材料
选用转基因棉花胚性愈伤组织为实验材料。I. 2转基因棉花胚性愈伤分化培养基的制作
I.2. I实验一
MS大量元素、微量元素(MS大量元素以及微量元素均为常规用量),葡萄糖30g/L ；10%K0H 调整 pH 至 6. 8 ;
固化剂Phytagel的用量分别设置14组对比试验2. 0g/L、2. 5 g/L,2. 8 g/L,3. O g/L、
3.3 g/L、3. 5 g/L、3. 8 g/L、4. O g/L、4. 2 g/L、4. 5 g/L、4. 8 g/L、5.0 g/L、5. 2 g/L、5. 5 g/L0I. 2. 2 实验二
MS大量元素、微量元素(MS大量元素以及微量元素均为常规用量),葡萄糖30g/L ； 10%K0H调整pH值至6. 8 ；
固化剂Phytagel的用量分别设置2组对比试验2. 0g/L、2. 5 g/L ；
培养基表面添加有灭菌滤纸。I. 3培养方法
两实验的培养基均用透气膜包扎封口培养基，高压灭菌，接种转基因棉花胚性愈伤组织，培养间常规培养。2.结果
表I为实验一的结果显示，培养基中固化剂Phytagel的用量影响胚状体的生长。选用常规的固化剂Phytagel使用浓度(2. (T2. 5g/L)时，分化成苗玻璃化现象较严重，胚性愈伤分化成苗率较低。当固化剂Phytagel的浓度逐渐升高时,分化成苗玻璃化现象逐渐减少，胚性愈伤分化成苗率逐渐增加。当固化剂Phytagel的浓度超过4. 5g/L，会逐渐表现为培养基硬度增加，造成培养基中营养物很难被胚性愈伤组织吸收，导致胚性愈伤组织生长缓慢甚至死亡的现象发生。在4. (T4. 5g/L之间的范围，分化成苗玻璃化现象程度相对较低，胚性愈伤分化成苗率相对较高。因此，固化剂Phytagel浓度在4. (T4. 5g/L之间时，更适宜转基因棉花胚性愈伤分化的培养。 表I培养基表面不添加灭菌滤纸的情况下胚状体的生长状况
权利要求
1.ー种转基因棉花胚性愈伤分化培养基，其制作方法为添加MS大量元素、微量元素、葡萄糖，调整pH值至6. 8,添加固化剂Phytagel,其特征在于,所述的固化剂Phytagel的浓度为 4. 0 4· 5g/L。
全文摘要
本发明涉及转基因棉花组织培养领域，具体是一种转基因棉花胚性愈伤分化培养基，解决了现有转基因棉花胚性愈伤分化成苗率较低的问题，其制作方法为添加MS大量元素、微量元素、葡萄糖，调整pH值至6.8，添加Phytagel固化剂，所述的固化剂Phytagel的浓度为4.0~4.5g/L。本发明所述的转基因棉花胚性愈伤分化培养基通过显著提高固化剂Phytagel的浓度，不易产生污染现象，有利于胚性愈伤的生长发育，可有效的改善分化幼苗的玻璃化现象，从而显著提高了胚性愈伤分化的成苗率。
文档编号A01H4/00GK102648697SQ20121010646
公开日2012年8月29日 申请日期2012年4月12日 优先权日2012年4月12日
发明者上官小霞, 原辉, 吴霞, 崔婷, 张相斌, 李燕娥, 段晓康, 王霞, 韩青龙, 马冬菊, 马燕斌 申请人:山西省农业科学院棉花研究所