专利名称：棉花叶柄组织培养与高分化率材料选育方法
技术领域：
本发明涉及一种棉花的组织培养方法及其应用，特别是涉及一种棉花的组织培养方法及其在筛选高分化率棉花株系中的应用。
背景技术：
基因型对棉花体细胞胚发生和植株再生能力具有决定性作用。首先表现在棉属中不同棉种的体细胞胚发生和植株再生能力不同。研究人员通过对多个棉种进行比较发现，只有陆地棉、雷蒙德氏棉、夏威夷棉能形成体细胞胚。董合忠和陈志贤比较了4个棉花栽培种的体细胞胚发生能力，发现陆地棉较易诱导体细胞胚，亚洲棉次之，海岛棉和非洲棉较差(董合忠.不同基因型棉花下胚轴离体培养胚状体发生的研究。莱阳农学院学报，1991，97-101和陈志贤，李淑君.棉花细胞悬浮培养胚胎发生和植株再生某些特性的研究.中国农业科学，1987，20(5)6-11)。棉属共有50个种，包括45个野生种，4个栽培种，迄今为止仅克劳茨基棉、戴维逊氏棉、陆地棉、海岛棉、亚洲棉、草棉、雷蒙德氏棉和夏威夷棉8个种获得了体细胞胚，其中陆地棉、海岛棉、亚洲棉、草棉和戴维逊氏棉获得了再生植株。
此外，在体细胞胚发生和植株再生能力上，各个棉花品种间也存在差异。Trolinder对陆地棉28个品种进行了研究，结果只有珂字312和T25具有较高的体细胞胚发生能力，而其它品种较难或不能进行体细胞胚发生(Trolinder N L，Xhixian C.Genotypespecificity of the somatic embryogenesis response in cotton.Plant Cell Rep，1989，8133-136)。董合忠等根据成胚数量和发育成植株的多少将陆地棉品种分为四类第一类是体细胞发生能力强，易成苗的品种，如珂字312、珂字201等；第二类是具有一定的体细胞胚发生能力，成苗数量中等，经多次继代筛选后可得到较多的体细胞胚和部分再生植株，如岱字15、岱字16等；第三类是体细胞胚发生能力差，畸形胚多，经长时间继代筛选后方可得到个别植株，如鲁棉1号、7号等；第四类是体细胞胚极难或不能发生，如斯字棉215、斯字506等。棉花种质资源丰富，目前仅珂字棉系列，中棉系列、鲁棉系列等少数品种获得了体细胞胚和再生植株。
棉花组织培养中常用的外植体均来自无菌苗，一般为无菌苗的子叶、下胚轴，2002年张海申请了无菌苗子叶柄组织培养的专利([CAH01-006-113]利用子叶柄作为外植体的棉花组织培养方法)、2002年焦改丽建立了无菌苗胚根培养体系(焦改丽，李俊峰.利用新的外植体建立棉花高效转化系统的研究。棉花学报2002，10(1)6-9)。在现有培养体系下，取外植体进行组织培养时被培养的个体将不复存在，因此不能用于分化率遗传研究与高分化率材料选育。
发明内容
本发明的目的是提供一种棉花大田叶柄组织培养方法。
本发明所提供的棉花大田叶柄组织培养方法，包括以下步骤(1)以经灭菌的大田成熟叶柄为外植体，将其置于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基(命名为MSB1)是在由MS培养基的无机盐配方和B5培养基的维生素配方组成的MSB基本培养基(桂耀林，马诚编著《植物组织培养》，科学出版社，198523-27)的基础上添加了吲哚乙酸(IAA)0.05-0.15mg/L，激动素(KT)0.05-0.15mg/L，2，4-D 0.05-0.15mg/L，葡萄糖25-35g/L，凝胶剂(Gelrite)1.5-2.5mg/L，pH 5.6-6.0；(2)将愈伤组织置于分化培养基上进行分化培养；所述分化培养基(命名为MSB2)是在MSB基本培养基的基础上添加了吲哚乙酸0.001-0.05mg/L，激动素0.001-0.05mg/L，葡萄糖25-35g/L，凝胶剂1.5-2.5mg/L，pH 6.5-7.0；(3)将分化出的胚性愈伤组织置于胚状体萌发成苗培养基上进行再生成苗培养；所述胚状体萌发成苗培养基(命名为MSB3)是在MSB基本培养基的基础上添加了激动素(KT)0.001-0.05mg/L，6-BA 0.005-0.1mg/L，蔗糖25-35g/L，凝胶剂1.5-2.5mg/L，pH 6.5-7.0。
在上述棉花的组织培养方法中，所述对叶柄进行灭菌的方法可为将叶柄浸入质量百分浓度为0.1％的HgCl2溶液中浸泡4-5分钟，然后用无菌水冲洗掉残余的HgCl2。
为获得较好的愈伤组织，在培养前先切除叶柄两端的伤口部分，再将剩余部分切成0.4-0.6cm长的小段。
优选的培养基配方为步骤(1)中的愈伤组织诱导培养基优选为在MSB基本培养基的基础上添加了吲哚乙酸0.1mg/L，激动素0.1mg/L，2，4-D 0.1mg/L，葡萄糖30g/L，Gelrite 2mg/L，pH 5.8；步骤(2)中的分化培养基优选为在MSB基本培养基的基础上添加了吲哚乙酸0.005mg/L，激动素0.005mg/L，葡萄糖30g/L，Gelrite2mg/L，pH 6.8；步骤(3)胚状体萌发成苗培养基为在MSB基本培养基的基础上添加了激动素0.01mg/L，6-BA 0.01mg/L，蔗糖30g/L，Gelrite 1.5-2.5mg/L，pH 6.8。
上述组织培养方法对所有棉花品种的叶柄均适用，如中棉系列、珂字棉系列或鲁棉系列等，特别适用于中棉所24。
本发明的第二个目的是提供一种筛选高分化率棉花株系的方法。
本发明所提供的高分化率棉花株系的筛选方法，包括以下步骤1)以叶柄为外植体，用上述方法进行组织培养，选择分化率达70％以上的高分化率单株，自交后单株收获；2)对高分化率的单株株行种植扩繁、自交，同时以扩繁植株的叶柄为外植体用上述方法进行组织培养，选择分化率达90％以上的高分化率株系。
收获用上述筛选方法获得的高分化率株系的种子，用部分种子种植无菌苗，再以无菌苗的下胚轴为外植体进行组织培养，可对高分化率的株系作进一步筛选，选育出叶柄与无菌苗下胚轴均有高分化率的材料。
此外，还可将用上述筛选方法获得的高分化率单株与其它品种的棉花进行杂交，在F2代用与上述相同的方法选择高分化率株系，从而进行适合组织培养的棉花材料杂交选育，拓展棉花组织培养的基因型。
本发明提供了一种棉花的组织培养方法。该培养方法以叶柄为外植体，不仅分化率高，而且可用于高分化率棉花株系的筛选，筛选方法简单、周期短，可以进行推广应用。此外，筛选到的高分化率棉花还可以大幅度提高农杆菌介导法的转化效率，缩短转化周期。本发明将在棉花的组培、选育及其品种改良中发挥重要作用。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所述百分浓度如无特别说明均为质量百分浓度。
实施例1、中棉所24中高分化率株系的筛选愈伤组织诱导培养基在MSB基本培养基的基础上添加了吲哚乙酸0.1mg/L，激动素0.1mg/L，2，4-D 0.1mg/L，葡萄糖30g/L，Gelrite 2mg/L，pH 5.8。
分化培养基在MSB基本培养基的基础上添加了吲哚乙酸0.005mg/L，激动素0.005mg/L，葡萄糖30g/L，Gelrite 2mg/L，pH 6.8。
胚状体萌发成苗培养基在MSB基本培养基的基础上添加了激动素0.01mg/L，6-BA 0.01mg/L，蔗糖30g/L，Gelrite 1.5-2.5mg/L，pH 6.8。
上述培养基中的激素和其它组分均在灭菌前加入培养基中，培养基灭菌前，用1MKOH调pH值，然后在121℃、1.1kg/cm2的压力下高温高压灭菌14min。
以中棉所24为例，现对本发明高分化率棉花株系的筛选方法进行详细说明，筛选过程包括以下步骤
咖啡因的测定(分析设备)使用HPLC(日立制作所制)装置。
绘图仪D-2500，检测器L-4200泵L-7100，自动取样器L-7200柱Inertsil ODS-2，内径2.1mm×长250mm(分析条件)样品注入量10μl，流量1.0mL/min紫外线吸光光度计检测波长280nm洗提液A0.1mol/L乙酸水溶液洗提液B0.1mol/L乙酸乙腈溶液浓度梯度条件(体积％)
(咖啡因的保留时间)咖啡因27.2分由此处求出的面积％，根据标准物质求出质量％。
鞣酸的测定鞣酸的测定，是利用酒石酸铁法，将没食子酸乙酯用作标准液，以没食子酸的换算量求出。(参考文献“绿茶多酚”饮料食品用功能的下胚轴为外植体按常规方法进行组织培养，统计分化率，对用上述方法筛选的上述高分化率棉花株系进行无菌苗下胚轴培养。部分株系的分化率见表2，分化率具有较大差异(0-100％)，其中分化率达100％的材料所占比例高达42.8％，表明用本发明的方法选育无菌苗下胚轴高分化率的棉花材料也是有效的。
表2 筛选株系无菌苗下胚轴的分化率(％)
三、杂交选育将上述筛选到的中棉所24高分化率株系W10的单株与难分化的棉花品种TM-1杂交，F1代取40个单株，每个单株取30个叶柄切段，经组织培养后分化率为0，F2代的分化率统计结果见表3，从中可以选择出高分化率的单株，进一步证明分化率是可以遗传的，本发明的方法不仅可用于系统选育高分化率棉花株系，还可用于杂交选育高分化率棉花株系。
表3 中棉所24×TM-1F2代分化率(％)
四、检测选育株系的遗传转化效率将用上述方法选育出的分化率高达100％的W10株系进行农杆菌介导的遗传转化试验，以中棉所24为对照，W10于2005年5月20日进行遗传转化，所用基因及载体由中国农业科学院生物中心提供(参见发明专利编码杀虫蛋白质融合基因和表达载体及其应用，专利号CN95119563.8)。2005年11月统计转化率并嫁接再生植株。2006年5月统计不育率。转基因植株的转化率统计结果见表4，从抗性愈伤组织分化率看，W10转基因植株的分化率比筛选前的中棉所24植株提高了2-3倍，转化率也提高了2-3倍。转化周期由原来的12个月缩短到5-6个月。此外，由于组织培养的周期缩短、激素用量降低，再生植株的不育率也由原来的一半以上降低至10％左右。上述实验结果表明用本发明的方法可进行高分化率棉花材料的选育，并可将筛选出的高分率材料用于基因工程的品种改良中。
表4 W10农杆菌介导遗传转化率
实施例2、中394中高分化率材料的选育用与实施例1相同的方法对150株中394单株进行筛选，再对入选的高分化率单株继续用相同方法筛选出分化率更高的株系，结果选育出了7个分化率高于80％的株系(Z1-Z7)。2003年到海南加代，2004年在河南安阳中棉所试验田扩繁，并以叶柄为外植体用相同方法进行筛选，结果获得了分化率达到90％以上的株系Z3和Z7，Z1-Z7株系的分化率见表5。
表5 中394中选育材料的分化率(％)
2004年，以高分化率的Z7为母本，以难分化的中棉所12为父本进行杂交，F1代冬季送海南加代获得F2群体。2005年，对F2群体的分化率进行统计，结果145个单株的分化率呈正态分布，其分化率遗传表现为典型的数量性状，部分单株的分化率见表6。
表6 Z6×中棉所12 F2代部分单株分化率(％)
上述试验结果表明，棉花叶柄分化率表现为高遗传率。因此，通过杂交选育可以把高分化率性状转移到低分化率材料中，以改良低分化率材料，从而拓展棉花组织培养基因型的限制。
权利要求
1.一种棉花的组织培养方法，包括以下步骤(1)以经灭菌的大田成熟叶柄为外植体，将其置于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基是在由MS培养基的无机盐配方和B5培养基的维生素配方组成的MSB基本培养基的基础上添加了吲哚乙酸0.05-0.15mg/L，激动素0.05-0.15mg/L，2，4-D 0.05-0.15mg/L，葡萄糖25-35g/L，凝胶剂1.5-2.5mg/L，pH5.6-6.0；(2)将愈伤组织置于分化培养基上进行分化培养；所述分化培养基是在MSB基本培养基的基础上添加了吲哚乙酸0.001-0.05mg/L，激动素0.001-0.05mg/L，葡萄糖25-35g/L，凝胶剂1.5-2.5mg/L，pH6.5-7.0；(3)将分化出的胚性愈伤组织置于胚状体萌发成苗培养基上进行再生成苗培养；所述胚状体萌发成苗培养基是在MSB基本培养基的基础上添加了激动素0.001-0.05mg/L，6-BA 0.005-0.1mg/L，蔗糖25-35g/L，凝胶剂1.5-2.5mg/L，pH6.5-7.0。
2.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于所述对叶柄进行灭菌的方法为将叶柄浸入质量百分浓度为0.1％的HgCl2溶液中浸泡4-5分钟，然后用无菌水进行冲洗。
3.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于在培养前先切除叶柄两端的伤口部分，再将剩余部分切成0.4-0.6cm长的小段作为外植体。
4.根据权利要求1或2或3所述的组织培养方法，其特征在于所述步骤(1)中的愈伤组织诱导培养基为在MSB基本培养基的基础上添加了吲哚乙酸0.1mg/L，激动素0.1mg/L，2，4-D 0.1mg/L，葡萄糖30g/L，凝胶剂2mg/L，pH5.8；步骤(2)中的分化培养基为在MSB基本培养基的基础上添加了吲哚乙酸0.005mg/L，激动素0.005mg/L，葡萄糖30g/L，凝胶剂2mg/L，pH6.8；步骤(3)胚状体萌发成苗培养基为在MSB基本培养基的基础上添加了激动素0.01mg/L，6-BA 0.01mg/L，蔗糖30g/L，凝胶剂1.5-2.5mg/L，pH6.8。
5.一种筛选高分化率棉花株系的方法，包括以下步骤1)用权利要求1所述的方法对棉花进行组织培养，选择分化率达70％以上的高分化率单株；2)对高分化率的单株进行扩繁，株系收获，再以扩繁植株的叶柄为外植体用权利要求1的方法进行组织培养，经筛选得到分化率达90％以上的高分化率株系。
6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于收获高分化率株系的种子，用部分种子种植无菌苗，再以无菌苗的下胚轴为外植体进行组织培养，对高分化率的株系作进一步筛选，选育叶柄与无菌苗下胚轴分化率均高的株系。
7.根据权利要求5或6所述的筛选方法，其特征在于将获得的高分化率单株与其它品种的棉花进行杂交，在F2代用与所述方法筛选高分化率株系，以拓宽棉花的基因型。
全文摘要
本发明公开了一种棉花的组织培养方法及其应用。其目的是提供一种棉花的组织培养方法及其在筛选高分化率棉花株系中的应用。培养方法包括以下步骤(1)以经灭菌的叶柄为外植体，将其置于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织；(2)将愈伤组织置于分化培养基上进行分化培养；(3)将分化出的胚性愈伤组织在胚状体萌发成苗培养基上培养获得再生植株。该培养方法以叶柄为外植体，不仅分化率高，而且可用于高分化率棉花株系的筛选，筛选方法简单、周期短，可以进行推广应用。此外，筛选到的高分化率棉花还可以大幅度提高农杆菌介导法的转化效率，缩短转化周期。本发明将在棉花的组培、选育及其品种改良中发挥重要作用。
文档编号A01H1/02GK1864477SQ200610089439
公开日2006年11月22日 申请日期2006年6月27日 优先权日2006年6月27日
发明者张朝军, 李付广, 喻树讯, 范术丽, 王玉芬, 武芝侠, 李凤莲, 刘传亮 申请人:中国农业科学院棉花研究所