乌拉特柄扁桃sod蛋白基因序列及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种乌拉特柄扁桃SOD蛋白及其编码基因克隆方法与序列。本发明通过RACE方法克隆得到乌拉特柄扁桃SOD基因全长，对其编码蛋白进行分析，从而探讨该基因在提高转基因植物抗氧化、盐胁迫等方面的作用。乌拉特柄扁桃SOD基因作为一个潜在的抗逆候选基因，其全基因的克隆与功能分析以及对植物的遗传转化对于培育高抗逆的植物品种将具有一定的意义。本发明获取的乌拉特柄扁桃SOD基因将在乌拉特柄扁桃抗氧化机制研究、蔷薇科植物抗逆性中发挥重要作用。
【专利说明】乌拉特柄扁桃SOD蛋白基因序列及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种乌拉特柄扁桃S0D基因及其编码蛋白序列、基因克隆方法及应 用。
【背景技术】
[0002] 超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，简称S0D)是一种能够催化超氧化物通 过歧化反应转化为氧气和过氧化氢的酶，有效地防止它们对生物体的损害，几乎参与了生 物体对各种逆境的生理生化反应，是生物体内一种很重要的抗氧化酶类。它广泛存在于各 类动物、植物、微生物中。
[0003] 根据S0D结合的金属离子的不同，可分为Fe-SOD、Mn-SOD和Cu/Zn-S0D3种类型。 目前，国内外学者已经先后从白杨、甘薯、木薯、桃等等作物中克隆出该基因的cDNA全长序 列或片段序列。
[0004] 乌拉特柄扁桃（Prunus pedunculatacv. Wulate)是蔷薇科李属灌木，利用野生柄 扁桃种子，经多年栽培选育而成。抗旱、耐寒、耐瘠薄、抗风沙、耐沙埋、抗损伤性强。返青早、 枯黄晚，适口性较好。适宜内蒙古自治区中西部地区种植。目前为止，从乌拉特柄扁桃中获 得S0D基因序列尚未报道。通过RACE方法克隆得到乌拉特柄扁桃S0D基因全长，对其编码 蛋白进行分析，从而探讨该基因在提高转基因植物抗氧化、盐胁迫等方面的作用。乌拉特柄 扁桃S0D基因作为一个潜在的抗逆候选基因，其全基因的克隆与功能分析以及对植物的遗 传转化对于培育高抗逆的植物品种将具有一定的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种乌拉特柄扁桃S0D蛋白、基因序列及应用。
[0006] 本发明所提供的S0D蛋白，来源于乌拉特柄扁桃（Prunus pedunculata CV.Wulate)，是具有序列表中SEQIDN 0:2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQIDN0: 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No : 2的氣基酸残基序列相同活性的由SEQ ID No :2衍生的蛋白质。
[0007] 乌拉特柄扁桃S0D的基因，是下列核苷酸序列之一：
[0008] 1)序列表中的 SEQ ID No :1 ;
[0009] 2)编码序列表中SEQ ID No :2蛋白质序列的多核苷酸；
[0010] 3)与序列表中的SEQ ID No :1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同 功能蛋白质的DNA序列。
[0011] 序列表中SEQ ID No :1由1207个碱基组成，其开放阅读框为自5'端第76到第 789位碱基；序列表中SEQ ID No :2由237个氨基酸残基组成。
[0012] 含有本发明基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围。
[0013] 扩增乌拉特柄扁桃S0D基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
[0014] 本发明的S0D基因将为乌拉特柄扁桃生长发育过程研究，对植物生长发育的理论 研究打下坚实的基础，以及SOD基因功能研究具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1 :乌拉特柄扁桃S0D基因3'端扩增产物凝胶电泳图谱
[0016] 图2 :乌拉特柄扁桃S0D基因5'端扩增产物凝胶电泳图谱
[0017] 图3 :乌拉特柄扁桃S0D全长基因扩增产物凝胶电泳图谱
[0018] 图4 :乌拉特柄扁桃S0D蛋白与其它植物S0D蛋白序列比对 [0019] 图5 :乌拉特柄扁桃S0D蛋白与其它植物S0D蛋白进化树分析
[0020] 图6 :转基因与野生型拟南芥S0D活性检测
[0021] 图7 :离体叶片H202处理
【具体实施方式】
[0022] 实施例1、乌拉特柄扁桃S0D蛋白编码基因的获得
[0023] 1. 1RNA 的提取
[0024] RNA提取参照张劲松等人的方法进行（张劲松，等·中国科学，B辑，1995, 25 (5): 659?669)，乌拉特柄扁桃根在液氮中研碎，悬于抽提液（4mol/L硫氰酸胍中钠，5g/L十二 烷基肌氨酸，25mmol/L柠檬酸钠，0. lmol/L β -巯基乙醇），混合物用酸性苯酚、氯仿抽提， 上清中加入无水乙醇沉淀总RNA，再经4mol/L LiCl悬浮RNA沉淀、氯仿抽提1次，然后用乙 酸钠/乙醇沉淀总RNA，最后将RNA溶于水中，贮存于-20°C (备用，用0. 8%的琼脂糖检测 RNA的完整性。
[0025] 1.23' RACE 序列获得：
[0026] 利用NCBI网站上公布的桃S0D基因序列，设计一条引物SP1 : 5 ' _GGAGCATGCGTACTACTTACA-3 '，用于 3 ' RACE PCR 扩增。按照 SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech，Cat. no. K1811-1)的方法作 RT-PCR。3'端的扩增的循环参 数为：94°C变性5s，68°C退火10s，72°C延伸2min，35个循环。PCR产物经凝胶电泳分析得 知，获得约为500-bp的DNA条带（图1)，产物回收纯化，连接，转化，通过测序获得了 534-bp 的DNA片段，3'端序列为SEQ ID No:4。
[0027] 1.35' RACE 序列获得：
[0028] 利用3 ' RACE测序结果，设计一条引物SP 2 : 5，-CGCTGGCATACTTCCAGTTGATT-3'，用于 5，RACE PCR 扩增。按照 SMART RACE cDNA Amplification Kit的方法作RT-PCR。Y端的扩增循环参数为：94°C变性5s，72°C延伸 3min，5个循环；94°C变性5s，70°C退火10s，72°C延伸3min，5个循环；94°C变性5s，68°C退 火10s，72°C延伸2min，25个循环。PCR产物经凝胶电泳分析得知，获得约为750-bp的DNA 条带（图2)，产物回收纯化，连接，转化，通过测序获得了 763-bp的DNA片段，5'端序列为 SEQ ID No ：5.
[0029] 1. 4该基因编码区序列的获得
[0030] 以测序的:V RACE和Y RACE片段序列为基础，设计一对引物S0D-1和S0D-2用 于扩增完整编码区序列。
[0031] S0D_1 ：5/ -GTACATCTCCTCCCAGCAACACACT-3;
[0032] SOD-2 :5' -GGCCTCATTTGTCACACAGATCATT-3,
[0033] 扩增循环参数为：94°C变性30s，55°C延伸30s，72°C延伸lmin，30个循环。PCR产 物经凝胶电泳分析得知，获得约为750bp的DNA条带（图3)，产物回收纯化，连接，转化，通 过测序获得了 763bp的DNA片段，借助DNA拼接软件contig，获得该基因的cDNA的完整序 列，该序列全长为1207bp，具有SEQ ID No:l的DNA序列，76-786bp为其完整编码区域，具 有SEQ ID No :3的DNA序列编码的蛋白含有237个氨基酸残基，具有SEQ ID No :2的氨基 酸残基序列。
[0034] 实施例2、乌拉特柄扁桃S0D蛋白的序列及功能分析实验
[0035] 2. 2生物信息学分析：
[0036] 用BLAST和DNAMAN软件对乌拉特柄扁桃S0D蛋白的序列进行比较分析，结果表明 乌拉特柄扁桃S0D与桃、橡胶树及野草莓的S0D具有极大的同源性（如图4,图5所示）。
[0037] 2. 2转基因分析：
[0038] 2. 2. 1表达载体的构建
[0039] 设计引物1对引物用于构建植物表达载体
[0040] S0D-f ：5/ -cccTCTAGAATGGCTCTTCGAGCTCTCGTGGCC-3,
[0041] S0D-r ：5/ -cccGGATCCTCAAGGGCTTTCTTTCTCGTACAC-3'
[0042] (其中下划线部分分别表示Xbal，BamHI酶切位点）。
[0043] 植物表达载体的构建过程：提取乌拉特柄扁桃叶片的总RNA，用oligo (dT) 18作反 转录。反转录产物用引物S0D-f，S0D-r进行PCR，得到含有完整开放阅读框的DNA片段，连 接到PMD19-T载体上，获得重组克隆载体，命名为pMD-SOD。转化大肠杆菌，并送到生物公司 测序。对于含有正确序列的菌株，摇菌提取质粒，用Xbal和BamHI分别双酶切pMD-SOD和 PBI121载体，回收、纯化酶切产物。按照pBI121载体：S0D片段为1 :7的比例，用T4DNA连 接酶于16°C连接过夜，从而获得含有乌拉特柄扁桃S0D编码序列的重组表达载体，命名为 pBI-SOD。
[0044] 2. 2. 3拟南芥转化及鉴定
[0045] 利用质粒小提试剂盒提取pBI-SOD质粒，用CaCl2-冷冻法转化方法导入农杆菌 GV3101中。对转化的农杆菌进行PCR检测分析，利用花序浸泡法，对处于花蕾期的野生型拟 南芥进行处理，具体步骤为：用已制备好的含有PBI-S0D植物表达载体质粒的农杆菌菌液 对已经长出腋生花序的拟南芥植株进行侵染，约浸泡2min，罩上塑料薄膜保持湿度，遮光处 理Id后重新放置到人工气候箱中培养。收获转基因拟南芥种子，经75%的酒精消毒10min 后，均匀点播至含有50mg/L卡那霉素1/2MS培养基上，待种子发芽，选取能够正常生根的拟 南芥转移至土壤中继续培养。对转基因拟南芥植株，进行PCR检测。
[0046] 2. 2. 4抗氧化性检测
[0047] 收集转基因和野生型拟南芥植株相同部位的叶片0. 5g，放入预冷的研钵中，加入 lml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成楽，加缓冲液使终体积为5ml。取1. 5-2ml于lOOOrpm 下离心20min，上清液即为SOD粗提液。采用氮蓝四唑（NBT)，测定SOD含量。
[0048] 收集成熟转基因和野生型拟南芥植株相同部位的叶片，分别放置在含有5% H202 的MES缓冲液中（3mM，pH5. 7)。待三天后，观察离体叶片情况。
[0049] 2. 2. 5结果分析
[0050] 通过测定转基因拟南芥和野生型拟南芥叶片中SOD含量，结果显示，转基因植株 中S0D含量明显升高（图6)。通过分析转基因植物的抗氧化能力，将离体叶片放置在含有 5% H202的1^5缓冲液中，三天后，结果显示，转基因拟南芥叶片还能保持部分绿色，而野生 型拟南芥的绿色则部分或完全褪去（图7)。以上结果表明：转乌拉特柄扁桃S0D基因能够 提高转基因拟南芥的抗氧化能力，乌拉特柄扁桃S0D基因在植物抗氧化方面起着重要的作 用。
[0051] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限 制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技 术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依 据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本 发明的技术方案的范围内。
[0001] 序列表.txt SEQUENCE LISTING <110〉 申请人: <120〉乌拉特柄扁桃SOD蛋白基因序列及应用 <130〉乌拉特柄扁桃S0D蛋白基因序列及应用 <160> 5 <170> Patentln version 3. 3 <210〉 1 <211> 1207 <212> DNA <213> Prunus pedunculata <400> 1 aagtcttctc tcactctctc tctgccccct cctttctcgt cctttctgta catctcctcc 60 cagcaacaca cttcgatggc tcttcgagct ctcgtggcca ggaaatccct tggattgggg 120 tttcagagca aagccaaaat cctcgccgta ggttctacag ctcattcccg tggctttcaa 180 accttctcgc ttcccgacct tccgtacgac tatggcgctc tcgagcctgc aattagtggc 240 gagatcatgc agctccatca ccagaagcac caccagactt acgtcaccaa ctacaacaaa 300 gctcttgagc agctccacga cgccatcgcc aagggtgatg ctgctgctgt tgttaaattg 360 caaagcgcca tcaagttcaa tggcggaggt catgtcaacc actcgatttt ctggaagaat 420 ctgactcctg ttggtgtagg aggtggtgag ccccctcatg gttccctggg ctgggctatt 480 gacacaaatt ttggttctat ggaagcatta gtgcaaaaga tcaatgcaga aggcgctgct 540 ttgcagggtt ctggatgggt gtggctggct ctagaaaaag agttgaagaa acttgtggtt 600 gaaaccactg caaatcagga cccattggtt accaaaggac caactttagt tccattgctt 660 ggtattgatg tttgggagca tgcgtaclac ttacagtata agaatgtgag gccagattat 720 ctgaagaaca tatggaaagt aatcaactgg aagtatgcca gcgaagtgta cgagaaagaa 780 agcccttgag gctttgagca aatgaaggtg gcatttgcag ctagttgaga tgatgaaata 840 aaatgatctg tgtgacaaat gaggcccccc cttatttaat catcgacata tcccatccca 900 atcccatccc ttgtatgaaa ttgagatagt gtaagagtta tgtacgtatt taatcactgt 960 ttgtttcttt tttgtttgtt ccactgtttg atcgttcgat gcaataagtt atgtacgtaa 1020 ttggagcttt gtctattttg ctgcctgaaa tgagctttgt cgtcaacttt tgctatgatt 1080 tcgaggggct tgttgagggt aagtaaagtc gaggcactat tcaaatcgtt gcgatccaac 1140 catgttgaaa tcttatagaa ataaataact gtcttgtaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 SS30.33.3. 1207 <210〉 2 <211〉 237 <212〉 PRT <213> Prunus pedunculata <400> 2 Met Ala Leu Arg Ala Leu Val Ala Arg Lys Ser Leu Gly Leu Gly Phe 15 10 15 Gin Ser Lys Ala Lys He Leu Ala Val Gly Ser Thr Ala His Ser Arg 20 25 30
[0002] Gly Phe Gin Thr Phe Ser Leu Pro Asp Leu Pro Tyr Asp Tyr Gly Ala 35 40 45 Leu Glu Pro Ala lie Ser Gly Glu He Met Gin Leu His His Gin Lys 50 55 60 His His Gin Thr Tyr Val Thr Asn Tyr Asn Lys Ala Leu Glu Gin Leu 65 70 75 80 His Asp Ala lie Ala Lys Gly Asp Ala Ala Ala Val Val Lys Leu Gin 85 90 95 Ser Ala He Lys Phe Asn Gly Gly Gly His Val Asn His Ser He Phe 100 105 110 Trp Lys Asn Leu Thr Pro Val Gly Val Gly Gly Gly Glu Pro Pro His 115 120 125 Gly Ser Leu Gly Trp Ala He Asp Thr Asn Phe Gly Ser Met Glu Ala 130 135 140 Leu Val Gin Lys lie Asn Ala Glu Gly Ala Ala Leu Gin Gly Ser Gly 145 150 155 160 Trp Val Trp Leu Ala Leu Glu Lys Glu Leu Lys Lys Leu Val Val Glu 165 170 175 Thr Thr Ala Asn Gin Asp Pro Leu Val Thr Lys Gly Pro Thr Leu Val 180 185 190 Pro Leu Leu Gly He Asp Val Trp Glu His Ala Tyr Tyr Leu Gin Tyr 195 200 205 Lys Asn Val Arg Pro Asp Tyr Leu Lys Asn He Trp Lys Val He Asn 210 215 220 Trp Lys Tyr Ala Ser Glu Val Tyr Glu Lys Glu Ser Pro 225 230 235 <210> 3 <211> 711 <212> DNA <213> Prunus pedunculata <400> 3 atggctcttc gagctctcgt ggccaggaaa tcccttggat tggggtttca gagcaaagcc 60 aaaatcctcg ccgtaggttc tacagctcat tcccgtggct ttcaaacctt ctcgcttccc 120 gaccttccgt acgactatgg cgctctcgag cctgcaatta gtggcgagat catgcagctc 180 catcaccaga agcaccacca gacttacgtc accaactaca acaaagctct tgagcagctc 240 cacgacgcca tcgccaaggg tgatgctgct gctgttgtta aattgcaaag cgccatcaag 300 ttcaatggcg gaggtcatgt caaccactcg attttctgga agaatctgac tcctgttggt 360 gtaggaggtg gtgagccccc tcatggttcc ctgggctggg ctattgacac aaattttggt 420 tctatggaag cattagtgca aaagatcaat gcagaaggcg ctgctttgca gggttctgga 480
[0003] tgggtgtggc tggctctaga aaaagagttg aagaaacttg tggttgaaac cactgcaaat 540 caggacccat tggttaccaa aggaccaact ttagttccat tgcttggtat tgatgtttgg 600 gagcatgcgt actacttaca gtataagaat gtgaggccag attatctgaa gaacatatgg 660 aaagtaatca actggaagta tgccagcgaa gtgtacgaga aagaaagccc t 711 <210> 4 <211> 533 <212> DNA <213> Prunus pedunculata <400> 4 ggagcatgcg tactacttac agtataagaa tgtgaggcca gattatctga agaacatatg 60 gaaagtaatc aactggaagt atgccagcga agtgtacgag aaagaaagcc cttgaggctt 120 tgagcaaatg aaggtggcat ttgcagctag ttgagatgat gaaataaaat gatctgtgtg 180 acaaatgagg ccccccctta tttaatcatc gacatatccc atcccaatcc catcccttgt 240 atgaaattga gatagtgtaa gagttatgta cgtatttaat cactgtttgt ttcttttttg 300 tttgttccac tgtttgatcg ttcgatgcaa taagttatgt acgtaattgg agctttgtct 360 attttgctgc ctgaaatgag ctttgtcgtc aacttttgct atgatttcga ggggcttgtt 420 gagggtaagt aaagtcgagg cactattcaa atcgttgcga tccaaccatg ttgaaatctt 480 atagaaataa ataactgtct tgtaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 533 <210> 5 <211〉 763 <212> DNA <213> Prunus pedunculata <400> 5 aagtcttctc tcactctctc tctgccccct cctttctcgt cctttctgta catctcctcc 60 cagcaacaca cttcgatggc tcttcgagct ctcgtggcca ggaaatccct tggattgggg 120 tttcagagca aagccaaaat cctcgccgta ggttctacag ctcattcccg tggctttcaa 180 accttctcgc ttcccgacct tccgtacgac tatggcgctc tcgagcctgc aattagtggc 240 gagatcatgc agctccatca ccagaagcac caccagactt acgtcaccaa ctacaacaaa 300 gctcttgagc agctccacga cgccatcgcc aagggtgatg ctgctgctgt tgttaaattg 360 caaagcgcca tcaagttcaa tggcggaggt catgtcaacc actcgatttt ctggaagaat 420 ctgactcctg ttggtgtagg aggtggtgag ccccctcatg gttccctggg ctgggctatt 480 gacacaaatt ttggttctat ggaagcatta gtgcaaaaga tcaatgcaga aggcgctgct 540 ttgcagggtt ctggatgggt gtggctggct ctagaaaaag agttgaagaa acttgtggtt 600 gaaaccactg caaatcagga cccattggtt accaaaggac caactttagt tccattgctt 660 ggtattgatg tttgggagca tgcgtactac ttacagtata agaatgtgag gccagattat 720 ctgaagaaca tatggaaagt aatcaactgg aagtatgcca gcg 763
【权利要求】
1. 一种乌拉特柄扁桃SOD蛋白，是具有序列表中SEQ ID No :2氨基酸残基序列的蛋白 质，或者是将SEQ ID No :2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添 加且具有与SEQ ID No :2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID No :2衍生的蛋白质。
2. 根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述乌拉特柄扁桃SOD蛋白是序列表 中的 SEQ ID No :2。
3. 乌拉特柄扁桃SOD蛋白的编码基因，是下列核苷酸序列之一： 1) 序列表中的SEQ ID No :1 ; 2) 编码序列表中SEQ ID No :2蛋白质序列的多核苷酸； 3) 与序列表中的SEQ ID No :1限定的DNA序列具有95%以上同源性，且编码相同功能 蛋白质的DNA序列。
4. 根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述乌拉特柄扁桃SOD蛋白的编码基因 是序列表中的SEQ IDNo:l。
5. 根据权利要求4所述的基因，其特征在于：所述乌拉特柄扁桃SOD蛋白的编码基因 的读码框为序列表中SEQ ID No :1的自5'端第76到第786位碱基。
6. 含有权利要求3-5任一所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
7. 扩增权利要求3-5任一所述基因中任一片段的引物。
8. 权利要求3所述乌拉特柄扁桃SOD蛋白的编码基因在植物耐盐分子机制研究中的应 用。
9. 权利要求3所述乌拉特柄扁桃SOD蛋白的编码基因在植物耐盐性状改良中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104120111SQ201410235695
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年5月26日 优先权日:2014年5月26日
【发明者】孙杰, 刘永志, 晁跃辉, 张爱东, 羿静, 李敬忠, 王凤武, 青格乐 申请人:内蒙古自治区农牧业科学院