专利名称：以花椰菜小孢子胚为外植体建立高效再生体系的方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种以小孢子胚为外植体建立花椰菜高效再生体系的方法。
背景技术：
花椰菜(Ara1S1Sica oleracea var . botrytis )属十字花科芸薹属植物，其花球营养丰富，除含蛋白质、纤维素和各种矿物质外，还含有多种吲哚衍生物，具有显著的防癌、抗癌功效，越来越受到消费者的青睐，近年来栽培面积迅速扩大，已成为我国的主要蔬菜作物之一。但花椰菜生长期间病虫害严重、不耐贮藏、品质差等问题一直困扰着广大菜农与菜商。因此，对花椰菜品种进行改良势在必行，而常规育种方法已不能满足现代农业对花椰菜品种改良的要求。现代生物技术的发展为人们选育和转化具有优良园艺性状基因的突破性品种提供了可能。然而，国内外关于花椰菜遗传转化的技术还很不成熟，遗传转化率极低，难以适应花椰菜分子育种的要求，其原因在于尚未真正解决并建立起适宜于农杆菌介导的花椰菜高频率植株的再生技术。
前人虽对花椰菜组织培养研究已进行了多方面的探索，通过对不同基因型品种及外植体、不同培养基成分(包括蔗糖浓度和激素配比等)、不同培养条件对愈伤的诱导、增殖及分化再生能力的影响进行了较为系统的研究，也获得了一些高频率的再生体系，但仅限少数几个品种，且每个外植体上再生芽数较少，增殖能力低。另一方面，以上研究大多是以花椰菜的下胚轴和子叶为外植体，截止目前为止，以花椰菜小孢子胚为外植体的相关研究国内外尚未见有报道。小孢子胚是植物小孢子通过分离、纯化和培养后形成的胚状体，其特点是分化能力强，周体都可以再生出不定芽，增殖系数高；其次，小孢子胚周体都可以被农杆菌浸染转化，故有利于外源基因的成功导入；再次，小孢子胚具有遗传背景一致性，大大方便了对转化阳性株表型差异的观察和特异基因的功能研究。但花椰菜小孢子培养一直以来被认为是在芸薹属中最难成功的技术之一。为此，发明人对花椰菜小孢子培养过程中的关键技术进行了创新、改进和完善，突破了花椰菜小孢子培养的技术瓶颈，使诱导成功率达84. 6%，最高每花蕾胚状体产量达112胚，实现了小孢子胚的流水线生产。在此基础上，本研究以花椰菜小孢子胚为外植体，对影响其芽再生的相关因素进行了系统的研究，获得了芽诱导率达100%的再生体系，且每个外植体的芽诱导数为30-50个。该方法既大幅度提高了花椰菜组培的增殖率，又为提高花椰菜遗传转化率提供了一个新的途径，从而为今后的花椰菜基因工程遗传改良奠定了繁苗技术基础。
发明内容
本发明目的是，针对传统花椰菜再生芽诱导以其下胚轴和子叶为外植体，所存在的再生芽数少、增殖能力低，遗传转化率低等的缺陷，提供一种外植体再生芽数多、增殖能力强、遗传背景一致性好，具高效遗传转化潜力的花椰菜高频率植株再生的方法。本发明目的通过以下技术方案来实现。以花椰菜小孢子胚为外植体建立高效再生体系的方法，该方法按如下步骤进行
(1)培养基的配制包括，
1)诱导培养基MS基础培养基 + 2,4-D1. 0-2. O mg/L + ZT O. 5-1. O mg/L + AgNO3
4.0-5. O mg/L + 30 g/L 鹿糖 + 9 g/L 琼脂，pH 5. 8,高温灭菌；
2)分化培养基MS基础培养基+ ZT O. 5-1. Omg/L + BAP1. 0-2. Omg/L + NM O. 05mg/L + AgNO3 4. 0-5. Omg/L + 30g/L 鹿糖 + 9g/L 琼脂，pH 5. 8,高温灭菌；
3)再分化培养基MS基础培养基+AgNO3 4. O mg/L + 30 g/L蔗糖+ 10-11 g/L琼脂，pH 5. 8,闻温灭囷；
4)生根培养基1/2MS基础培养基+ NAA 1.0 mg/L + 30 g/L蔗糖+ 9 g/L琼脂，pH 5. 8,高温灭菌；
(2)花椰菜小孢子胚再生植株的培养
O小孢子胚的选取选取双单倍体材料花蕾分离的小孢子在25-28°C暗培养30-35天获得的发育正常、生长良好的子叶胚，备用；
2)愈伤诱导培养将足够量的子叶胚接种于诱导培养基中，于25-28°C光培养I周至小孢子胚明显膨大并形成浅绿色愈伤组织；
3)愈伤分化培养将愈伤组织转接到分化培养基中，于26-28°C、每天光照16小时条件下培养2-3周至出芽点；
4)愈伤再分化培养将带芽点的愈伤组织转接到再分化培养基中，于26°C、每天光照16小时条件下培养2-3周至出苗成再生苗；
5)生根培养将再生苗移入生根培养基中，于26°C、每天光照16小时条件下培养1-2周至出根。本发明的有益效果是
一、本发明通过植物激素配比、培养基成分、添加剂浓度调试等因素对花椰菜小孢子胚培养影响的比较试验后发现，培养基中添加玉米素O. 5-1. O mg/L后对花椰菜小孢子胚愈伤组织的诱导及不定芽再生具有明显的促进作用，芽诱导率和每外植体芽诱导数分别比对照提高约1.1倍和3. 2倍；同时在培养基中添加4. 0-5. O mg/L AgNO3后可以一定程度减轻褐化现象，褐化率比对照降低10%左右，同时也促进了芽诱导率的提高，比对照提高5%左右。二、本发明利用花椰菜小孢子胚为外植体，采用特定的培养基成分，不同的培养条件对愈伤组织进行诱导、分化，直至植株再生，本发明能得到高达100%的芽诱导率，且平均每个外植体的芽数可达30-50个，比以前报道的花椰菜其它外植体组织的芽诱导数要高1-3 倍。三、本发 明以花椰菜小孢子胚为外植体的高频再生体系的建立，既可大幅度提高花椰菜组培的芽诱导率和增殖率，同时由该法再生的小孢子胚具有遗传背景一致、易被农杆菌浸染转化，有利于外源基因导入等特点，故又为提高花椰菜遗传转化率提供了一个新的途径，从而为今后的花椰菜基因工程的遗传改良奠定了技术基础。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。实施例1 :(花椰菜小孢子胚高频率芽再生的培养方法I)
该方法按如下步骤进行
(1)培养基的配制包括外植体芽再生各阶段的培养基，它们的组分与各组分在每升培养基中所含重量为
1)愈伤诱导培养基MS基础培养基 + 2,4-D 1.0 mg/L + ZT O. 8 mg/L + AgNO3 4.0mg/L + 30g/L鹿糖+ 9g/L琼脂，pH 5. 8,高温灭菌；
2)愈伤分化培养基MS基础培养基 + ZT O. 5 mg/L + BAP 2. O mg/L + NAA O. 05mg/L + AgNO3 4. O mg/L + 30 g/L 鹿糖 + 9 g/L 琼脂，pH 5. 8,高温灭菌；
3)愈伤再分化培养基MS基础培养基+AgNO3 4. O mg/L + 30 g/L蔗糖+ 10 g/L琼脂，pH 5. 8,闻温灭囷；
4)生根培养基1/2MS基础培养基+ NAA I mg/L + 30 g/L蔗糖+ 9 g/L琼脂，pH
5.8,闻温灭囷；
(2)花椰菜小孢子胚再生植株的培养
O小孢子胚的选择选取双单倍体材料花蕾分离的小孢子在26°C暗培养32天获得的发育正常、生长良好的子叶胚200个,备用； 2)愈伤诱导培养愈伤诱导培养基高压灭菌后分装于直径9cm的玻璃培养皿中；将选取的200个小孢子胚从培养液中拣出、无菌滤纸吸干后，放入诱导培养基中，25°C，每天光照16小时，培养I周至胚状体明显膨大并形成浅绿色愈伤组织；
3)愈伤分化培养芽诱导培养基高压灭菌后分装于5X9cm(底X高)圆柱形玻璃瓶中；将愈伤组织转接到芽诱导培养基中，于26°C每天光照16小时条件下培养2-3周至愈伤组织出现可见芽点；
4)愈伤再分化培养愈伤再分化培养基高压灭菌后分装于5X9cm(底X高)圆柱形玻璃瓶中；选取带有绿色芽点的外植体转接到愈伤再分化培养基上，于26°C每天光照16小时条件下培养2-3周至出苗成再生苗；
5)再生植株的生根培养切取萌发有正常生长点的再生植株，插于生根培养基中，于26°C每天光照16小时条件下进行生根培养1-2周至出根；
以花椰菜小孢子胚为外植体，用上述方法进行培养，获得了高达100%的芽诱导率，平均每个外植体的再生芽数为30-50个，且芽长势良好，芽生根率达100%。实施例2 (花椰菜小孢子胚高频率芽再生的培养方法2)
本实施例中，步骤(I)培养基的配制其中，I)愈伤诱导培养基中的2，4-D为1.5 mg/L、ZT 为 1.0 mg/L、AgNO3 为 4. 5 mg/L ;2)愈伤分化培养基中的 ZT 为 0.8 mg/L、BAP 为1. 5 mg/L、AgNO3为4. 5 mg/L ；3)愈伤再分化培养基上中的琼脂为10. 5 g/L ;步骤(2)花椰菜小孢子胚再生植株的培养其中，I)选取的小孢子在25°C暗培养35天后取生长良好的子叶胚180个；2)子叶胚于27°C，每天光照16小时，培养I周；3)愈伤组织于28°C，每天光照16小时，培养2-3周，至出现可见芽点；其余步骤工艺均同于实施例1。实施例3 (花椰菜小孢子胚高频率芽再生的培养方法3)
本实施例中，步骤(I)培养基的配制其中，I)愈伤诱导培养基中的2，4-D为2.0 mg/L、ZTS0.5 mg/L, AgNO3 为 5· O mg/L ;2)愈伤分化培养基中的 ZT 为 1.0 mg/L,BAP 1.0mg/L、AgN03S 5.0 mg/L ;3)愈伤再分化培养基中的琼脂为11 g/L ;步骤(2)花椰菜小孢子胚再生植株的培养其中，I)选取的小孢子在28°C暗培养30天后取生长良好的子叶胚180个；2)子叶胚于28°C，每天光照16小时，培养I周；3)愈伤组织于27°C，每天光照16小时，培养2-3周，至出现可见芽点；其余步骤工艺均同于实施例1。实施例4 (花椰菜小孢子胚高频率芽再生的比较试验)
本实施例中，步骤(I)培养基的配制为1)愈伤诱导培养基中的2，4-D为2.0 mg/L、ZT 为 0-1. 3 mg/L、AgNO3 为 O 与 4. 5 mg/L ;2)愈伤分化培养基中的 ZT 为 0-1.3 mg/L、BAP1. O mg/L、AgNO3为O与4. 5 mg/L ；3)愈伤再分化培养基上中的琼脂为11 g/L ;步骤
(2)花椰菜小孢子胚再生植株的培养其中，I)选取的小孢子在28°C暗培养30天后取生长良好的子叶胚150个；2)子叶胚于28°C，每天光照16小时，培养I周；3)愈伤组织于27°C，每天光照16小时，培养2-3周，至出现可见芽点；其余步骤工艺均同于实施例1。所获结果如表I所示，培养基中添加一定浓度的ZT，可以大幅度提高小孢子胚的愈伤和芽诱导率及每外植体芽诱导数。其中，培养基添加O. 5,0. 8和1. O mg Γ1的ZT均使外植体的愈伤诱导率达到95%以上，约是对照的1. 9倍；芽诱导率均达到94%以上，约是对照的2.1倍；每外植体芽数均达到30个以上，约为对照的4. 2倍。同时，培养基中添加4. 5 mg Γ1的AgNO3可以一定程度减轻褐化现象，褐化率比对照降低10%左右，同时也促进了芽诱导率的提闻，比对照提闻5%左右。表I花椰菜小孢子胚在不同ZT和AgNO3浓度下愈伤和芽的诱导率
权利要求
1.以花椰菜小孢子胚为外植体建立高效再生体系的方法，其特征在于按如下步骤进行 (1)培养基的配制包括，1)诱导培养基MS基础培养基 + 2,4-D1. 0-2. 0 mg/L + ZT 0. 5-1. 0 mg/L + AgN03.4.0-5. 0 mg/L + 30 g/L 鹿糖 + 9 g/L 琼脂，pH 5. 8,高温灭菌； 2)分化培养基MS基础培养基+ ZT 0. 5-1. 0mg/L + BAP1. 0-2. 0mg/L + NM 0. 05mg/L + AgN03 4. 0-5. 0mg/L + 30g/L 鹿糖 + 9g/L 琼脂，pH 5. 8,高温灭菌； 3)再分化培养基MS基础培养基+AgN03 4. 0 mg/L + 30 g/L蔗糖+ 10-11 g/L琼脂，pH 5. 8,闻温灭囷； 4)生根培养基1/2MS基础培养基+ NAA 1.0 mg/L + 30 g/L蔗糖+ 9 g/L琼脂，pH 5. 8,高温灭菌； (2)花椰菜小孢子胚再生植株的培养 1)小孢子胚的选取选取双单倍体材料花蕾分离的小孢子在25-28°C暗培养30-35天获得的发育正常、生长良好的子叶胚，备用； 2)愈伤诱导培养将足够量的子叶胚接种于诱导培养基中，于25-28°C光培养I周至小孢子胚明显膨大并形成浅绿色愈伤组织； 3)愈伤分化培养将愈伤组织转接到分化培养基中，于26-28°C、每天光照16小时条件下培养2-3周至出芽点； 4)愈伤再分化培养将带芽点的愈伤组织转接到再分化培养基中，于26°C、每天光照16小时条件下培养2-3周至出苗成再生苗； 5)生根培养将再生苗移入生根培养基中，于26°C、每天光照16小时条件下培养1-2周至出根。
全文摘要
本发明公开了以花椰菜小孢子胚为外植体建立高效再生体系的方法，属于植物组织培养技术领域。包括培养基的配制和花椰菜小孢子胚再生植株培养等两大步骤。本发明以小孢子胚为外植体，其芽诱导率高达100%，每外植体芽数达30-50个；培养基添加玉米素0.5-1.0mg/L后，芽诱导率和诱导数比对照分别提高1.1倍和3.2倍；添加4.0-5.0mg/LAgNO3后褐化率比对照降低10%左右。该方法既大幅度提高了花椰菜组培的效率，并为提高其遗传转化率提供了新的技术途径。本发明可在花椰菜组培及基因工程遗传改良中推广应用。
文档编号A01H4/00GK103053423SQ20131001392
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月15日 优先权日2013年1月15日
发明者盛小光, 顾宏辉, 赵振卿, 虞慧芳, 王建升, 许映君 申请人:浙江省农业科学院