专利名称：水稻转基因的方法
技术领域：
本发明属于一种水稻转基因的方法，尤其适合外缘基因(DNA)转移到水稻中。
目前植物的遗传转化主要采用以根癌农杆菌的T1质粒和发根农杆菌的R1质粒为载体的转化系统，由于水稻等单子叶植物对根癌农杆菌和发根农杆菌不敏感，难以通过该系统进行遗传转化。而目前在水稻上应用的遗传转化方法，一是以原生质体为受体的转化方法，其原理是将原生质体悬浮在含有DNA的PEG或高钙溶液中，使DNA渗透到原生质体中，然后将原生质体培养成植株。该方法存在的主要问题是水稻原生质体的制备和培养难度大、再生成植株频率低。另一种方法是基因枪法，其原理是将DNA包被在微小的金粉或钨粉表面，在高压的作用下高速穿透细胞壁进入受体细胞中。该方法存在的主要问题是易出现嵌和体(即同一株组织、器官或植物的一部分细胞被转化，另一部分细胞未被转化)，必须经过严格的筛选才能获得真正的转化细胞；并且仪器及实验费用昂贵。以上两种方法因都是以二倍体细胞为转化受体，因此还存在后代分离的问题。
本发明的目的是提供了一种水稻转基因的方法，方法易行，提高了转化频率，解决了转化后代分离、快速稳定(固定)转化后代的问题。
为了实现上述任务。本发明采用以下技术措施；为达到快速稳定(固定)转化后代目的，以花粉细胞作为转化受体细胞，在活体植株条件注射DNA和离体条件下真空负压强吸收DNA两道程序使DNA进入受体细胞(花粉)内。经花药(花粉)培养成单倍体花粉植株，经自然加倍成纯合的二倍体植株，使转化后代得以迅速稳定。单倍体细胞只有一套染色体，如果DNA整合到受体细胞染色体上，经自然或诱导加倍后成为纯合的二倍体，即细胞中的两套染色体具有同样的DNA结构，在以后的世代中不会发生性状分离。而以前的转化方法均以二倍体细胞为转化受体，二倍体细胞有两套染色体，如果DNA进入受体细胞中，很可能整合到受体细胞染色体中的一套染色体上，而另一套染色体的对应位置没有外源的DNA，即成为杂合体，后代不可避免会发生分离。只有DNA整合到两套染色体的同一位置上才成为纯合体。而这种情况发生的频率是非常低的、几乎不可能发生。为提高转化频率，即增加外源DNA进入受体细胞的频率，通过活体和离体两道程序将DNA转移到受体细胞(花粉)中。第一道程序是在水稻活体植株减数分裂时(即叶枕距为-1cm至+1cm时)，将DNA溶液注入到穗茎节或穗茎节下部的茎腔中。因为水稻在减数分裂时期生理活动中心是在颖花内部，这时茎输导组织主要是向上运输，注射到穗茎中DNA随着输导组织向上运输到颖花内的小孢子细胞(单核花粉细胞)。第二道程序是将离体的花药放在DNA溶液中，用抽真空的办法使花药吸收DNA。
本发明的技术路线植株→注射DNA→花药(花粉)→DNA真空渗入花药(花粉)→诱导培养→愈伤组织→分化培养→花粉再生苗→染色体加倍→双倍体植株→转化后代鉴定→转化植株。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果1、花粉细胞是单倍体细胞，将DNA转移到花粉细胞中，然后进行组织培养成单倍体植株，经自然加倍后变成纯合的双倍体植株，这样避免了以双倍体细胞为转化受体的方法中存在的后代分离问题；2、将花粉细胞培养成植株比将原生质体培养成植株更容易；3、通过活体和离体两道程序将DNA转移到受体细胞(花粉)中，提高了DNA转移到受体细胞的概率；4、转化效率高、后代稳定快。
实施例采用以下步骤1、在水稻植株减数分裂时期(即叶枕距为-1cm至+1cm)。将穗茎节外的苞叶分开，用100ul医用微量注射器将DNA溶液注入到穗茎节或穗茎节下部的茎腔中，每穗注入DNA溶液100-300ul。然后让植株自然生长。
2、待花粉发育至单核靠边期时(即叶枕距为+3至+5cm时)，剪取植株，用水冲洗干净、70％酒精表面消毒后，用湿纱布包囊放入冰箱(6-8℃)预处理10天。在无菌条件下剥出幼穗，通过外部特征(颖壳黄色、颖尖微绿色)和显微镜观察核实，选取处在小孢子单核靠边期的幼穗，用0.1％升汞消毒15分钟，无菌水冲洗3-4次。剥出花药放在已灭菌的5毫升离心管中，然后往离心管中加DNA溶液，抽真空至漂浮在液面的花药下沉。
3、诱导培养、4、分化培养、5、染色体加倍均同于常规花药(花粉)培养、6、转化后代鉴定同其它转化体系。
权利要求
1.一种水稻转基因的方法，其特征是A、以花粉细胞为转化受体细胞，在活体植株下注射DNA和离体下真空负压吸收DNA两道程序使DNA进入受体细胞(花粉)内；B、在水稻植株减数分裂时期，将茎节处的苞叶分开，再将DNA溶液注入到穗茎节或穗茎节下部的茎腔中，注入DNA溶液100-300ul；C、待花粉发育至单核靠边期时，剪取植株，用水冲洗干净，70％酒精表面消毒后，用湿纱布包裹放入冰箱预处理，选取处在小孢子单核靠边期的幼穗，用0.1％升汞消毒，无菌水冲洗3-4次，剥出花药放在灭菌的离心管中，然后往离心管中加DNA溶液，抽真空至漂浮在液面的花药下沉。
全文摘要
本发明公开了一种水稻转基因的方法,以花粉细胞为转化受体细胞,在活体植株下注射DNA和在离体下真空负压吸收DNA两道程序使DNA进入受体细胞(花粉)内,在水稻植株减数分裂时期,将茎节处的苞叶分开,再将DNA溶液注入到穗茎或穗茎节下部的茎腔中,注入DNA溶液100—300ul,待花粉发育至单核靠边期时,剪取植株,用水冲洗干净,70%酒精表面消毒后,用湿纱布包裹放入冰箱预处理,选取小孢子单核靠边期的幼穗,用0.1%升汞消毒,无菌水冲洗3—4次,剥出花药放在灭菌的离心管中,然后往离心管中加DNA溶液,抽真空至漂浮在液面的花药下沉,本发明方法易行,转化效率高、后代稳定快,提高了DNA转移到受体细胞的概率。
文档编号C12N15/82GK1258749SQ9812173
公开日2000年7月5日 申请日期1998年12月25日 优先权日1998年12月25日
发明者周建林, 冯双华, 李阳生 申请人:中国科学院长沙农业现代化研究所