专利名称：利用子叶柄作为外植体的棉花组织培养方法
技术领域：
本发明涉及一种利用子叶柄作为外植体的海岛棉(Gossypium barbadense L.)的组织培养方法，用于产生棉花再生植株。所述棉花组织培养方法也可应用于棉花的遗传转化。
背景技术：
棉花(Gossypium L.)是全球重要的经济作物，是纺织工业中最广泛应用的天然纤维，其在世界范围内的年产量超过1亿包(bales)，价值为450亿美元。利用生物技术来创建棉花新种质，继而选育出性状改良的棉花新品种是现代农业可持续发展的支撑技术。因此，将现代生物技术应用到棉花上的研究受到广泛重视，其中对棉花组织培养的研究是极为重要的方面。组织培养是生物技术的基础，即生物技术能否成功应用于作物的改良取决于作物的再生体系。因此，通过组织培养能否建立棉花高效再生体系，直接关系到利用生物技术进行棉花品种改良的研究。
Skovsted等在1935年首次报道了棉花的胚胎培养，Beasley在1971年从陆地棉(Gossypium hirsutum)胚珠的珠孔端诱导出愈伤组织(Beasley CA etal，Bioscience，1971，21906-907)。然后，1983年Davidonis和Hemilton首次成功的从培养两年的愈伤组织中有效并可重复地获得了再生棉花植株(Davidonis G H and Hamilton RH.Plant Sci Lett，1983，3289-93)。此后，棉花植物从不同的外植体经体细胞胚胎发生获得再生植株，这些外植体包括子叶、胚轴、茎、茎尖、未成熟胚胎、叶柄、叶、根、腋芽、愈伤组织和原生质体等。中国专利CN1163118 C中公开了利用子叶节作为外植体进行组织培养，对10多个陆地棉品种进行了试验，获得了可育的正常再生植株。基于棉花组织培养的遗传转化，如基因枪或农杆菌介导的遗传转化的研究也受到非常的重视，已经使用了包括下胚轴、子叶、下胚轴和子叶产生愈伤组织、未成熟胚胎、叶柄、须根等外植体用于遗传转化的报道。但也存在着转化率低、周期长等缺点，并且这些转化方法高度依赖基因型，许多栽培品种未能成功进行遗传转化。
虽然，棉花通过体细胞胚胎发生获得再生植株的报道很多，但棉花再生能力的强弱仍受到品种基因型的限制，并且培养时间较长，再生植株数量较少，很难从外植体中获得丛生芽，因此获得棉花再生植株的相对成本较高。此外，目前从棉花体细胞再生的研究来看，海岛棉的组织培养工作远远落后于陆地棉，大部分再生成功的研究都是针对陆地棉品种。对于海岛棉的组织培养的研究报道相对较少，且利用的外植体只涉及原生质体、胚轴以及茎尖，其中研究成功的多为茎尖培养(Gould J等，Plant CellRep，1991，1012-16；魏良民，八一农学院学报，1995，18(3)107-108)。但尖茎培养方法的再生体系不利于进行遗传转化，经常会得到嵌合体。最近报道了首次成功地通过体细胞胚胎发生而获得海岛棉的再生植株(Hamidou F等，Crop Sci，2001，411235-1240)。其中的培养过程需要进行悬浮培养，操作过程仍然比较复杂。针对现有技术的不足，迫切需要建立海岛棉的基因型不依赖，再生频率高且培养周期短的棉花组织培养方法。
发明内容
本发明的目的旨在针对现有技术的不足而建立一种对棉花基因型无依赖性的组织培养方法，该方法以棉花子叶柄作为外植体，通过产生丛生芽，能够在较短时间获得大量的再生苗，尤其适合于海岛棉各品种。
本发明的目的是这样实现的一种利用子叶柄作为外植体的棉花组织培养方法，其特征在于包括如下步骤1)对棉花种子进行灭菌处理，于种苗培养基上萌发，培养得到棉花幼苗；2)切取第1)步萌发产生的棉花幼苗的子叶柄作为外植体，将其置于诱导培养基中诱导丛生芽，其中所述的诱导培养基的组成为MS培养基的大量元素、MS培养基的微量元素、MS培养基的有机成分，以及碳源和固化剂，并添加有6-苄基腺嘌呤。
3)切取第2)步产生的丛生芽，置于伸长培养基中，其中所述的伸长培养基为MS培养基中的大量元素、MS培养基的微量元素、MS培养基的有机成分，以及碳源和固化剂，并添加有6-苄基腺嘌呤与赤霉素的激素组合，或者6-苄基腺嘌呤与吲哚-3-乙酸的激素组合。
4)待丛生芽伸长后，将其转移到生根培养基中诱导生根以得到再生苗，或者将伸长的丛生芽直接嫁接到实生苗上。
——所述的棉花是海岛棉，品种是新海15号、新海16号或新海18号。
——所述诱导培养基中添加的6-苄基腺嘌呤含量为1.0-4.0mg/L。
——所述诱导培养基中添加的6-苄基腺嘌呤含量为2.0mg/L或2.5mg/L。
——所述伸长培养基中添加的激素组合为6-苄基腺嘌呤和赤霉素含量分别为1.0-3.0mg/L、1.0-2.0mg/L，或者6-苄基腺嘌呤和吲哚-3-乙酸含量分别为0.2-0.5mg/L、0.5-1.0mg/L；——所述伸长培养基中添加的激素组合为6-苄基腺嘌呤和赤霉素含量分别为2.0mg/L、1.5mg/L，或者6-苄基腺嘌呤和吲哚-3-乙酸含量分别为0.4mg/L、0.5mg/L；——所述伸长培养基中添加的激素组合为6-苄基腺嘌呤和赤霉素含量分别为0.4mg/L、0.5mg/L。
——所述的种苗培养基为1/2MS培养基，其中固化剂为琼脂，用量6g/L。
——所述生根培养基的组成为MS培养基的大量元素、MS培养基的微量元素、MS培养基的有机成分，以及碳源和固化剂，并添加浓度为10mg/L的3-吲哚丁酸作为激素。
——所述MS培养基的大量元素、MS培养基的微量元素、MS培养基的有机成分中各化合物的含量如下组份浓度(1)MS培养基的大量元素NH4NO31650mg/LKNO31900mg/LCaCl2·2H2O 440mg/LMgSO4·7H2O 370mg/LKH2PO4170mg/L(2)MS培养基的微量元素FeSO4·7H2O 27.8mg/LNa2·EDTA·2H2O 37.3mg/LKI 0.83mg/LH3BO36.2mg/LMnSO4·4H2O 22.3mg/LZnSO4·7H2O 8.6mg/LNa2MoO4·2H2O 0.25mg/LCuSO4·5H2O 0.025mg/LCoCl2·6H2O 0.025mg/L(3)MS培养基的有机成分肌醇100mg/L烟酸1.0mg/L盐酸吡哆醇 1.0mg/L盐酸硫胺素 10mg/L甘氨酸 2.0mg/L——将在生根培养基上长出根系的再生苗移栽到温室培养，得到可育的再生植株。
——所述的子叶柄外植体可用于基因枪轰击或农杆菌介导的遗传转化。
本发明方法所用的种苗培养基及生根培养基，没有特别的限制，本领域技术人员可根据现有技术作出合适选择，通常是基于MS培养基，通过增加适当的激素、固化剂和碳源制成。优选地，种苗培养基为1/2MS(即MS培养基的大量元素、微量元素以及有机成分的含量减半)和碳源以及琼脂。生根培养基的优选组份包括MS培养基的大量元素、微量元素以及有机成分，以及碳源和固化剂，并添加适量的3-吲哚丁酸(IBA)和碳源。具体而言，3-吲哚丁酸(IBA)以约10mg/L的含量添加。
对于本发明的组织培养方法所用的各种培养基，其中的碳源通常选自葡萄糖或蔗糖，优选为葡萄糖，添加量为3.0％(30g/L)。固化剂可选用通常使用的凝胶剂，如琼脂和Gelrite。可根据需要添加适量的固化剂，当以Gelrite作固化剂时，添加量通常约0.24％(2.4g/L)。
对于本发明的组织培养方法所用的培养基中，所述由MS培养基的大量元素、微量元素、有机成分组成是指由所述的化合物组成，至于各成分的含量可基于本领域公知的MS培养基中所采用的含量(可参见Murashige&Skoog，1962)，在一定范围内进行适当的变化。优选地，本发明所采用的培养基中的MS培养基的大量元素、微量元素的含量为公知通用MS培养基中所采用的含量。而上述MS培养基的有机成分含的量是参照B5培养基的有机成分含量进行了改良，即除甘氨酸如MS培养基中采用的含量之外，其它的有机成分按B5培养基中采用的含量。因此，本发明优选采用的MS培养基的大量元素、微量元素、有机成分的含量如下表1 本发明所采用的大量元素、微量元素、有机成分的含量组份 浓度(mg/L)(1)MS培养基的大量元素KNO31650mg/LNH4NO31900mg/LCaCl2·2H2O440mg/LMgSO4·7H2O370mg/LKH2PO4170mg/L(2)MS培养基的微量元素FeSO4·7H2O27.8mg/LNa2·EDTA·2H2O37.3mg/LKI0.83mg/LH3BO36.2mg/L
MnSO4·4H2O 22.3mg/LZnSO4·7H2O 8.6mg/LNa2MoO4·2H2O 0.25mg/LCuSO4·5H2O 0.025mg/LCoCl2·6H2O 0.025mg/L(3)改良的MS培养基的有机成分肌醇100mg/L烟酸0.5mg/L盐酸吡哆醇 0.5mg/L盐酸硫胺素 0.1mg/L甘氨酸 2.0mg/L上述各种培养基，均应当调节到适合的pH值范围，优选地pH值约为5.8。培养基的制备方法按常规方法进行，可见于植物组织培养的手册，如李浚明编译，《植物组织培养教程》，中国农业大学出版社，1992年5月第1版。
本发明的组织培养方法，按所述步骤进行所需的具体操作如外植体的切取、丛生芽的切取以及它们的继代培养等，均为本领域技术人员所熟知的常规方法。上述操作通常需要在无菌条件下进行，以保证不受到污染而影响植株的再生。
本发明的组织培养方法中，对棉花种子的灭菌和萌发也是本领域的常规方法。
具体实施例方式
本发明的组织培养方法的具体操作过程描述如下选择健壮的棉花种子，经硫酸脱绒后，用70％乙醇消毒种子表面1分钟，弃去乙醇，再用10％～15％过氧化氢(H2O2)消毒种子3～4小时，无菌水冲洗3～4次，加入无菌水后，置26-28℃的培养室中18～24小时，待种子露白后，在无菌条件下剥去种子种皮，种入种苗培养基中，于28℃暗培养2天后，转移到光下生长，于光照强度为2000lx，光照周期为12小时光照/12小时黑暗的条件下，3～5天后获得无菌苗，即可切取其子叶柄作为外植体。
在无菌条件下，切取上述幼苗的子叶柄，其大小通常为0.3-1.0cm。将切取的外植体置于诱导培养基的培养皿上，于25-28℃，于光照强度2000lx，光照周期12小时光照/12小时黑暗的光照条件下，通常需要培养20～25天，即可从外植体诱导产生丛生芽。若有必要，间隔相应时间后，应进行继代培养，将其转入到新的诱导培养基上，以更好的诱导产生丛生芽。
丛生芽产生之后，需要在伸长培养基上，于相同的培养条件下培养一段时间，通常为10天左右，使丛生芽的茎伸长。可直接将茎伸长的丛生芽嫁接到棉花实生苗上。也可将其转移到生根培养基的培养瓶中，于25-28℃，于光照强度2000lx，光照周期12小时光照/12小时黑暗的光照条件下，约20天后，有20％左右的丛生芽可诱导产生根系。继续培养10天左右使其根系健壮，再移栽于光照温度及湿度适合的温室中培养得到成熟植株，收获产生的种子。
对丛生芽的诱导、伸长以及生根步骤的培养条件，上面描述的均是优选的温度、光照条件，本领域技术人员可以理解的是，在一定范围内变化仍能实施本发明方法。
本发明利用海岛棉的子叶柄作为外植体进行组织培养获得再生植株，建立了高效的棉花再生体系。与选用胚轴、茎尖等外植体通过体细胞胚胎发生或器官发生相比，本发明能够产生丛生的丛生芽，使再生频率大大提高，各品种间无基因型限制、培养周期短、再生植株生长正常，用本发明方法建立海岛棉子叶柄丛生芽再生体系适合于海岛棉品种，具有广泛的适用性。此外，本发明方法还对丛生芽的诱导和伸长及生根等分化和再生步骤所用的培养基进行了改良，并且在丛生芽诱导产生之后，增加了使丛生芽的茎伸长的步骤，因而更利于外植体产生丛生芽及其伸长和生根。根据本发明的组织培养方法，在50-60天内，从一棵实生苗可以获得3-5个再生苗，对于新海18号、16号的再生频率均达到约30％，对于新海15号的再生频率也达到20％。
基于本发明的棉花组织培养方法的上述优点，因此，本发明组织培养方法在应用于棉花的微繁殖、棉花种质的保存等方面，具有显然的优势。尤其是，本发明组织培养方法将十分有利于应用于基因枪轰击或农杆菌介导的遗传转化，基于再生频率的提高而大大提高基因转化的效率，缩短获得转基因植株的周期。
下面结合对3个海岛棉品种的组织培养实例，对本发明作进一步的描述，使本发明更易于理解。这些实施例不能理解为对本发明有任何限制。
实施例1供试品种新海18号，为新疆推广的海岛棉主栽品种，可以从新疆维吾尔自治区的种子管理站获得。
培养基按常规方法配制种苗培养基、诱导培养基、伸长培养基以及生根培养基。它们的具体组分及含量为种苗培养基1/2MS培养基，其中琼脂6g/L，葡萄糖30g/L，培养基的pH值调至5.8。
诱导培养基含表1所示浓度的MS培养基的大量元素、微量元素以及有机成分，并添加2.5mg/L6-BA，葡萄糖30g/L，以及固化剂Gelrite 2.4g/L，培养基的pH值调至5.8。
伸长培养基含表1所示浓度的MS培养基的大量元素、微量元素以及有机成分，并添加6-BA2.0mg/L和GA31.5mg/L，葡萄糖30g/L，以及固化剂Gelrite2.4g/L，培养基的pH值调至5.8。
生根培养基含表1所示浓度的MS培养基的大量元素、微量元素以及有机成分，并添加IBA10mg/L，葡萄糖30g/L，以及固化剂Gelrite2.4g/L，培养基的pH值调至5.8。
实验步骤选择健壮的新海18号棉花种子用硫酸脱绒后，用70％的酒精表面消毒1分钟，然后用10％-15％的过氧化氢消毒3-4小时，无菌水冲洗3-4次，加入无菌水，放在培养室过夜，待种子露白后，在无菌环境下剥去种皮种在种苗培养基中，于28℃暗培养2天后，转移到光下生长，于温度为28℃，光照强度为2000lx，光照周期为12小时光照/12小时黑暗的条件下，3～5天后获得无菌苗。切下0.3-1.0cm大小的子叶柄，放在有诱导培养基的培养皿上，于温度为28℃，光照强度为2000lx，光照周期为12小时光照/12小时黑暗的条件下，培养20～25天，统计产生被诱导产生丛生芽的外植体数目。从外植体上切下丛生芽，放在伸长培养基中，于温度为28℃，光照强度为2000lx，光照周期为12小时光照/12小时黑暗的条件下，培养10天，获得茎伸长的丛生芽。再将茎伸长的丛生芽放在生根培养基上，于光照强度为2000lx，光照周期为12小时光照/12小时黑暗的条件下，培养30天，获得生根的丛生芽。将长出根系的再生苗移栽到温室进行培养。统计实验结果，计算出再生频率(结果如表2所示)。
实施例2供试品种新海16号，为新疆推广的海岛棉主栽品种，可以从新疆维吾尔自治区的种子管理站获得。
如同实施例1，按常规方法制备所需各种培养基，只是诱导培养基的激素即6-BA浓度为2.0mg/L；伸长培养基中的激素及含量为6-BA0.4mg/L和IAA0.5mg/L。按实施例1所述的方法对新海16号棉花种子进行组织培养实验，统计实验结果，计算出再生频率(结果如表2所示)。
实施例3供试品种新海15号，为新疆推广的海岛棉主栽品种，可以从新疆维吾尔自治区的种子管理站获得。
如同实施例1，按常规方法制备所需各种培养基，只是诱导培养基的激素及浓度为6-BA4.0mg/L；伸长培养基中的激素及含量为6-BA0.4mg/L+IAA0.5mg/L。按实施例1所述的方法对新海15号棉花种子进行组织培养实验，统计实验结果，计算出再生频率(结果如表2所示)。
上述对3个海岛棉品种的实施例中，再生频率见如下表2。
表2 不同海岛棉品种子叶柄诱导产生丛生芽的频率
通过本发明的描述，尤其所提供的实施例表明了本发明的优点。本领域技术人员可以根据本发明所述内容进行显而易见的等同变换，如不脱离本发明实质的基础上，对各步骤中的培养条件，培养基的成分在一定范围可作一些调整，但仍然没有超出本发明范围。
权利要求
1.一种利用子叶柄作为外植体的棉花组织培养方法，其特征在于包括如下步骤1)对棉花种子进行灭菌处理，于种苗培养基上萌发，培养得到棉花幼苗；2)切取第1)步萌发产生的棉花幼苗的子叶柄作为外植体，将其置于诱导培养基中诱导丛生芽，其中所述的诱导培养基的组成为MS培养基的大量元素、MS培养基的微量元素、MS培养基的有机成分，以及碳源和固化剂，并添加有6-苄基腺嘌呤。3)切取第2)步产生的丛生芽，置于伸长培养基中，其中所述的伸长培养基为MS培养基中的大量元素、MS培养基的微量元素、MS培养基的有机成分，以及碳源和固化剂，并添加有6-苄基腺嘌呤与赤霉素的激素组合，或者6-苄基腺嘌呤与吲哚-3-乙酸的激素组合。4)待丛生芽伸长后，将其转移到生根培养基中诱导生根以得到再生苗，或者将伸长的丛生芽直接嫁接到实生苗上。
2.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于所述的棉花是海岛棉，品种是新海15号、新海16号或新海18号。
3.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于所述诱导培养基中添加的6-苄基腺嘌呤含量为1.0-4.0mg/L。
4.根据权利要求3所述的组织培养方法，其特征在于所述诱导培养基中添加的6-苄基腺嘌呤含量为2.0mg/L或2.5mg/L。
5.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于所述伸长培养基中添加的激素组合为6-苄基腺嘌呤和赤霉素含量分别为1.0-3.0mg/L、1.0-2.0mg/L，或者6-苄基腺嘌呤和吲哚-3-乙酸含量分别为0.2-0.5mg/L、0.5-1.0mg/L；
6.根据权利要求5所述的组织培养方法，其特征在于所述伸长培养基中添加的激素组合为6-苄基腺嘌呤和赤霉素含量分别为2.0mg/L、1.5mg/L，或者6-苄基腺嘌呤和吲哚-3-乙酸含量分别为0.4mg/L、0.5mg/L；
7.根据权利要求5所述的组织培养方法，其特征在于所述伸长培养基中添加的激素组合为6-苄基腺嘌呤和赤霉素含量分别为0.4mg/L、0.5mg/L。
8.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于所述的种苗培养基为1/2MS培养基，其中固化剂为琼脂，用量6g/L。
9.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于所述生根培养基的组成为MS培养基的大量元素、MS培养基的微量元素、MS培养基的有机成分，以及碳源和固化剂，并添加浓度为10mg/L的3-吲哚丁酸作为激素。
10.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于所述MS培养基的大量元素、MS培养基的微量元素、MS培养基的有机成分中各化合物的含量如下组份 浓度(1)MS培养基的大量元素NH4NO31650mg/LKNO31900mg/LCaCl2·2H2O440mg/LMgSO4·7H2O370mg/LKH2PO4170mg/L(2)MS培养基的微量元素FeSO4·7H2O27.8mg/LNa2·EDTA·2H2O37.3mg/LKI0.83mg/LH3BO36.2mg/LMnSO4·4H2O22.3mg/LZnSO4·7H2O8.6mg/LNa2MoO4·2H2O 0.25mg/LCuSO4·5H2O0.025mg/LCoCl2·6H2O0.025mg/L(3)MS培养基的有机成分肌醇 100mg/L烟酸 1.0mg/L盐酸吡哆醇 1.0mg/L盐酸硫胺素 10mg/L甘氨酸 2.0mg/L
11.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于将在生根培养基上长出根系的再生苗移栽到温室培养，得到可育的再生植株。
12.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于所述的子叶柄外植体可用于基因枪轰击或农杆菌介导的遗传转化。
全文摘要
本发明涉及利用海岛棉(G.barbadense L.)子叶柄作为外植体经组织培养获得再生植株的方法。海岛棉种子经消毒处理，置于种苗培养基上进行种子萌发，切下子叶柄，将其放在诱导培养基中，待丛生芽长大后切下再放在伸长培养基中使其伸长，然后转移到生根培养基中，长出根系得到再生苗。本发明的方法可产生丛生的丛生芽，各品种间无基因型限制、培养周期短、再生植株生长正常。用本发明方法建立的海岛棉子叶柄丛生芽再生体系适合于各种海岛棉品种。
文档编号A01H4/00GK1666600SQ20051003372
公开日2005年9月14日 申请日期2005年3月25日 优先权日2005年3月25日
发明者张玉高, 王冬梅, 杨克锐, 黄全生, 万旭中, 孟庆玉, 丁志强, 危晓薇, 刘霞, 黄乐平 申请人:新疆溢达农业科技有限公司