紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3及其应用。本发明应用RT-PCR技术从紫花苜蓿基因组中克隆并鉴定了一个新的NAC家族相关基因，命名为MsNAC3，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.11所示，并构建了含有加强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的融合表达载体。本发明应用荧光定量PCR技术分析了MsNAC3基因在紫花苜蓿中的表达模式，以及该基因与逆境胁迫（冷害，盐害，干旱）之间的关系，发现该基因在烟草中过表达可提高转基因烟草植株的抗寒、抗旱和耐盐性，该基因可用于其他单双子叶植物的遗传转化，提高其抗逆性。
【专利说明】紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3及其应用。
【背景技术】
[0002]NAC转录因子(包括NAM、ATAFl/2和⑶C2)是植物特有的一种具有多种调控作用的转录因子，广泛存在与陆生植物中，这类转录因子的主要结构特点是N端为保守的大约150个氨基酸残基的NAC结构域，可以结合DNA和其他蛋白，可以分成从A~E5个保守区；C端则为高度多样性的转录激活调控区，富含丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸等，研究发现有些NAC蛋白的C-端具有蛋白结合活性。目前已有研究表明NAC家族的一些成员在逆境应答网络中起作用。拟南芥中ANAC019、ANAC055和ANAC072受到干旱、高盐以及脱落酸(ABA)的诱导表达，它们能显著提高植株的耐旱能力(Tran et al.，2004)。拟南芥LOVl基因能增强植株的抗冻能力(Yoo et al.，2007)。来自水稻的 SNACl/2 (stress-responsive NAC2)基因受到干旱、高盐、低温、伤以及ABA的诱导表达，其过表达植株耐冷、抗盐并能抵御干旱(Hu et al., 2008) ?过量表达0sNAC6基因的水稻虽然生长慢、产量低，但却显示出对干旱、高盐以及枯萎病的较强抗性(Nakashima et al.，2007)。尽管NAC基因的功能还有待深入研究，但它们在植 物遗传工程方面已展现出了巨大的应用潜力。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3及其应用。
[0004]本发明提供紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3，其具有:
[0005]I) SEQ ID N0.11所示的核苷酸序列；或
[0006]2) SEQ ID N0.11所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或
[0007]3)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
[0008]本发明提供了含有上述基因MsNAC3的表达载体。
[0009]在本发明的一个实施例中，得到的含有基因MsNAC3的表达载体为pBIGFP-MsNAC3。
[0010]该表达载体的构建方法为:以紫花苜蓿叶的总RNA反转录得到的cDNA为模板，进行PCR反应，上游引物序列如SEQ ID N0.7所示，下游引物序列如SEQ ID N0.8所示；
[0011]将RT-PCR扩增产物回收后连接在PMD18-T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5 α菌株，选取阳性克隆进行测序，用XbaI和KpnI进行双酶切，回收目的片段，连接到含有eGFP植物表达载体pBIGFP的XbaI和KpnI位点中，构建得到pBIGFP_MsNAC3。
[0012]含有上述表达载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。
[0013]本发明还提供了含有基因MsNAC3的转化植物细胞。
[0014]本发明提供了 MsNAC3基因在制备转基因植物中的应用。
[0015]优选地，所述的植物为拟南芥、烟草、洋葱、水稻、小麦、玉米、苜蓿、大豆或棉花。[0016]本发明提供了 MsNAC3基因在提高植物抗逆性方面的应用。
[0017]所述的抗逆性是指抗寒、抗旱或耐盐性。
[0018]本发明还提供了克隆紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3的方法，包括以下步骤:
[0019](I)以紫花苜蓿总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链；
[0020](2)以步骤(1)的cDNA为模板进行PCR，回收产物，测序正确的为紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3。
[0021 ] 其中，步骤(1)将紫花苜蓿幼苗放于4°C进行冷胁迫处理之后，取提取紫花苜蓿总RNA,以总RNA为模板，反转合成cDNA第一链。
[0022]其中，步骤(2)的PCR方法中，所用引物序列中上游引物序列如SEQ ID N0.1所示，下游序列如SEQ ID N0.2所示。
[0023]步骤(2)的PCR 反应程序为 940C 3min ；94°C 10s，55。。20s, 72°C lmin，31 个循环；72°C IOmin。
[0024]步骤(2)中，回收扩增产物并将其连接在PMD18-T载体上进行测序。最后用DNAMAN5.2软件分析，MsNAC3基因长度为1041bp，编码331aa。将这个序列输入NCBIblastp中发现，这个基因编码的氨基酸序列与其他NAC家族基因结构高度相似，其N端含有NAC保守结构域，包括A、B、C、D、E5个保守的亚结构域，蛋白C端高度变异。为进一步分析该基因的结构，应用在线软件SOPMA来推测其蛋白的二级结构，结果表明这种蛋白是以无规则卷曲为主，同时含有18.43%的α -螺旋，3.02%的β -转角和14.20%的延伸链等结构。应用ProtScale在线软件来预测其蛋白氨基酸序列的疏水性/亲水性，结果表明，该蛋白为亲水性蛋白。这些数据表明，该基因是一个`新鉴定的NAC家族的基因，本发明将其命名为MsNAC3。
[0025]本发明具有下列优点及有益效果:
[0026]本发明提供了紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3 (核苷酸序列如SEQ ID N0.11所示)及其在作物育种中的应用。该基因不仅受低温和高盐诱导高表达，而且还受干旱和ABA胁迫诱导表达。洋葱表皮亚细胞定位研究表明MsNAC3为核定位基因。先前报道的抗逆基因在功能方面多数具有单一性，而研究发现本发明MsNAC3基因在提高转基因烟草植株的抗寒、抗旱和耐盐性等方面均据有较明显的功效。该基因可用于其他单双子叶植物的遗传转化，显著提高其抗逆性。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1为RT-PCR方法获得MsNAC3的电泳图片，其中M为2000bp Marker，1、2为PCR产物。
[0028]图2为融合表达载体pBIGFP_MsNAC3结构示意图。
[0029]图3为MsNAC3在胁迫诱导后的相对表达。其中，A图为250mMNaCl、10%PEG6000、100 μ mo I.L4ABA和4°C胁迫处理下MsNAC3在叶片中的相对表达量。B图为250mM NaCl,10%PEG6000、100 μ mo I.L4ABA和4°C胁迫处理下MsNAC3在根中的相对表达量。
[0030]图4为MsNAC3基因亚细胞定位照片。其中，A:含MsNAC3_GFP融合基因的转基因烟草在白光下的图片含MsNAC3-GFP融合基因的转基因烟草在紫外光下的图片；C:对照组只含GFP绿色荧光蛋白基因的转基因烟草在白光下的图片；D:对照组只含GFP绿色荧光蛋白基因的转基因烟草在紫外光下的图片。
[0031]图5为逆境胁迫下转MsNAC3基因烟草生长情况，250mM NaCl处理20d后，转基因烟草长势良好，而野生型烟草叶片几乎全部失绿，变为淡黄色。
[0032]图6为逆境胁迫下转MsNAC3基因烟草生长情况，10%PEG处理20d后，转基因烟草长势良好，而野生型烟草叶片几乎全部变为水溃状。
[0033]图7为逆境胁迫下转MsNAC3基因烟草生长情况，4°C处理6d后再进行恢复培养IOd后，转基因烟草植株叶片要明显大于野生型，根系也比野生型发达。
【具体实施方式】
[0034]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0035]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
[0036]实施例1紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3的获得
[0037]1、基因克隆
[0038]本发明根据紫花苜蓿MsNACl (JN099384)序列设计同源引物:
[0039]上游引物:5'— ATGGAAAGAACTCACTTCAATATC — 3' (SEQ ID N0.1)
[0040]下游引物:5'— GAAAAGGTTTTGGGCAAGTAC — 3' (SEQ ID N0.2)
[0041]实验前4h将苜蓿幼 苗放在4°C进行冷胁迫处理。取幼嫩紫花苜蓿叶片，提取总RNA,总RNA的提取用的是TaKaRa RNAiso Plus，然后以紫花苜蓿总RNA为模板，以Oligod(T)为引物进行反转录反应,反应体系如下:
【权利要求】
1.一种紫花苜蓿逆境响应基因，其为MSNAC3，具有: 1)SEQ ID N0.11所示的核苷酸序列；或 2)SEQ ID N0.11所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或 3)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述基因的表达载体。
3.如权利要求2所述的表达载体，其为pBIGFP-MsNAC3。
4.权利要求3所述的表达载体的构建方法，其特征在于，以紫花苜蓿叶的总RNA反转录得到的cDNA为模板，进行PCR反应，上游引物序列如SEQ ID N0.7所示，下游引物序列如SEQ ID N0.8 所示； 将RT-PCR扩增产物回收后连接在pMD18-T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5 α菌株，选取阳性克隆进行测序，用XbaI和KpnI进行双酶切，回收目的片段，连接到含有eGFP植物表达载体pBIGFP的XbaI和KpnI位点中， 构建得到pBIGFP_MsNAC3。
5.含有权利要求2或3所述载体的宿主细胞。
6.权利要求1所述的基因在制备转基因植物中的应用。
7.权利要求1所述的基因在提高植物抗逆性方面的应用。
8.一种获得权利要求1所述紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3的方法，其特征在于，包括以下步骤: (O以紫花苜蓿总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链； (2)以步骤(1)的cDNA为模板进行PCR，回收产物，测序正确的为紫花苜蓿逆境响应基因 MsNAC3。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)将紫花苜蓿幼苗放于4°C进行冷胁迫处理之后，取提取紫花苜蓿总RNA，以总RNA为模板，反转合成cDNA第一链。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)的PCR方法中，所用弓丨物序列中上游引物序列如SEQ ID N0.1所示,下游序列如SEQ ID N0.2所示。
【文档编号】C12N5/10GK103740731SQ201310718228
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月23日 优先权日:2013年12月23日
【发明者】申玉华, 徐振军, 黄文婕, 唐立红, 林景卫, 李望丰 申请人:申玉华, 徐振军, 黄文婕, 唐立红, 林景卫, 李望丰