一种华重楼植株的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明公开了一种华重楼植株的快速繁殖方法，该方法包括愈伤组织的诱导、不定芽的分化、生根培养及炼苗和移栽步骤，所采用的不定芽的诱导和快速增殖培养基为MS＋6-BA?1.0～4.0mg·L-1＋IAA0.1～1.0mg·L-1＋KT?0.1～1.0mg·L-1+头孢曲松钠200～500mg·L-1，生根培养基为1/2MS＋IBA?0.1～1.0mg·L-1+NAA0.1～0.5mg·L-1+活性碳0.1～1.0%。本发明首次在华重楼愈伤组织诱导的基础上,进一步提出了其不定芽的诱导与快速增殖、无根苗生根及炼苗和移栽等方法，为华重楼优良品种的培育和组培苗的大量快速繁殖提供了一条新途径，可实现华重楼植物在短时间和低成本条件下大批量生产。
【专利说明】一种华重楼植株的快速繁殖方法【技术领域】
[0001]本发明涉及一种快速获得华重楼组培苗的方法，特别是涉及一种华重楼植株的快速繁殖方法。
【背景技术】
[0002]中国药典规定的中药重楼为漠重楼(Paris polyphylla var.yunnanensis)和华重楼(Paris polyphylla var.chinensis)的地下莖,前者主产于云南,后者主产于四川。《神农本草经》最早记载的蚤休即华重楼。重楼具有清热解毒、消炎止痛、活血化淤、凉肝定惊的功效。
[0003]近年来因其发现具有抗病毒、抗肿瘤作用而需求量大增。从20世纪80年代以来，重楼已成为西部药用植物中最具代表性和全局影响力的药用植物资源之一。但重楼中药材历来主要以采收野生资源提供药用，由于长期对野生资源地过度采挖，也造成了目前华重楼植物资源几乎处于濒临灭绝的边缘。因而大力开发重楼植物资源具有十分重要的意义。
[0004]目前制约重楼植物规模化栽种的主要问题是重楼种苗的短缺。重楼种子由于存在种胚发育不完全，胚乳坚硬，胚轴后熟等明显“双重休眠”特性，因此播种后通常需要经历两冬一夏才能萌发成苗，是典型的“二年生种子”，而且在自然状态下，即使经过了长时间休目民，重楼种子的出苗率也不高，因此目前仅靠重楼种子进行有性繁殖已无法满足重楼植物大面积栽种的需要。
[0005]组培苗培养是现代生物技术的一项重要内容之一。它是在无菌培养条件下，以植物的离体器官、组织、细胞或原生质体作为外植体，在给予人工培养基和适宜的培养条件下培育出完整植株的过程。开展华重楼植物组培苗培养，可有效地解决其种子繁殖困难的问题。
[0006]目前还未见有在华重楼愈伤组织诱导的基础上，进一步获得华重楼组培苗的报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种华重楼植株的快速繁殖方法，该方法培育的组培苗生长速度快、且保留了华重楼的优良特性。
[0008]本发明提供的华重楼植株的快速繁殖方法包括愈伤组织的诱导、不定芽的诱导和快速增殖、生根培养及炼苗和移栽步骤，
[0009]所述不定芽的诱导和快速增殖步骤是:将华重楼愈伤组织切成I~3cm3大小后接入 MS + 6-BA 1.0 ~4.0mg.L 1 + IAA 0.1 ~1.0mg.L 1 + ΚΤ0.1 ~1.0mg.L1+ 头抱曲松钠200~500mg.L-1的培养基中，在培养温度为4~8°C、每天光照8~12小时、光照强度为1000~15001x的条件下进行培养；
[0010]所述生根培养步骤是:当不定芽长至1.2~3.0cm时，将不定芽连同其基部的愈伤组织一同切下并转接到生根培养基1/2MS + ΙΒΑ0.1~1.0mg.L_1+NAA 0.1~0.5mg.L-1+活性碳0.1~1.0%中，在培养温度为15~22°C、每天光照6~10小时、光照强度为500~1500 Ix的条件下进行培养；
[0011]所述炼苗和移栽步骤是:当组培苗长出第一片心形真叶且不定根生长2~4条以上吋，打开瓶盖，直接将组培苗从培养瓶中取出，洗去其上的培养基后，先将其放入无菌水中栽培3~7天，然后再移栽至松软的土壌中生长。
[0012]所述愈伤组织的诱导可采用目前已公开的方法，如专利号为ZL201110211068.0的发明专利提供的以重楼根茎为外植体的愈伤组织培养方法、以及专利号为ZL201110210590.7的发明专利提供的以重楼芽鞘为外植体的愈伤组织培养方法。 [0013]愈伤组织的诱导也可以采用如下方法:取华重楼植物的根茎，先用流水洗浄后吸干表面的水分，然后切除根茎上的不定根，再在超净工作台上切取带芽体的I~3个茎节，先用0.1%~0.2%升汞消毒6~12min，再用无菌水冲洗3~6次后切除其上的芽体，最后将上述根茎茎节切成0.5~1.5cm3大小后接入MS+6-BA 0.5~2.0mg ?じ1+NAA0.5~2.0mg ?じ1+2，4-D 1.0~3.0mg ?じ1的愈伤组织诱导培养基中，先置于4~10°C的冰箱中低温处理8~18天，再在培养温度为12~25°C、每天光照4~12小时、光照强度为800~1200 Ix的条件下进行培养。
[0014]进ー步的，不定芽的诱导和快速増殖步骤中所采用的愈伤组织为质地紧密且顔色为黄白色或白色的愈伤组织。
[0015]进ー步的，炼苗和移栽步骤中组培苗在无菌水中栽培的温度为10~20°C、每天光照4~7小时、光照强度为300~8001x ;移栽至松软土壤中的培养温度为12~22°C、相对湿度75%~85%、每天光照6~10小时、光照强度为600~12001x。
[0016]上述所有培养基还包括琼脂6.0~7.0g ?じ1和蔗糖30~40g ?じ1，培养基的pH值为5.6~6.5、
[0017]本发明在华重楼愈伤组织诱导的基础上，进ー步提出了其不定芽的诱导与快速増殖、无根苗生根及炼苗和移栽的方法，为华重楼优良品种的培育和组培苗的大量快速繁殖提供了一条新途径，可实现华重楼植物在短时间和低成本条件下大批量生产。
[0018]下面结合实施例对本发明作进ー步详细说明。
【具体实施方式】
[0019]实施例1
[0020](I)外植体的选取和愈伤组织诱导:选取生长健康、无病虫害的华重楼植物的根茎，先用流水洗浄泥土后吸干表面的水分，然后切除根茎上的不定根，再在超净工作台上切取根茎前端带有芽体部分的2个茎节，先用0.1%升汞消毒6min，然后用无菌水冲洗3~4次后切除其上的芽体，最后将该根茎茎节切成0.6cm3大小后接入MS+6-BA0.5mg ?じ1+NAA0.5mg ?じ1+2，4-D1.0mg ?じ1的愈伤组织诱导培养基中，先置于4°C的冰箱中低温处理8天，再转放在培养温度为12°C、每天光照4小时和光照强度为SOOlx的条件下进行培养，培养55天后统计其愈伤组织诱导率为34.18% ；
[0021](2)不定芽的诱导和快速増殖:选取步骤(1)获得的质地紧密、无褐变和玻璃化现象产生、颜色为白色的愈伤组织，将其切成Icm3大小后接入MS + 6-BA 1.0mg ?じ1 + IAA
0.1mg ?じ1 + KT 0.1mg ?じ1+头孢曲松钠200mg ?じ1的培养基中，在培养温度为4°C、每天光照8小时、光照强度为lOOOlx的条件下进行培养，培养60天后统计其不定芽诱导率为 39. 14%，每个愈伤组织上平均产生2个不定芽；
[0022](3)生根培养：当不定芽长至1. 2?1. 4cm时，将不定芽按1个为1组连同其基部 的愈伤组织一同切下并转接到生根培养基1/2MS + IBAO. lmg ? L^+NAAO. lmg ? L^+活性碳 0. 1%中，在培养温度为15°C、每天光照6小时、光照强度为5001x的条件下进行培养，培养 55天后统计其生根率为89. 87% ；
[0023](4)炼苗和移栽：当组培苗长出第一片心形真叶且不定根生长2?3条以上时，打 开瓶盖，直接将组培苗从培养瓶中取出，洗去其上的培养基后，先放在无菌水中，在温度为 10°c、每天光照4小时和光照强度为3001X的条件下栽培3天，然后再移栽至松软土壤中， 在温度为12°C、相对湿度75%、每天光照6小时、光照强度为6001x的条件下培养，组培苗生 长健壮，成活率为94，23% ；
[0024]上述所有培养基的pH值为5. 6、琼脂6. 5g ? L-1和蔗糖30g ? L-1。
[0025]实施例2
[0026](1)外植体的选取和愈伤组织诱导：选取生长健康、无病虫害的华重楼植物的根 茎，先用流水洗净泥土后吸干表面的水分，然后切除根茎上的不定根，再在超净工作台上切 取根茎前端带芽体部分的第1个茎节，先用0. 1%升汞消毒9min，然后用无菌水冲洗5次后 切除根茎上的芽体，最后将该根茎茎节切成1. 0cm3大小后接入MS+6-BA 1. Omg ?L_1+NAA1. 5 mg -L^+2, 4-D1. 5mg -r1的愈伤组织诱导培养基中，先置于6°C的冰箱中低温处理15天，再转 放在培养温度为22°C、每天光照6小时和光照强度为lOOOlx的条件下进行培养，培养55天 后统计其愈伤组织诱导率为40. 38% ；
[0027](2)不定芽的诱导和快速增殖：选取步骤（1)获得的质地紧密、无褐变和玻璃化现 象产生、颜色为黄白色的愈伤组织，将其切成3. 0cm3大小后接入MS + 6-BA3. Omg ? L—1 + IAA0. 5mg ? L-1 + KT0. 5mg ? L^+头孢曲松钠300mg ? L_1的培养基中，在培养温度为6°C、每 天光照10小时、光照强度为12001x的条件下进行诱导培养，培养60天后统计其不定芽诱 导率为50. 45%，每个愈伤组织上平均产生3个不定芽；
[0028](3)生根培养：当不定芽长至1. 5cm时，将不定芽按2个为1组连同其基部的愈伤 组织一同切下并转接到生根培养基1/2MS + IBAO. 5mg ? L^+NAA 0. 3mg ? L^+活性碳0. 5% 中，在培养温度为20°C、每天光照8小时、光照强度为8001x的条件下进行培养，培养55天 后统计其生根率为100% ；
[0029](4)炼苗和移栽：当组培苗长出第一片心形真叶且不定根长出4条以上时，打开 瓶盖，直接将组培苗从培养瓶中取出，先放在无菌水中，在温度为15°C、每天光照6小时和 光照强度为5001x的条件下栽培5天，然后再移栽至松软土壤中，在温度为18°C、相对湿度 80%、每天光照8小时、光照强度为8001x的条件下培养，组培苗生长健壮，成活率为100% ；
[0030]上述所有培养基的pH值为6. 0、琼脂6. 5g ? L—1和蔗糖30g ? L'
[0031]实施例3
[0032](1)外植体的选取和愈伤组织诱导：选取生长健康、无病虫害的华重楼植物的根 茎，先用流水洗净泥土后吸干表面的水分，然后切除根茎上的不定根，再在超净工作台上切 取根茎前端带有芽体部分的3个茎节，先用0. 15%升汞消毒lOmin，然后用无菌水冲洗5? 6次后切除其上的芽体，最后将该根茎茎节切成1. 5cm3大小后接入MS+6-BA 2. Omg -L^+NAA2.0mg ?じ1+2，4-D3.0mg ?じ1的愈伤组织诱导培养基中，先置于10°C的冰箱中低温处理18天，再转放在培养温度为25°C、每天光照12小时和光照强度为12001x的条件下进行培养，培养55天后统计其愈伤组织诱导率为28.18% ；
[0033](2)不定芽的诱导和快速増殖:选取步骤(1)获得的质地紧密、无褐变和玻璃化现象产生、颜色为黄白色的愈伤组织，将其切成3cm3大小后接入MS + 6-BA 4.0mg ?じ1 + IAA1.0mg ?じ1 + KT 1.0mg ?じ1+头孢曲松钠500mg ?じ1的培养基中，在培养温度为8°C、姆天光照12小时、光照强度为15001x的条件下进行培养，培养60天后统计其不定芽诱导率为45.17%，每个愈伤组织上平均产生3个不定芽；
[0034](3)生根培养:当不定芽长至2.5~3.0cm时，将不定芽按3个为I组连同其基部的愈伤组织一同切下并转接到生根培养基1/2MS + IBA1.0mg ?じ1+NAA0.5mg ?じ1+活性碳
1.0%中，在培养温度为22°C、每天光照10小时、光照强度为15001x的条件下进行培养，培养55天后统计其生根率为93.13% ；
[0035](4)炼苗和移栽:当组培苗长出第一片心形真叶且不定根生长4条以上时，打开瓶盖，直接将组培苗从培养瓶中取出，洗去其上的培养基后，先放在无菌水中，在温度为20で、每天光照7小时和光照强度为SOOlx的条件下栽培7天，然后再移栽至松软土壤中，在温度为22°C、相対湿度85%、每天光照10小时、光照强度为12001x的条件下培养，组培苗生长健壮，成活率为91.45%;
[0036]上述所有培养基的pH值为6.5、琼脂7.0g ?じ1和蔗糖40g ?じ1
[0037]实施例4
[0038]将实施例2步骤(2)中所述`的愈伤组织改选为白色的愈伤组织，其它步骤同实施例2，培养60天后统计其不定芽诱导率为40.19%，每个愈伤组织上平均产生2个不定芽；
[0039]实施例5
[0040]将实施例2步骤(2)中所述的黄白色愈伤组织改切成1.0cm3，其它步骤同实施例2，培养60天后统计其不定芽诱导率为39.45%，每个愈伤组织上平均产生I个不定芽；
[0041]实施例6
[0042]将实施例2步骤(2)中所述的培养基改为MS + 6-BA2.0mg ?じ1 + IAA0.5mg ?じ1 +KT0.5mg ?じ1+头孢曲松钠500mg ?じ1，其它步骤同实施例2，培养60天后统计其不定芽诱导率为44.95%，每个愈伤组织上平均产生4个不定芽；
[0043]实施例7
[0044]将实施例2步骤(2)中所述的培养基改为MS + 6-BA4.0mg ?じ1 + IAA1.0mg ?じ1 +KT0.5mg ?じ1+头孢曲松钠200mg ?じ1，其它步骤同实施例2，培养60天后统计其不定芽诱导率为42.62%，每个愈伤组织上平均产生2个不定芽。
[0045]实施例8
[0046]将实施例2步骤(3)中所述的的生根培养基改为1/2MS +IBA0.1mg ?じ1+NAA0.1mg ?じ1+活性碳0.3%，其它步骤同实施例2，培养55天后统计其生根率为91.8%o
[0047]实施例9
[0048]将实施例2步骤(4)中组培苗在无菌水中的培养条件改为温度20°C、每天光照7小时和光照强度为8001x，移栽至松软土壤中的培养条件改为温度25°C、相対湿度75%和每天光照10小时、光照强度为12001X，其它步骤同实施例2，组培苗成活率为92.21%。
[0049]比较实施例1
[0050]将实施例2步骤(1)中所述的“切除根茎上的芽体”取消，其它步骤同实施例2，培养55天后统计其愈伤组织诱导率仅为11.97%。
[0051]比较实施例2
[0052]将实施例2步骤(1)中所述的“先置于6°C的冰箱中低温处理15天”取消，其它步骤同实施例2，培养55天后统计其愈伤组织诱导率仅为28.56%。
[0053]比较实施例3
[0054]将实施例2步骤(2)中所述的培养基改为1/2MS + 6-BA2.0mg ?じ1 +I AA0.5mg ?じ1 + KT0.5mg ?じ1，其它步骤同实施例2，培养60天后统计其不定芽诱导率仅为18.52%，每个愈伤组织上平均产生2个不定芽。
[0055]比较实施例4
[0056]将实施例2步骤(2)中所述的培养条件改为温度为30°C且无光照，其它步骤同实施例2，培养60天后统计其不定芽诱导率为10.12% ；
[0057]比较实施例5
[0058]在实施例2步骤(3)中，改为只将不定芽切下进行生根培养，其它步骤同实施例2，培养55天后统计其生根率仅为24.12%。
[0059]比较实施例6`[0060]将实施例2步骤(3)中所述的生根培养基改为MS + IBA0.5mg ?じ1+NAA0.3mg ?じ1，其它步骤同实施例2，培养55天后统计其生根率仅为35.8%，且产生的不定根向地性较差。
[0061]比较实施例7
[0062]将实施例2步骤(4)中所选取的组培苗改选为还未长出第一片心形真叶、且不定根数少于2条，其它步骤同实施例2 ;组培苗移栽后成活率为30.62%左右。
[0063]比较实施例8
[0064]将实施例2步骤(4)中组培苗在无菌水中培养的环节取消，其它步骤同实施例2 ；组培苗移栽后成活率为56.12%左右。
【权利要求】
1.一种华重楼植株的快速繁殖方法，包括华重楼愈伤组织的诱导步骤，其特征在于还包括如下步骤: 不定芽的诱导和快速增殖:将华重楼愈伤组织切成I~3cm3大小后接入MS +6-BA1.0 ~4.0mg.L 1 + IΑΑ0.1 ~1.0mg.L 1 + ΚΤ0.1 ~1.0mg.L1+ 头抱曲松纳 200 ~500mg -L-1的培养基中，在培养温度为4~8°C、每天光照8~12小时、光照强度为1000~15001x的条件下进行培养； 生根培养:当不定芽长至1.2~3.0cm时，将不定芽连同其基部的愈伤组织一同切下并转接到生根培养基1/2MS + IBA 0.1~1.0mg.I^+NAA0.1~0.5mg.l-1+活性碳0.1~1.0%中，在培养温度为15~22°C、每天光照6~10小时、光照强度为500~15001x的条件下进行培养； 炼苗和移栽:当组培苗长出第一片心形真叶且不定根生长2~4条以上时，打开瓶盖，将组培苗从培养瓶中取出，洗去其上的培养基后，先将其放入无菌水中栽培3~7天，然后再移栽至松软的土壤中生长。
2.根据权利要求1所述的一种华重楼植株的快速繁殖方法，其特征在于所述华重楼愈伤组织的诱导步骤是:取华重楼植物的根茎，先用流水洗净后吸干表面的水分，然后切除根茎上的不定根，再在超净工作台上切取带芽体的I~3个茎节，先用0.1%~0.2%升汞消毒6~12min，再用无菌水冲洗3~6次后切除其上的芽体，接着将上述根茎茎节切成0.5~1.5cm3 大小后接入 MS+6-BA0.5 ~2.0mg.L ^NAA0.5 ~2.0mg.L l+2, 4_D1.0 ~3.0mg *L 1的培养基中，先置于4~10°C 的冰箱中低温处理8~18天，再在培养温度为12~25°C、每天光照4~12小时、光照强度为800~12001x的条件下进行培养。
3.根据权利要求1所述的一种以华重楼植株的快速繁殖方法，其特征在于:不定芽的诱导和快速增殖步骤中所采用的愈伤组织为质地紧密且颜色为黄白色或白色的愈伤组织。
4.根据权利要求1所述的一种以华重楼根茎为外植体的植株快速繁殖方法，其特征在于:炼苗和移栽步骤中组培苗在无菌水中栽培的温度为10~20°C、每天光照4~7小时、光照强度为300~8001x ;移栽至松软土壤中的培养温度为12~22°C、相对湿度75%~85%、每天光照6~10小时、光照强度为600~12001x。
【文档编号】A01H4/00GK103548682SQ201310529238
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月31日 优先权日:2013年10月31日
【发明者】王跃华, 王金鹏, 张珏, 陈燕, 刘银花, 宋超, 段茂华, 任鹏飞, 杨霞 申请人:成都大学