一种白头翁植株再生方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及白头翁的再生方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 白头翁 Pulsatilla chinensis (Bge) Regel 是毛茛科（Ranunculaceae)，白头翁 (Pulsatillae)属多年生草本植物，根入药。主要分布于东北、西北、华北和华东等地。全草 含三萜皂苷，具有镇静、抑制肿瘤细胞、杀菌、杀精、预防爱滋病等功能，治疗老年性痴呆效 果显著，此外，还可作观赏花丼美化环境，用于制造生物农药和除草剂。然而，野生资源的匮 乏严重影响中医临床用药及制药企业的生产，应用组织培养技术缓解这一状况成为迫切需 要。
[0003] 植物离体再生通常是首先形成愈伤组织，然后分化出新的器官或胚，或不经过愈 伤组织而直接发育形成新的器官或胚。然而，离体培养的植物组织有时会进入一种特殊 而稳定的状态，外部形态上，它是一种致密的球形细胞团，彼此独立而又常聚生在一起，称 为分生结节（Meristematic nodule)，合适的条件下可直接再生芽、根、叶状体等植物器 官。目前仅在啤酒花（Humulus lupulus)、杨树（Populus)、桉树（Eucalyptus spp.)、菊苣 (Cichorium intybus)及牡丹（PaeoniaXLemoinei'Golden era'）等植物中研宄较多。但 有关白头翁分生结节途径植株再生的研宄极少，因此，白头翁的植株再生技术对于其在中 医临床及制药中的应用非常关键。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的之一在于提供一种以白头翁的叶片、叶柄为外植体，通过分生结节 途径诱导白头翁植株再生方法，通过诱导的分生结节的组织解剖学的观察证实白头翁的外 植体可通过分生结节途径可进行器官分化和发生体细胞胚。
[0005] 一种白头翁植株再生方法，包括以下步骤：
[0006] 选材：以野生白头翁细嫩的叶片或叶柄为外植体；
[0007] 外植体消毒：流水冲洗后用洗涤剂溶液浸泡，再用自来水冲洗，滤纸吸干水分，在 超净工作台用次氯酸钠溶液浸泡，再用灭菌水淋洗，用灭菌滤纸吸干表面水分，洗涤剂为常 用洗涤剂；
[0008] 不定芽诱导：叶柄切成段，叶片切成块，分别用解剖刀均匀割划至少两刀，并分别 接种到不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导；
[0009] 不定芽增殖：将不定芽均切成小块儿接入增殖培养基中培养6周；
[0010] 生根诱导与移栽：将增殖培养基中白头翁小植株转入生根诱导培养基中进行培 养，然后移栽到基质中。
[0011] 次氯酸钠溶液为1 %的次氯酸钠溶液。
[0012] 次氯酸钠溶液中加入有吐温20。
[0013] 诱导培养基为：MS培养基分别添加不同浓度0?3. Omg ? I71的玉米素（Zeatin)、 激动素（Kinetin)和6-苄氨基嘌呤（e-BAhSOg*!/1的糖，0.8%的琼脂，pH为5.8,吲哚乙 酸（IAA)浓度为0.05mg? L-1。
[0014] 不定芽诱导在24?26°C、16h ? cf1光培养，光照强度4000 y mol ? m 1 ? s下培养。
[0015] 增殖培养基为MS培养基，同时加入浓度为1. 5mg? I71的玉米素和0. 05mg? L的 吲哚乙酸。
[0016] 生根培养基为1/2MS培养基中加入0?3.Omg? I71萘乙酸。
[0017] 基质选用丹麦品氏托普基质珍珠岩按3 : 2配成，并进行高压灭菌。
[0018] 本文所用MS培养基基本组成如表1所示：
[0019] 表1 :MS培养基基本组成表
【主权项】
1. 一种白头翁植株再生方法，其特征在于，包括以下步骤： 选材：以野生白头翁细嫩的叶片或叶柄为外植体； 外植体消毒：流水冲洗后用常用洗涤剂溶液浸泡，再用自来水冲洗，滤纸吸干水分，在 超净工作台用次氯酸钠溶液浸泡，再用灭菌水淋洗，用灭菌滤纸吸干表面水分； 不定芽诱导：叶柄切成段，叶片切成块，分别用解剖刀均匀割划至少两刀，并分别接种 到不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导； 不定芽增殖：将不定芽均切成小块儿接入增殖培养基中培养6周； 生根诱导与移栽：将增殖培养基中白头翁小植株转入生根诱导培养基中进行培养，然 后移栽到基质中。
2. 根据权利要求1所述的白头翁植株再生方法，其特征在于，所述次氯酸钠溶液为1 % 的次氯酸钠溶液。
3. 根据权利要求1所述的白头翁植株再生方法，其特征在于，所述次氯酸钠溶液中加 入吐温20。
4. 根据权利要求1所述的白头翁植株再生方法，其特征在于，所述诱导培养基为： MS培养基添加有浓度为0?3. Omg ? I71的玉米素（Zeatin)或0?3. Omg ? 的激动素 (Kinetin)，同时加有浓度为30g ? L-1的糖和0. 05mg ? L ―1的吲哚乙酸（IAA)、0. 8%的琼脂， pH 为 5. 8。
5. 根据权利要求1所述的白头翁植株再生方法，其特征在于，所述不定芽诱导在24? 26°C、16h ? cf1光照条件下培养，光照强度4000 ymol ? m 1 ? s下培养。
6. 根据权利要求1所述的白头翁植株再生方法，其特征在于，所述增殖培养基为MS培 养基，同时加入浓度为1. 5mg ? I71的玉米素和0. 05mg ? Lh的卩引噪乙酸。
7. 根据权利要求1所述的白头翁植株再生方法，其特征在于，所述生根培养基为1/2MS 培养基中加入〇?3. Omg ? L-1萘乙酸。
8. 根据权利要求1所述的白头翁植株再生方法，其特征在于，所述基质选用丹麦品氏 托普基质珍珠岩按3 : 2配成，并进行高压灭菌。
【专利摘要】本发明提供一种白头翁植株再生方法，步骤为：以野生白头翁细嫩的叶片或叶柄为外植体；流水冲洗后用洗涤剂溶液浸泡，再用自来水冲洗，滤纸吸干水分，在超净工作台用次氯酸钠溶液浸泡，再用灭菌水淋洗，用灭菌滤纸吸干表面水分；叶柄切成段，叶片切成块，分别用解剖刀均匀割划至少两刀，并分别接种到不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导；将不定芽均切成小块儿接入增殖培养基中培养6周；将增殖培养基中白头翁小植株转入生根诱导培养基中进行培养，然后移栽到基质中。白头翁外植体可通过分生结节途径不仅可进行器官分化，而且发生体细胞胚，这对植物离体再生新途径的研究提供了新的理论依据。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104521757
【申请号】CN201410819807
【发明人】廉玉姬, 赵小梅
【申请人】临沂大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月24日