一种高效籼稻遗传转化方法与流程

本发明属于植物组织培养及转基因工程技术领域，具体而言，涉及一种高效籼稻遗传转化方法，本发明适用于诱导和继代籼稻成熟种子的愈伤组织，以及农杆菌介导的胚性愈伤组织的遗传转化方法。

背景技术：

水稻(oryzasatival.)是我国最重要的粮食作物之一，分为籼稻和粳稻两大亚种，其中籼稻是我国最大的栽培稻类型，栽培面积约占全国水稻面积的74％。利用转基因技术对水稻品种进行改良，培养高产、优质、多抗、广适的新品种在保障全球粮食安全的同时也是今后水稻育种的发展方向。因此，水稻的遗传转化，尤其是籼稻的遗传转化在品种改良、基因功能检测、创造突变体中发挥着越来越重要的作用，而建立高效、稳定的籼稻遗传转化体系是分子育种和功能基因组学等领域研究的前提。

近年来，水稻遗传转化技术取得了重要突破，并大部分在粳稻中建立了快速、高效、稳定的遗传转化体系。在此基础上，已经将许多重要性状如抗虫、抗病、抗逆、品质改良、发育调控、营养高效利用等外源基因转入水稻中。然而对于种植面积较大的籼稻而言，由于基因型的差异导致其组织培养特性普遍较差，转化难度明显大于粳稻。近几年来利用土壤农杆菌介导法转化籼稻也取得了一些成功，但是至今尚未建立一套像粳稻那样较为稳定的高效遗传转化体系。

已有研究表明，农杆菌介导的基因转化效率与受体基因型的愈伤组织状态、培养基、感染方式等因素有关。因此，通过优化籼稻遗传转化各阶段的参数，有望建立高效籼稻遗传转化体系。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种高效籼稻遗传转化方法，该方法所获得的愈伤组织质量好，适合转化，转化操作流程简便，转化率较高，所测试的2个籼稻品种都获得了成功，转化效率在35％-40％之间。

本发明通过以下技术方案实现：

一种高效籼稻遗传转化方法，包括以下步骤：

(1)愈伤组织的诱导

选取成熟良好、完整的籼稻种子的米粒，先用75％的酒精消毒3分钟，再浸泡于25％(v/v)的次氯酸钠溶液，并置于150rpm、25℃的摇床上消毒20分钟；在超净工作台上，将上述消毒后的种子用无菌水洗涤4-5次，然后转移至无菌滤纸上吸干水分，再将适量的种子接种于nb培养基，在28-30℃下光照培养8-10天，诱导愈伤组织；

(2)愈伤组织的预培养

在步骤(1)所述愈伤组织中挑选结构致密、颜色鲜亮、颗粒状的愈伤组织转入预培养基中，于28-30℃下光照培养3天用于转化；

(3)农杆菌的培养及农杆菌介导的转化

将含有目的基因的植物表达载体通过电激转化法转入农杆菌eha105，选取阳性菌株划线于yeb抗性平板，28℃暗培养3天，再用接种针刮取米粒大小的农杆菌震荡悬浮于装有70ml农杆菌浸染液的150ml三角瓶中，并置于150rpm、28℃的摇床上摇10分钟，然后将步骤(2)所述光照培养3天的籼稻愈伤组织浸泡于上述农杆菌浸染液中，在150rpm、28℃的摇床上摇10分钟；

(4)农杆菌与愈伤组织的共培养

将步骤(3)所述浸染后的籼稻愈伤组织置于无菌滤纸上吹干，然后将所述愈伤组织转移到共培养基上，共培养基平板预先垫一张无菌滤纸，用1ml的农杆菌浸染液打湿，并除去气泡，28℃暗培养3天；

(5)抗性愈伤组织的筛选

将步骤(4)所述共培养3天后的愈伤组织置于250ml三角瓶中，用无菌水洗涤4-5次，直至洗涤液清澈透明为止；然后加入过滤灭菌的500mg/l的羧苄青霉素溶液洗涤所述愈伤组织，室温置于摇床150rpm震荡洗涤15min，再将所述愈伤组织置于无菌滤纸上吸干水分，接种于含有相应筛选剂的筛选培养基上筛选，所述筛选培养的条件为28℃、光照培养20-22天，中间继代一次，直到长出抗性愈伤组织；

(6)抗性愈伤组织的分化

将步骤(5)所述筛选后得到的抗性愈伤组织转入含有筛选剂的分化培养基上，于28℃、光照培养18-23天，中间继代一次，使其再生绿苗；

(7)再生苗的生根

将步骤(6)所述分化培养基上长出的幼苗转入含有筛选剂的生根培养基中，30℃、光照培养10-12天，获得再生苗。

步骤(1)中所述的nb培养基组分为：n6无机盐和有机物+肌醇0.1g/l+谷氨酰胺0.5g/l+酸水解酪蛋白0.5g/l+脯氨酸2.878g/l+蔗糖30.0g/l+琼脂粉8.0g/l+2,4-d2.0mg/l，ph为5.8。

步骤(2)中所述的预培养基组分为：n6无机盐和有机物+肌醇0.1g/l+谷氨酰胺0.5g/l+酸水解酪蛋白0.5g/l+脯氨酸2.878g/l+蔗糖30.0g/l+琼脂粉8.0g/l+2,4-d2.0mg/l+乙酰丁香酮0.1mm，ph为5.8。

步骤(3)中所述的农杆菌浸染液组分为：aa无机盐和有机物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白0.5g/l+蔗糖68.5g/l+葡萄糖36.0g/l+谷氨酰胺0.9g/l+天冬酰胺0.3g/l+精氨酸0.176g/l，ph为5.2；使用前加入乙酰丁香酮0.1mm。

步骤(4)中所述的共培养基组分为：n6无机盐和有机物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白0.3g/l+蔗糖30.0g/l+葡萄糖10.0g/l+琼脂粉8.0g/l+2,4-d2.0mg/l，ph为5.2，灭菌后加入乙酰丁香酮0.1mm。

步骤(5)中所述的筛选培养基组分为：n6无机盐和有机物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白0.5g/l+脯氨酸2.878g/l+谷氨酰胺0.3g/l+蔗糖30.0g/l+植物凝集素4.0g/l+2,4-d2.0mg/l，ph为5.8；灭菌后加入羧苄青霉素400mg/l+潮霉素30mg/l或basta4mg/l。

步骤(6)中所述的分化培养基组分为：ms无机盐和有机物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白2.0g/l+脯氨酸0.3g/l+蔗糖30.0g/l+山梨醇30g/l+植物凝集素4.0g/l+naa0.02mg/l+kinetin2mg/l，ph为5.8；灭菌后加入羧苄青霉素400mg/l+潮霉素30mg/l或basta4mg/l。

步骤(7)中所述的生根培养基组分为：ms无机盐和有机物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白2.0g/l+脯氨酸0.3g/l+蔗糖30.0g/l+植物凝集素4.0g/l，ph为5.8；灭菌后加入羧苄青霉素400mg/l。

本发明的优点在于：

本发明对2个籼稻代表性品种籼型两系不育系628s和籼型两系恢复系2537进行农杆菌eha105介导的转化，转化效率高均在35％以上；本方法诱导的愈伤组织状态好，适合转化，整个转化操作流程周期较短。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

图1为本发明中籼型两系恢复系2537(a)和籼型两系不育系628s(b)成熟胚诱导的愈伤组织；

图2为本发明中籼型两系恢复系2537(a)和籼型两系不育系628s(b)愈伤组织预培养；

图3为本发明中籼型两系恢复系2537(a)和籼型两系不育系628s(b)筛选10天的愈伤组织；

图4为本发明中籼型两系恢复系2537(a)和籼型两系不育系628s(b)分化10天的愈伤组织；

图5为本发明中籼型两系恢复系2537(a)和籼型两系不育系628s(b)分化后产生的幼苗进行生根培养；

图6为本发明中籼型两系恢复系2537(a)和籼型两系不育系628s(b)部分t0代植株叶片的gus染色鉴定；

图7为本发明中籼型两系恢复系2537(a)和籼型两系不育系628s(b)部分t0代植株潮霉素基因的pcr检测电泳图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

(1)愈伤组织的诱导

选取成熟良好、完整的籼稻品种籼型两系恢复系2537的米粒，先用75％的酒精消毒3分钟，再浸泡于25％(v/v)的次氯酸钠溶液，置于150rpm、25℃的摇床上消毒20分钟；消毒后的种子在超净工作台用无菌水洗涤5次，然后用无菌滤纸吸干水分，再将种子接种于nb培养基；在28℃-30℃下光照培养8天，诱导愈伤组织(图1a)，其中，nb培养基组分为：n6无机盐和有机物+肌醇0.1g/l+谷氨酰胺0.5g/l+酸水解酪蛋白0.5g/l+脯氨酸2.878g/l+蔗糖30.0g/l+琼脂粉8.0g/l+2,4-d2.0mg/l，ph为5.8。

(2)愈伤组织的预培养

挑选结构致密、颜色鲜亮、颗粒状的愈伤组织转入预培养基中，于28℃-30℃下光照培养3天，用于转化(图2a)，其中，预培养基组分为：n6无机盐和有机物+肌醇0.1g/l+谷氨酰胺0.5g/l+酸水解酪蛋白0.5g/l+脯氨酸2.878g/l+蔗糖30.0g/l+琼脂粉8.0g/l+2,4-d2.0mg/l+乙酰丁香酮0.1mm，ph为5.8。

(3)农杆菌的培养及农杆菌介导的转化

含有目的基因的植物表达载体通过电激转化法转入eha105，将转化后的阳性eha105农杆菌菌株划线于yeb抗性平板，28℃暗培养3天，再用接种针刮取米粒大小的农杆菌，震荡悬浮于装有70ml农杆菌浸染液的150ml三角瓶中，置于150rpm、28℃的摇床上摇10分钟；同时，将预培养3天后的愈伤组织浸泡于农杆菌浸染液中，150rpm、28℃的摇床上摇10分钟；其中，农杆菌浸染液组分为：aa无机盐和有机物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白0.5g/l+蔗糖68.5g/l+葡萄糖36.0g/l+谷氨酰胺0.9g/l+天冬酰胺0.3g/l+精氨酸0.176g/l，ph为5.2；使用前加入乙酰丁香酮0.1mm。

(4)农杆菌与愈伤组织的共培养

将浸染后的愈伤组织置于无菌滤纸上吸干水分备用。共培养基平板上垫一张无菌滤纸，然后用1ml的农杆菌浸染液打湿，并除去气泡，然后将预先吸干水分的愈伤组织转移至共培养基中，28℃暗培养3天；其中，共培养基组分为：n6无机盐和有机物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白0.3g/l+蔗糖30.0g/l+葡萄糖10.0g/l+琼脂粉8.0g/l+2,4-d2.0mg/l，ph为5.2，灭菌后加入乙酰丁香酮0.1mm。

(5)抗性愈伤组织的筛选

将共培养3天后的愈伤组织置于250ml三角瓶中，用无菌水洗涤4次，直至洗涤液清澈透明为止。加入过滤灭菌的500mg/l的羧苄青霉素溶液洗涤愈伤组织，室温置于摇床150rpm震荡洗涤15min，再将愈伤组织置于无菌滤纸上吸干水分，接种于含有相应筛选剂的筛选培养基上筛选；筛选培养的条件为28℃，光照培养20天，每10天继代一次，直到长出抗性愈伤组织(图3a)，其中，筛选培养基组分为：n6无机盐和有机物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白0.5g/l+脯氨酸2.878g/l+谷氨酰胺0.3g/l+蔗糖30.0g/l+植物凝集素4.0g/l+2,4-d2.0mg/l，ph为5.8；灭菌后加入羧苄青霉素400mg/l+潮霉素30mg/l或basta4mg/l。

(6)抗性愈伤组织的分化

将筛选后得到的抗性愈伤组织转入含有筛选剂的分化培养基上，于28℃，光照培养20天，每10天继代一次，使其再生绿苗(图4a)，其中，分化培养基组分为：ms无机盐和有机物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白2.0g/l+脯氨酸0.3g/l+蔗糖30.0g/l+山梨醇30g/l+植物凝集素4.0g/l+naa0.02mg/l+kinetin2mg/l，ph为5.8；灭菌后加入羧苄青霉素400mg/l+潮霉素30mg/l或basta4mg/l。

(7)再生苗的生根

将分化培养上长出的幼苗转入含有筛选剂的生根培养基中，30℃，光照培养10天，获得再生苗；其中，生根培养基组分为：ms无机盐和有机物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白2.0g/l+脯氨酸0.3g/l+蔗糖30.0g/l+植物凝集素4.0g/l，ph为5.8；灭菌后加入羧苄青霉素400mg/l。

实施例2

(1)选取成熟良好、完整的籼稻品种628s的米粒，先用75％的酒精消毒3分钟，再浸泡于25％(v/v)的次氯酸钠溶液，并置于150rpm、25℃的摇床上消毒20分钟。消毒后的种子在超净工作台用无菌水洗涤5次，然后用无菌滤纸上吸干水分，再将种子接种于nb培养基。在28℃～30℃下光照培养10天，诱导愈伤组织(图1b)；nb培养基组分为：n6无机盐和有机物+肌醇0.1g/l+谷氨酰胺0.5g/l+酸水解酪蛋白0.5g/l+脯氨酸2.878g/l+蔗糖30.0g/l+琼脂粉8.0g/l+2,4-d2.0mg/l，ph为5.8。。

(2)愈伤组织的预培养

挑选结构致密、颜色鲜亮、颗粒状的愈伤组织转入预培养基中，于28℃-30℃下光照培养3天，用于转化(图2b)；预培养基组分为：n6无机盐和有机物+肌醇0.1g/l+谷氨酰胺0.5g/l+酸水解酪蛋白0.5g/l+脯氨酸2.878g/l+蔗糖30.0g/l+琼脂粉8.0g/l+2,4-d2.0mg/l+乙酰丁香酮0.1mm，ph为5.8。

(3)农杆菌的培养及农杆菌介导的转化

含有目的基因的植物表达载体通过电激转化法转入eha105。将转化后的阳性eha105菌株划线于yeb抗性平板，28℃暗培养3天，再用接种针刮取米粒大小的农杆菌，震荡悬浮于装有70ml农杆菌浸染液的150ml三角瓶中，置于150rpm、28℃的摇床上摇10分钟；同时，将预培养3天后的籼稻愈伤组织浸泡于农杆菌浸染液中，150rpm、28℃的摇床上摇10分钟；农杆菌浸染液组分为：aa无机盐和有机物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白0.5g/l+蔗糖68.5g/l+葡萄糖36.0g/l+谷氨酰胺0.9g/l+天冬酰胺0.3g/l+精氨酸0.176g/l，ph为5.2；使用前加入乙酰丁香酮0.1mm。

(4)农杆菌与愈伤组织的共培养

将浸染后的愈伤组织置于无菌滤纸上吸干水分备用。共培养基平板上垫一张无菌滤纸，然后用1ml的农杆菌浸染液打湿，并除去气泡，然后将预先吸干水分的愈伤组织转移至共培养基中，28℃暗培养3天；共培养基组分为：n6无机盐和有机物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白0.3g/l+蔗糖30.0g/l+葡萄糖10.0g/l+琼脂粉8.0g/l+2,4-d2.0mg/l，ph为5.2，灭菌后加入乙酰丁香酮0.1mm。

(5)抗性愈伤组织的筛选

将共培养3天后的愈伤组织置于250ml三角瓶中，用无菌水洗涤4次，直至洗涤液清澈透明为止。加入过滤灭菌的500mg/l的羧苄青霉素溶液洗涤愈伤组织，室温置于摇床150rpm震荡洗涤15min，再将愈伤组织置于无菌滤纸上吸干水分，接种于含有相应筛选剂的筛选培养基上筛选。筛选培养的条件为28℃，光照培养22天，每11天继代一次，直到长出抗性愈伤组织(图3b)；筛选培养基组分为：n6无机盐和有机物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白0.5g/l+脯氨酸2.878g/l+谷氨酰胺0.3g/l+蔗糖30.0g/l+植物凝集素4.0g/l+2,4-d2.0mg/l，ph为5.8；灭菌后加入羧苄青霉素400mg/l+潮霉素30mg/l或basta4mg/l。

(6)抗性愈伤组织的分化

将筛选后得到的抗性愈伤组织转入含有筛选剂的分化培养基上，于28℃，光照培养18天，每9天继代一次，使其再生绿苗(图4b)；分化培养基组分为：ms无机盐和有机物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白2.0g/l+脯氨酸0.3g/l+蔗糖30.0g/l+山梨醇30g/l+植物凝集素4.0g/l+naa0.02mg/l+kinetin2mg/l，ph为5.8；灭菌后加入羧苄青霉素400mg/l+潮霉素30mg/l或basta4mg/l。

(7)再生苗的生根

将分化培养上长出的幼苗转入含有筛选剂的生根培养基中，30℃，光照培养12天，获得再生苗(图5b)；生根培养基组分为：ms无机盐和有机物+肌醇0.1g/l+酸水解酪蛋白2.0g/l+脯氨酸0.3g/l+蔗糖30.0g/l+植物凝集素4.0g/l，ph为5.8；灭菌后加入羧苄青霉素400mg/l。

在实施例1中，本发明对籼稻品种籼型两系恢复系2537愈伤组织进行转化，将63个转化愈伤组织进行潮霉素抗性筛选，并对t0代植株叶片进行gus染色(图6a)和pcr检测(图7a)，最终得到24个阳性转基因植株，其转化效率达到了38.1％。

在实施例2中，本发明对籼型两系不育系628s愈伤组织进行转化，将54个转化愈伤组织进行潮霉素抗性筛选，并对t0代植株叶片进行gus染色(图6b)和pcr检测(图7b)，最终得到20个阳性转基因植株，其转化效率达到了37.04％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。