紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2及其应用。本发明应用RT-PCR和RACE技术从紫花苜蓿基因组中克隆NAC家族相关基因，命名为MsNAC2，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.11所示，并构建了含有加强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的融合表达载体。本发明应用荧光定量PCR技术分析了该基因在紫花苜蓿中的表达模式，以及该基因与逆境胁迫（冷害，盐害，干旱）之间的关系，发现该基因在烟草中过表达可提高转基因烟草植株的抗寒、抗旱和耐盐性，该基因可用于其他单双子叶植物的遗传转化，提高其抗逆性。
【专利说明】紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2及其应用。
【背景技术】
[0002]NAC转录因子(包括NAM、ATAFl/2和⑶C2)是植物特有的一种具有多种调控作用的转录因子，广泛存在与陆生植物中，这类转录因子的主要结构特点是N端为保守的大约150个氨基酸残基的NAC结构域，可以结合DNA和其他蛋白，可以分成从A~E5个保守区；C端则为高度多样性的转录激活调控区，富含丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸等，研究发现有些NAC蛋白的C-端具有蛋白结合活性。目前已有研究表明NAC家族的一些成员在逆境应答网络中起作用。拟南芥中ANAC019、ANAC055和ANAC072受到干旱、高盐以及脱落酸(ABA)的诱导表达，它们能显著提高植株的耐旱能力(Tran et al.，2004)。拟南芥LOVl基因能增强植株的抗冻能力(Yoo et al.，2007)。来自水稻的 SNACl/2 (stress-responsive NAC2)基因受到干旱、高盐、低温、伤以及ABA的诱导表达，其过表达植株耐冷、抗盐并能抵御干旱(Hu et al., 2008) ?过 量表达0sNAC6基因的水稻虽然生长慢、产量低，但却显示出对干旱、高盐以及枯萎病的较强抗性(Nakashima et al.，2007)。尽管NAC基因的功能还有待深入研究，但它们在植物遗传工程方面已展现出了巨大的应用潜力。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2及其应用。
[0004]本发明提供紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2，其具有:
[0005]I) SEQ ID N0.11所示的核苷酸序列；或
[0006]2) SEQ ID N0.11所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或
[0007]3)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
[0008]本发明提供了含有上述基因MsNAC2的表达载体。
[0009]在本发明的一个实施例中，得到的含有基因MsNAC2的表达载体为pBIGFP-MsNAC2。
[0010]该表达载体的构建方法为:以紫花苜蓿叶的总RNA反转的cDNA为模板，进行PCR反应，引物序列为:
[0011]上游引物:5'-TCTAGAATGATCAGTCGATGGAAACACTTC」3 (SEQ ID N0.13)
[0012]下游引物:5'-GGTACCGACTTGGGCAGATACATAAAGAC-' 3 (SEQ ID N0.14)；
[0013]将RT-PCR扩增产物回收后连接在PMD18-T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5 α菌株，选取阳性克隆进行测序，用XbaI和KpnI将MsNAC2基因从pMD18_T上卸载下来，回收后连接到含有eGFP植物表达载体pBIGFP的XbaI和KpnI位点中，构建得到pBIGFP_MsNAC2。
[0014]含有上述表达载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。
[0015]本发明还提供了含有基因MsNAC2的转化植物细胞。[0016]本发明提供了 MsNAC2基因在制备转基因植物中的应用。
[0017]优选地，所述的植物为拟南芥、烟草、洋葱、水稻或棉花。
[0018]本发明提供了 MsNAC2基因在提高植物抗逆性方面的应用。
[0019]所述的抗逆性是指抗寒、抗旱或耐盐性。
[0020]本发明还提供了克隆紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2的方法，包括以下步骤:
[0021](I)利用RT-PCR方法从紫花苜蓿基因组中扩增获得NAC的保守区片段序列；
[0022](2)根据步骤(1)的保守区序列设计3' RACE引物，然后以紫花苜蓿总RNA为模板，进行3' RACE片段扩增；
[0023](3)设计Y RACE引物扩增Y RACE片段；
[0024](4)用DNAMAN5.2软件将保守区序列，3' RACE片段和Y RACE片段拼接成完整的全基因序列。
[0025]其中，步骤(1)的RT-PCR方法中，所用引物序列为:
[0026]上游引物序列为5' -ACCAAACGGTTCAAGGCCGAACC」3 (SEQ ID NO: 1)，下游序列为 5' -CGATACTCGTGCATGATCCAATTG-' 3 (SEQ ID NO:2)。
[0027]步骤(1)紫花苜蓿的总RNA经反转录后得到cDNA，其PCR反应程序为:94°C预变性5min, (94°C 10s,55°C 20s, 72°C lmin) 30 个循环，72°C IOmin0`[0028]其中，步骤(2)的 3 ' RACE 引物序列为 5 ' -GTTCAAGGCCGAACCGGGCTG-3 ' (SEQID N0:3)。该步骤使用 3' -Full RACE Set Agarose Regular 试剂盒扩增 3' RACE 片段。
[0029]其中，步骤(3)的5'RACE引物5' -AGCCCGGTTCGGCCTTGAACC-3' (SEQ ID NO:4)。该步骤使用5' -Full RACE Set Agarose Regular试剂盒扩增5' RACE片段。
[0030]本发明具有下列优点及有益效果:
[0031]本发明提供了紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2 (核苷酸序列如SEQ ID N0.11所示)及其在作物育种中的应用。该基因不仅受低温和高盐诱导高表达，而且还受干旱和ABA胁迫诱导表达。洋葱表皮亚细胞定位研究表明MsNAC2为核定位基因。先前报道的抗逆基因在功能方面多数具有单一性，而研究发现本发明MsNAC2基因在提高转基因烟草植株的抗寒、抗旱和耐盐性等方面均据有较明显的功效。该基因可用于其他单双子叶植物的遗传转化，显著提高其抗逆性。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1为融合表达载体pBIGFP_MsNAC2结构示意图。
[0033]图2为表达载体pBIGFP结构示意图。
[0034]图3为MsNAC2在胁迫诱导后的相对表达。其中，A图为250mM NaCl胁迫处理下MsNAC2在叶片和根中的相对表达；B图为10%PEG6000胁迫处理下MsNAC2在叶片和根中的相对表达；C图为100 μ M ABA诱导下MsNAC2在叶片和根中的相对表达；D图为4°C处理下MsNAC2在叶片和根中的相对表达。
[0035]图4为MsNAC2基因亚细胞定位照片。其中，A图为含MsNAC2_GFP融合基因的转基因烟草在白光下的图片图为含MsNAC2-GFP融合基因的转基因烟草在紫外光下的图片；C图为对照组只含GFP绿色荧光蛋白基因的转基因烟草在白光下的图片；D图为对照组只含GFP绿色荧光蛋白基因的转基因烟草在紫外光下的图片。[0036]图5为逆境胁迫下转MsNAC2基因烟草生长情况，250mM NaCl处理20d后，转基因烟草长势良好，而野生型烟草叶片几乎全部失绿，变为淡黄色。
[0037]图6为逆境胁迫下转MsNAC2基因烟草生长情况，10%PEG处理20d后，转基因烟草长势良好，而野生型烟草叶片几乎全部变为水溃状。
[0038]图7为逆境胁迫下转MsNAC2基因烟草生长情况，4°C处理6d后再进行恢复培养IOd后，转基因烟草植株叶片要明显大于野生型，根系也比野生型发达。
【具体实施方式】
[0039]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0040]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
[0041]实施例1紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2的获得
[0042]首先根据豆科植物花生NAC转录因子基因AhNAC2和AhNAC3 (EU755023和EU755022 )序列，设计苜蓿NAC基因同源引物，上游引物序列为5 ' -ACCAAACGGTTCAAGGCCGAACC」3 (SEQ ID N0.1)，下游序列为 5' -CGATACTCGTGCATGATCCAATTG-' 3 (SEQ IDN0.2)。然后，利用RT-PCR技术从紫花苜蓿基因组中首先扩增获得NAC的保守区片段序列。
[0043]1、紫花苜蓿总RNA的提取:采用TaKaRa RNAiso Plus提取总RNA。
[0044]2、cDNA第一链的合成:
[0045]反应体系如下:
[0046]
【权利要求】
1.一种紫花苜蓿逆境响应基因，其为MSNAC2，具有: 1)SEQ ID N0.11所示的核苷酸序列；或 2)SEQ ID N0.11所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或 3)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述基因的表达载体。
3.如权利要求2所述的表达载体，其为pBIGFP-MsNAC2。
4.含有权利要求2或3所述载体的宿主细胞。
5.权利要求1所述的基因在制备转基因植物中的应用。
6.权利要求1所述的基因在提高植物抗逆性方面的应用。
7.克隆权利要求1所述紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)利用RT-PCR方法从紫花苜蓿基因组中扩增获得NAC的保守区片段序列； (2)根据步骤(1)的保守区序列设计3，RACE引物，然后以紫花苜蓿总RNA为模板，进行3' RACE片段扩增； (3)设计5'RACE引物扩增5' RACE片段； (4)用软件将保守区序列，3'RACE片段和5' RACE片段拼接成完整的全基因序列，得到紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC2。`
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)的RT-PCR方法中，所用引物序列中上游引物序列如SEQ ID N0.1所示,下游序列如SEQ ID N0.2所示。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)的:TRACE引物序列如SEQ IDN0.3所示。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)的5'RACE引物序列如SEQ IDN0.4所示。
【文档编号】C12N15/29GK103710357SQ201310717761
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月23日 优先权日:2013年12月23日
【发明者】申玉华, 徐振军, 杨晓坡, 林景卫, 李望丰 申请人:申玉华, 徐振军, 杨晓坡, 林景卫, 李望丰