专利名称：：转基因水稻品系科丰6号的外源插入片段的旁侧序列的制作方法
技术领域：
：本发明涉及的是一种生物
技术领域：
的基因序列。具体的说，涉及一种转基因水稻品系科丰6号的外源插入片段的旁侧序列。技术背景水稻是我国最重要的粮食作物之一，随着转基因技术在水稻中的广泛研究和应用，己经有多个转基因水稻品系进行了环境释放，申请商业化种植。对转基因植物进行品系特异性的检测是对转基因植物进行监督管理，保障其健康发展的重要技术基础。而转基因植物的外源插入片段的旁侧序列是转基因植物品系最重要的分子特征之一，因此，外源插入片段的旁侧序列是建立转基因植物品系特异性检测方法的重要技术资料。目前己经有部分专利和文献报道了转基因植物外源插入载体旁侧序列，例如张大兵等人于2006年利用TAIL-PCR方法分析了玉米品系MON863的外源插入片段的旁侧序列，建立了转基因MON863玉米的品系特异性检测方法。然而，在对现有的专利和文献的分析中发现，还没有任何关于转基因水稻品系科丰6号的外源插入片段的旁侧序列的文章和专利报道。
发明内容针对上述领域中的空白，提供了一种转基因水稻品系科丰6号的外源插入片段的旁侧序列。进一步，本发明还提供该转基因品系特异性的PCR检测方法。一种转基因水稻品系科丰6号的外源插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列为5'端旁侧序列，其特征在于5'端旁侧序列如SEQIDN01所示。一种转基因水稻品系科丰6号的外源插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列为3'端旁侧序列，其特征在于3'端旁侧序列如SEQIDN02所示。5'端旁侧序列的制备方法，是通过Genomewalking扩增得到。3，端旁侧序列的制备方法，是通过LD-PCR扩增得到。转基因水稻品系科丰6号的外源插入片段的旁侧序列的定性PCR检测方法，其特征在于:所述PCR反应中的两条引物组合为权利要求1所述旁侧序列的特异性引物一条引物为依据SEQIDNOl中l-345位序列设计的正向引物，另一条引物为依据SEQIDNOl的346-1346位序列设计的反向引物。所述正向引物为KF-G2:5'-AGCATGTCACGGTGTCTGTC-3'，所述反向弓I物为CpTI-p2:5'-TCCAGAGTTCATCTTTCTCATCATC-3，。转基因水稻品系科丰6号的外源插入片段的旁侧序列的定性PCR检测方法，其特征在于所述PCR反应中的两条引物组合为权利要求1所述旁侧序列的特异性引物一条引物依据SEQIDN02中1-1182位序列设计的正向引物，另一条引物依据SEQIDN02的1183-1867位序列设计的反向引物。所述正向序列为1034f:5，-GCAACGATACGTTGTTGTGG-3，，所述反向序歹U为1426r:5，-TCTCCTCTCACTCGTGATCG-3，。根据Rong等(Rongeta1，2005，NewPhytologist，168:559-566)报道的用于转化的载体pCUBAC-HYG的结构，其中T-DNA区域结构见图1，由/z/^抗性基因表达盒、cr;;L4c基因表达盒和Cpr堪因表达盒组成。本发明采用常规方法，提取植物基因组DNA，利用Genomewalking分离法得到5'端旁侧序列1346bp，其核苷酸序列如SEQIDN01所示。通过分析，该5'端旁侧序列包括水稻基因组序列，位于水稻4号染色体(GenBank登记号AP008210)的33048719-33049063，其核苷酸序列与SEQIDNO.l中从l-345位的核苷酸序列完全相同；fillerDNA，来源于整合过程中的DNA修复序列，其核苷酸序列与SEQIDNO.l中346-355位的核苷酸序列完全相同；转化载体pCUBAC-HYG部分序列，其核苷酸序列与SEQIDNO.l中356-1346位的核苷酸序列完全相同；利用LD-PCR分离法得到3'端旁侧序列1867bp，其核苷酸序列如SEQIDN02所示。通过分析，该3'端旁侧序列包括转化载体pCUBAC-HYG部分序列，其核苷酸序列与SEQIDN02中的1-1182位的核苷酸序列完全相同；水稻基因组序列，位于水稻4号染色体(GenBank登记号AP008210)的33049063-33049747位，其核苷酸序列与SEQIDN0.2中从l183-1867位的核苷酸序列完全相同。转基因水稻品系科丰6号的外源插入片段的旁侧序列的定性PCR检测方法，可以5'端旁侧序列和/或3，端旁侧序列作为目的DNA扩增片段。根据5'端旁侧序列设计特异性引物，其正向引物可根据l-345位的核苷酸序列设计，即是按照水稻基因组序列设计，位于水稻4号染色体(GenBank登记号AP008210)的33048719-3304卯63，反向引物可根据346-1346位的核苷酸序列设计，即是按照转化载体pCUBAC-HYG部分序列设计，本发明设计的正向弓i物为KF-G2:5，-AGCATGTCACGGTGTCTGTC-3，，反向引物为CpTI-p2:5'-TCCAGAGTTCATCTTTCTCATCATC-3，。根据3'端旁侧序列设计特异性引物，其正向引物可根据1-1182位的核苷酸序列设计，即是按照转化载体pCUBAC-HYG部分序列设计，反向引物可根据1183-1867位的核苷酸序列设计，即是按照水稻基因组序列，位于水稻4号染色体(GenBank登记号AP008210)的33049063-33049747位，本发明设计的正向序列为1034f:5'-GCAACGATACGTTGTTGTGG-3，，反向序列为1426r:5'-TCTCCTCTCACTCGTGATCG-3'。本发明首次克隆了转基因水稻品系科丰6号的外源插入片段的旁侧序列，并且明确了转基因水稻品系科丰6号的外源插入片段的旁侧序列可以用作目的DNA扩增片段建立灵敏、特异性的转基因水稻品系科丰6号的品系特异性定性、定量PCR检测。本发明所克隆、分离的外源插入片段的旁侧序列可以进一步用于建立转基因品系特异性PCR检测方法。图1转基因水稻品系科丰6号的转化载体pCUBAC-HYG的T-DNA区域结构示意2转基因水稻品系科丰6号Genomewalking扩增获得5'端旁侧序列M:markerDL2000;1:DL2(Stul);2:DL3(EcoRV);3:DL4(Dral)图3转基因水稻品系科丰6号LD-PCR扩增获得3'端旁侧序列M:入/HindlII;1:KF-G3/hpt-F弓i物组合；2:KF-G3/nos-R弓I物组合图4转基因水稻品系科丰6号的5'端旁侧序列特异性引物KF-G2/CpTI-p2检测M:markerDL2000;1,2:转基因水稻品系科丰6号；3,4:对照明恢86图5转基因水稻品系科丰6号的3'端旁侧序列特异性引物1034f/1426r检测。M:markerDL2000;1,2:转基因水稻品系科丰6号；3,4:对照明恢8具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例l转基因水稻品系科丰6号的外源插入载体的旁侧序列的克隆一、实验材料1、植物材料转基因水稻转基因水稻品系科丰6号。常规水稻明恢86。2、酶与试剂分子生物学试剂，如dNTPs、TaqDNA聚合酶、DL2000Marker购自大连宝生物生物工程有限公司。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。3、实验仪器PCR扩增仪EppendorfMastercyclegradient(Eppendorfco.)核酸电泳仪DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)DNA测序仪(AppliedBiosystem377型全自动荧光序列分析仪)DNA电泳分析系统KodakEDAS290(Kodakco.)其它仪器包括离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。二、实验方法和过程1、外源插入载体转基因水稻品系科丰6号由外源插入载体pCUBAC-HYG转化而来，由/z/^抗性基因表达盒、(T7"c基因表达盒和Cpr堪因表达盒组成，见图l。2、植物基因组DNA提取与检测2.1、植物DNA小量提取2丄1、抽提液的配制<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2丄2、裂解液的配制<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.1.3、提取方法a称取200-400mg水稻叶片，在液氮中磨碎，装入己经用液氮预冷的1.5ml离心管中。b加入lml预冷至4'C的抽提液，剧烈摇动混匀后，在冰上静置5分钟，用13000r/min离心机，4'C离心15min，弃去上清液。c加入600pl预热到65'C的抽提裂解液，用玻棒搅拌上下颠倒充分混匀，在65'C的水浴锅中裂解40min。d用13000r/min离心机室温离心10min，将上清液转至另一离心管中，加入5nlRNaseA(10mg/ml)，37°C水浴30min。e分别用等体积苯酚氯仿异戊醇(25:24:1)和氯仿异戊醇(24:1)各抽提一次。f用13000r/min离心机室温离心10min，将上清转至另一离心管中。加入2/3体积异丙醇，1/10体积3M乙酸钠(pH5.6)，-20°C放置2-3h，充分沉淀DNA。g13000r/min，4°C离心15min，用70。/。乙醇洗沉淀一次，倒出乙醇，晾干DNA。加入50plTE(pH8.0)溶解DNA。h把DNA溶液浓度用重蒸馏水调制为100ng/W，储存于-20'C备用。2.2、植物DNA大量提取2.2.1、Buffer"S"的配制<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.2.2、提取方法a取水稻叶片2克，剪成约lcm小段，置于研钵之中液氮研磨粉碎；b加入10mlBuffer"S"、50nl蛋白酶K(浓度为10mg/ml)，65。C温育1-2小时，并不时轻轻混匀；c加入10ml苯酚氯仿异戊醇(25:24:1),倒置混匀，3,000rpm离心20分钟；d上层水相移至一新的离心管，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀；e用玻璃棒挑出沉淀，并浸于70%乙醇之中洗涤；f挑出沉淀置于新的离心管中，离心并去尽液体，略微干燥后溶于2mlTE之中；g加入5plRNaseA(浓度为10mg/ml)，37。C保温1小时；h加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇，轻轻混匀，3,000rpm离心15分钟；i保留水相，加入l/10体积3mol/L乙酸钠、2.5倍体积的无水乙醇，轻轻混匀；j挑出沉淀，70%乙醇洗涤，离心，去除多余的液体，真空干燥；k加入0.5-lml的TE溶解DNA;1测定DNA浓度，保存于4T:备用。2.3、DNA检领iJ取5nl提取的DNA溶液，以0.8%的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判断提取DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提取的DNA的浓度和纯度。3、科丰6号旁侧序列的分离本实施例采用Genomewalking的方法分离得到科丰6号的5'端旁侧序列，再根据5'端旁侧的水稻基因组序列，设计引物，通过LD-PCR的方法获得3'端旁侧序列。3.1、Genomewalking分离己知序列的旁侧序列Genomewalking是一种扩增已知序列旁侧未知区域序列的方法，主要步骤为基因组DNA酶切、与接头连接、两次巢式PCR扩增等。本实施例在采用TAIL-PCR扩增获得了3'端序列，但仍未得到旁侧水稻基因组序列。在此基础上，采用Genomewalking的方法，继续扩增其旁侧序列，结果获得旁侧的水稻基因组序列。参照Genomewalking试剂盒说明，主要操作步骤如下。3丄1、基因组DNA酶切3丄1.1、分别将5个1.5mL的离心管标记为DLl、DL2、DL3、DL4和阳性对照。3丄1.2、酶切反应体系在标记好的离心管DL1、DL2、DL3、DL4里分别加入试样基因组DNA，并在DL1中加入核酸内切酶PvuII、DL2中加入StuI、DL3中加入EcoRV、DL4中加入Dral，在阳性对照中加入人蓋因组DNA和核酸内切酶PvuII，配制方法见表1。表l酶切反应体系试剂单样品体积基因组DNA(刚ng4iL)25nL10x酶切缓冲液10pL核酸内切酶(10U4iL)8nLddH2057nL总体积脚L3丄U、混匀反应液，37。C温浴2hr后，取出离心管，低速离心5-10sec，继续温浴16-18hr。3丄1.4、各取5nL进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否完全。3丄2、纯化酶切产物按回收试剂盒说明书纯化酶切产物。3丄3、连接反应按表2配制连接反应体系，混匀反应液，16。C水浴过夜。然后7(TC变性5min。在每个离心管中加入72^iLddH20，混匀，-20°"呆存备用。表2连接反应体系试剂单样品体积纯化的酶切产物4jxL接头序列(25fiM)l单10x连接缓冲液1.6nLT4DNA连接酶(6U/nL)0.5nLddH208^总体积16nL3丄4、第1轮PCR反应3.1.4.1、PCR扩增反应体系第1轮PCR反应体系的总体积为50^L，反应体系见表3。表3第1轮PCR反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注若PCR缓冲液中含有MgCl2则不需再加。在PCR反应管中按表3依次加入反应试剂，在台式离心机离心10s。3丄4.2、PCR扩增反应程序PCR扩增反应程序见表4。反应结束后取出PCR反应管，对PCR反应产物进行电泳检测或在4'C下保存待用。表4.第1轮PCR扩增反应程序<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3.1.4.3、PCR产物的电泳检测将适量的琼脂糖加入lxTAE缓冲液中，加热将其溶解，配制成浓度为2.0%(w/v)的琼脂糖溶液，然后按每100mL琼脂糖溶液中加入5pLEB溶液的比例加入EB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入lxTAE缓冲液中，轻轻垂直向上拔去梳板。吸取7的PCR产物与适量的加样缓冲液混合后加入至凝胶泳道中，在其中一个泳道中加入DNA分子量标准，接通电源在2V/cm条件下电泳。3丄4.4、凝胶成像分析电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，轻轻地置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。若PCR产物呈弥散状，进行后续的反应。3丄5、第2轮PCR反应3丄5.1、PCR扩增反应体系第2轮PCR反应体系的总体积为50^L，反应体系见表5。在PCR反应管中按表5依次加入反应试剂，在台式离心机离心10s。表5第2轮PCR反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注若PCR缓冲液中含有MgCl2则不需再加。3丄5.2、PCR扩增反应程序PCR扩增反应程序见表6。反应结束后取出PCR反应管，对PCR反应产物进行电泳检测或在4x:下保存待用。表6.第2轮PCR扩增反应程序<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>将适量的琼脂糖加入lxTAE缓冲液中，加热将其溶解，配制成浓度为2.0%(w/v)的琼脂糖溶液，然后按每100mL琼脂糖溶液中加入5pLEB溶液的比例加入EB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入lxTAE缓冲液中，轻轻垂直向上拔去梳板。吸取7的PCR产物与适量的加样缓冲液混合后加入至凝胶泳道中，在其中一个泳道中加入DNA分子量标准，接通电源在2V/cm条件下电泳。3.1.5.4、凝胶成像分析电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，轻轻地置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。若第二轮PCR扩增出特异的条带，进行后续的反应。否则调整反应程序，重新进行PCR扩增。3.2、LD-PCR扩增获得3'端旁侧序列长链PCR用于扩增水稻基因组中长片段。本实施例中用于扩增转基因水稻品系科丰6号的外源插入载体的3'端旁侧序列。根据扩增得到的5'端旁侧序列中的水稻基因组，设计其下游区域的特异性引物KF-G3，与在转化载体pCUBAC-HYG上附近设计引物nos-R和hpt-F，分别组合进行扩增，引物序列见表7。表7用于LD-PCR的引物引物序歹uKF-G35,-TGAACACTTTGCCACTTCCC-3'rios-H5'-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3'hpt-F5'-CGCCGATGGTTTCTACAA-3'LD-PCR扩增体系为总体系50pL，ExTaq(Takaraco.,Dalian),1.25U10xExTaqBuffer5pL，dNTP(各2.5mM)4pL，水稻DNA2pL(10ng/^iL)，引物各2pL(25一)。LD-PCR扩增程序94。C4min;(98°C10s，68°C15min)，30cycles;72°C10min。4、序列测定和分析PCR扩增产物在0.8%的琼脂糖胶上进行电泳，采用QIAquickGelExtractionkit回收扩增片段，连接到pGEM-Teasy(Promega,Madison,Wis.)，采用ABIPRISM1300GeneticAnalyzer进行序列测定。采用vectorNTI10.0(Invitrogen)比较和分析测定的序列与载体序列相似性，在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中用BLASTN检索相似的水稻基因组序列。三、实验结果1、Genomewalking扩增获得了5'端外源插入载体的旁侧序列釆用Genomewalking扩增获得了科丰6号水稻外源插入载体的5'端旁侧，见图2。5'端旁侧序列全长为1346bp，其中含有345bp的水稻基因组序列，位于水稻4号染色体(GenBank登记号AP008210)的33048719-33049063;10bp的fillerDNA，来源于整合过程中的DNA修复序列；991bp的转化载体pCUBAC-HYG部分序列。具体的转基因水稻品系科丰6号的5'端外源插入载体的旁侧序列的信息见SEQIDNO1。2、LD-PCR扩增获得了3'端外源插入载体的旁侧序列采用LD-PCR扩增获得了科丰6号水稻3'端外源插入载体的旁侧序列，见图3。3(端旁侧序列全长为1867bp，其中含有1182bp的转化载体pCUBAC-HYG部分序列；685bp的水稻基因组序列，位于水稻4号染色体(GenBank登记号AP008210)的33049063-33049747位。具体的转基因水稻品系科丰6号的3'端外源插入载体的旁侧序列的信息见SEQIDNO2。实施例2基于转基因水稻品系科丰6号的外源插入片段旁侧序列的定性PCR检测方法一、实验材料1、植物材料转基因水稻转基因水稻品系科丰6号。常规水稻明恢86。2、酶与试剂分子生物学试剂，如dNTPs、TaqDNA聚合酶、DL2000Marker购自大连宝生物生物工程有限公司。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。3、实验仪器PCR扩增仪EppendorfMastercyclegradient(Eppendorfco.)核酸电泳仪DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)DNA电泳分析系统KodakEDAS2卯(Kodakco.)其它仪器包括离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。二、实验方法和过程1、植物基因组DNA提取与检测见实施例1中的"植物基因组DNA提取与检测"2、基于5'端和3'端旁侧序列的品系特异性PCR检测根据实施例1中测定的5'端和3'端旁侧序列，分别在其水稻基因组序列部分和转化载体序列部分设计引物，见表8。PCR扩增结果表明，转基因水稻品系科丰6号的5'端和3'端扩增引物组合分别得到了预期的476bp和393bp的扩增片段，而对照明恢86号均没有相应的扩增片段，见图4和图5。表8科丰6号品系特异性PCR检测引物<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>附序列表<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>961GTTGATACCGATATTGAAGGGTCTTCTGTACAAGGTGGAAGACAAGGTTCTGTAGACACC丄021CTGACCTAGTTGAGCAACGATACGTTGTTGTGGAGCGGCGTTTCCCATAGTTCCATAGAG-1081AGGAAAGGTAAACTCGGGCCCGCTGAATCCAACTGGAGAGGCCATGATCTGGTGTCCAGA二141CCAGTAATACTCTCCTCTGTGAGCATCGGTGTAGATAGTTATGTTGCAACCAACCTAGGA1201GTAGTAGAGAAAAACGGGGAAAACGCCGCTGCTGGCTGCTGCTTCGGTGTTCCACCGCAAAGCCGAGCGGTGCGAGCGATTTCGCGAGGCGCGCGCGACGCGGGAGGCAAAAGAACGTGA丄32丄GAAACGCAGCGCGATCGCGTCCCCGCCCGCACGATGGTTGGACGGATGGCGGGGCGGACG1381CTGTGCGCCAACGCGACGACGGAGCGCGATCACGAGTGAGAGGAGAGGAGAGGCTGCAAC—丄441TTGCGTAGCGCCTTGATGAATGCGGGGGAGAGGAGGCGTAAACGCGGGGCATGATTGCGG二[)OlTGATATCTGCGGCGCACCAAGTCTCGTGACGTAATTTATAGCCAGATTTGGTGCACGCCT:561TGTACCAAAGCACCCCCATTAATCCCACCCCCACTGTCTTCGCCTGTTCCGTGCTGCAAG1621TACCACCCATTTTCGGGGGTCTACATTAATCACGTGTTTAGTTATCACCCACAAAGCCACAACCAAAATTAAGTAAGCTGTGGCATTTATAAAAGTGTGACGAATAAATTGTTAATCATA1741AAATGGGGTAAAATTAAATATATGATATATGGGACATCTATTAAAAATGTGTAACAGGTC丄801ATAATATAAACCAAATACACGTCTAGCAAACTGTGACAGCTAAAAATGGGAAGTGGCAAA1861GTGTTCA权利要求1.一种转基因水稻品系科丰6号的外源插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列为5’端旁侧序列，其特征在于5’端旁侧序列如SEQIDNO1所示。2.—种转基因水稻品系科丰6号的外源插入片段的旁侧序列，所述旁侧序列为3'端旁侧序列，其特征在于3'端旁侧序列如SEQIDN02所示。3.权利要求1所述的旁侧序列的制备方法，是通过Genomewalking扩增得到。4.权利要求2所述的旁侧序列的制备方法，是通过LD-PCR扩增得到。5.转基因水稻品系科丰6号的外源插入片段的旁侧序列的定性PCR检测方法，其特征在于所述PCR反应中的两条引物组合为权利要求1所述旁侧序列的特异性引物一条引物为依据SEQIDNOl中1-345位序列设计的正向引物，另一条引物为依据SEQIDNO1的346-1346位序列设计的反向引物。6.根据权利要求5所述的检测方法，所述正向弓I物为KF-G2:5'-AGCATGTCACGGTGTCTGTC-3，，所述反向弓I物为CpTI-p2:5'-TCCAGAGTTCATCTTTCTCATCATC-3，。7.转基因水稻品系科丰6号的外源插入片段的旁侧序列的定性PCR检测方法，其特征在于所述PCR反应中的两条引物组合为权利要求2所述旁侧序列的特异性引物一条引物依据SEQIDN02中1-1182位序列设计的正向引物，另一条引物依据SEQIDN02的1183-1867位序列设计的反向引物。8.根据权利要求5所述的检测方法，所述正向序列为1034f:5'-GCAACGATACGTTGTTGTGG-3，，所述反向序歹U为1426r:5'-TCTCCTCTCACTCGTGATCG-3'。全文摘要本发明涉及“一种转基因水稻品系科丰6号的外源插入片段的旁侧序列”，其特征在于5’端旁侧序列如SEQIDNO1所示，3’端旁侧序列如SEQIDNO2所示。利用该旁侧序列作为目的DNA扩增片段建立灵敏、特异性的水稻品系科丰6号的品系特异性定性、定量PCR检测。文档编号C12N15/29GK101240279SQ200710063780公开日2008年8月13日申请日期2007年2月9日优先权日2007年2月9日发明者彭于发,王锡锋,谢家建申请人:中国农业科学院植物保护研究所