专利名称：：一种筛选肿瘤遗传分子标记物的方法
技术领域：
：本发明属肿瘤分子遗传学领域，尤其涉及肿瘤遗传分子标记物的筛选。技术背景人体局部组织发生癌变后，在其组织形态学逐步改变的过程中，癌变细胞中会有不同的基因(或基因群)及其表达产物随之产生变化，如果能检测到这些分子构成方面的变化，筛选出与肿瘤遗传相关的分子标记物，则无疑能对肿瘤的早期诊断、预后判断、疗效监测提供巨大帮助。在不同的肿瘤组织中筛选出一些起关键作用的基因或基因群，筛选出用于肿瘤早期诊断、分子分类、疗效检测、预后判断等方面的分子标记物，正是当前肿瘤遗传学上积极探索的问题。
发明内容本发明的目的在于提供一种筛选肿瘤遗传分子标记物的方法。本发明通过以下详细技术方案实现(1)对肿瘤组织标本和非肿瘤组织标本进行显微切割；(2)纯化组织标本，提取纯化组织标本中的RNA;(3)体外转录、线性扩增合成aRNA，aRNA再经逆转录、二轮体外线性扩增制备生物素标记cRNA探针；(4)探针经片段化后与人类全基因组表达谱芯片杂交，信号扫描，输出数据，构建肿瘤纯化组织的基因表达谱；(5)运用weightedvoting算法，使用leave-one-outcross-validation对数据归一化处理，筛选与肿瘤发生、发展过程相关的分子标记物。本发明结合使用基因芯片、显微切割、线性扩增技术，构建并研究不同病理类型、不同临床分期的肿瘤组织中肿瘤基因表达谱，为筛选出不同用途的肿瘤分子标记物和潜在的肿瘤药物作用靶点提供了一种新的方法。同时本发明结合RNA保护以克服组织中RNA降解，采用显微切割以获得纯净的癌细胞，利用线性扩增技术解决了RNA量少问题。并且，结合现代生物信息学技术和统计学分析，从海量信息中去伪存真，通过信息分析、比对，从多种病理类型、不同临床发展阶段肿瘤组织中筛选出起关键作用的基因。图1:本发明的流程示意图。具体实施方式下面以鼻咽癌遗传相关分子标记物的筛选为例，详细说明本发明的具体实施。实施例l:筛选鼻咽癌分子标记物(1)收集、保存、显微切割、纯化鼻咽部组织标本①组织标本的收集保存过程门诊收集鼻咽癌标本和鼻咽炎性上皮组织标本34例。组织标本分为2份，一份固定于10%甲醛溶液中送病理科获得病理诊断书；一份保存于RNAlaterRNAStabilizationReagent。忙存于-20。C用于显微切割、组织RNA提取。具体RNAlaterRNAStabilizationReagent存储组织标本程序为普通1.5ml塑料试管经灭活RNA酶处理，每管预置l~1.5mlRNAlaterRNAStabilizationReagent-20°<:冻存备用，鼻咽部活检组织标本离体后，立刻以生理盐水冲洗血迹，lOmin内浸入到RNAlaterRNAStabilizationReagent中，-20。C冻存。②组织标本的显微切割与纯化过程普通载玻片和染色盒经自来水清洗，双蒸水冲洗后放入0.1%DEPC水中浸泡8小时，随后18(TC干烤3小时，置-2(TC冻存备用。将LeicaCM1800冰冻切片机预冷至-2(TC，RNAlaterRNAStabilizationReagent-20'C冻存组织标本及RNA酶灭活载玻片以冰盒转至冰冻切片机箱。组织块上柱，调整切片刀，将切片控制在1518^im之间，直接贴敷在预制的载玻片上。根据组织切片的大小，每载玻片可以粘贴4~8切片不等。将粘贴好组织切片的载玻片放在位于冰冻切片机箱的预制染色缸中，冰盒转移至实验台，进入下一步组织切片固定、染色试验阶段。无水乙醇中加入DEPC水配制梯度酒精，浓度分别70%、95%和100%。冰盒中取出切片，切片染色顺序如下70%酒精5min—95%酒精2min—无水酒精2min—苏木素染色5min—DEPC水洗3min—70%酒精5min—0.5%伊红酒精溶液染色30s—70%酒精2min—95%酒精2min—无水酒精保存。改良ONO-121ErgonomicJoystickMicromanipulator系统，无菌注射针头作为显微切割刀具，借助移动架协助固定，倒置正像显微镜下首先分辨出癌巢或粘膜柱状上皮区，镜下移动针头，将目标组织块切下，置于无水乙醇中立即转入RNA提取。(2)肿瘤组织标本的RNA提取纯化按照AbsolutelyRNAMicroprepKit说明操作，操作步骤如下显微切割后纯净的组织细胞中，加入0.7P1的0-ME加入到100P1的LysisBuffer,100ul70。/。乙醇，摇匀。加入RNA离心管中，10，000Xg离心3060sec，弃去离心管中液体，加入600u1Low-SaltWashBuffer,lO，OOOXg30~60sec，弃去离心管中液体，离心2min;加入5"1DNaseI，37°C孵育15min;加入500y1High-SaltWashBuffer,10,000Xg离心30-60sec,弃去管中液体；加入600u1Low-SaltWashBuffer,10,000Xg离心30-60see,弃去管中液体；加入300u1Low-SaltWashBuffer,10,000Xg离心2min;取出离心管芯，放入1.5ml新收集管，力Q30u1ElutionBuffer,室温孵育2min;10,000Xg离心lmin，RNA即收集于管中。(3)线性扩增RNA，构建基因表达谱①RNA线性扩增，获得aRNA具体步骤如下RNA与T7Oligo(dT)Primer混合，加水至12ul，70°C10min，加入8ulReverseTranscriptionMasterMix，42。C孵育2h;加入cDNA第二链合成混合试剂，16。C孵育2h;加入250WcDNABindingBuffer,10W去核酸酶水洗提cDNA二次，加水使cDNA溶液总量达16W;室温配制体外转录混合液至总容量40W，37。C孵育14h，加入2WDNaseI，37。C孵育30min，加入60WaRNA洗提溶液使总量达100W;250W乙醇中加入50W预热50XaRNA洗提液10,000Xg离心，先后洗提二次，收集aRNA，取少量电泳、紫外分光光度计检测，余-8(TC冻存。②二轮线性扩增，探针标记，探针与芯片杂交，经扫描后输出数据具体步骤为(l)aRNA逆转录；(2)二轮体外线性扩增合成生物素标记cRNA探针；(3)基因探针片段化；(4)探针与上海博芯H80s芯片杂交，经扫描后GCOS扣除本底信号，计算并输出芯片中全部基因表达数据。本实施例选用了上海博芯H80s芯片，该芯片8464点包含7945个人类已知基因，在同一玻璃片基上构建了上述显微切割，线性扩增的34例样本(1个重复样本)的全基因组表达谱。(4)对数据进行统计学分析，利用weightedvotingclasspredictionmodel筛选鼻咽癌分子标志物。将34例样本的全基因组表达谱数据，即每例样本的7945个基因的表达值汇总成一个数据表，输入GeneCluster软件(2.0版，下载网址http:〃www.broad.mit.edu/cancer/software/genecluster2/gc2.html)。禾U用该软件提供的权重赋值(weightedvoting)算法，采用逐个剔除交叉验证('leave-one-out，crossvalidation)的方法，筛选可以用于鼻咽癌和正常鼻咽上皮分类预测的分子标记。首先筛选出250个在鼻咽癌和正常鼻咽上皮中表达差异最大的基因，然后用这250个基因的基因表达数据对34例样本进行分类预测，再和34例样本的实际分类情况(鼻咽癌或者正常鼻咽上皮)进行比较，判断正确率和统计学P值，随后在这250个基因中，逐个剔除鼻咽癌和正常上皮中表达差异最小的基因，每剔除一个，进行一次分类预测判断，直至最后只剩1个基因。通过以上预测分析结果，发现利用6个基因预测得到的准确性最高，统计学P值最小，这6个基因是鼻咽癌上调基因RB1，STMN1，DSP和下调基因SERPINB6，AGTRL1，SYTL2(参见表1)。表1weightedvoting分类予細的6个基因基因基因信息GeneBankIDUp-regualatedinNPCRBIRetinoblastoma1(includingosteosarcoma)画—000321ST画1Stathmin1/oncoprotein18NM—005563DSPDesmoplakinNM—004415Down-regulatedinNPCSerine(orcysteine)proteinaseinhibitor,cladeBSERPINB6(ovalbumin),member6NM—004568AGTRL1AngiotensinIIreceptor-like1画—005161SYTL2Synaptotagmin-like2NM—032943在这6个鼻咽癌候选的分子标志物中，RB1，STMN1和DSP1在鼻咽癌中表达上调，SERPINB6，AGTRL1和SYTL2在鼻咽癌中表达下调。实施例2:对本发明筛选到的鼻咽癌候选分子标志物加以验证制作含448X2个点阵的鼻咽癌组织微阵列组织微阵列芯片，组织芯片的样本数及组织点数见表2。用芯片，利用免疫组化方法检测RBI蛋白的表达，用原位杂交方法检测SERPINB6、AGTRL1的mRNA的表达。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>总计410(896)具体利用免疫组化检测RBI基因在组织微阵列中的蛋白表达的具体过程为组织微阵列切片经实验前处理后，脱蜡、水化。PBS先，5minX3。组织微阵歹iJ(TMAs)切片入3y。H202中，阻断内源性过氧化物酶，室温30min。PBS洗，5minX3。抗原修复根据所检测蛋白的部位和抗体说明书推荐修复方法，使用微波或酶消化抗原修复。微波抗原修复时，TMAs切片置于0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液中，缓冲液沸腾后，调节至低火档，修复切片20min。酶消化抗原修复时，滴加0.1%胰蛋白酶液于切片，37"C下消化25min。PBS洗，5minX3。滴加300j^1/TMAs片的正常山羊或兔血清封闭，室温30min，甩去多余液体。滴加即用型或浓縮一抗(按抗体说明书按1:50或1:100、1:200不等的比例稀释)300^d/TMAs，保持切片在密封的湿盒中，4T:冰箱内孵育过夜。PBS洗，5minX3。滴加即用型二抗，300|xl/TMAs片，室温(25""C以上)lh。PBS洗，5minX3。DAB显色520min，显微镜下控制染色程度。入双蒸水中止反应，双蒸水冲洗10min。苏木素染复染2min，温水分化。双蒸水冲洗1015min。脱水、透明、TMAs切片胶带转移切片系统专用封片胶封片，胶带转移切片系统配制的紫外线灯下交联lmin。原位杂交检测SERPINB6、AGTRL1基因在组织微阵列中的mRNA表达的具体过程为(1)组织微阵列切片杂交前处理4'C保存的组织微阵列切片置于58'C烤片30min,熔化表面石蜡。二甲苯依次脱蜡3X5min。梯级酒精洗涤，100%酒精2X2min—95%酒精lX5min—70%酒精1X5min—50%酒精1X5min—DEPC水洗涤2X3min—DEPC-PBS洗涤2X5min。滴加300|J胃蛋白酶K(10ng/ml)于切片上，37。C消化20min。切片入PBS(0.1MPBS+2mg/ml谷氨酸)洗涤lmin，中止反应。切片入0.2NHCL，于37'C反应20-30min,增加组织的通透性。切片用4。/。多聚甲醛(0.1MPBS溶解)后固定10min，室温。为了增加组织阳性杂交强度，对切片进行乙酰处理。切片入0.25%乙酸酐BufferI(O.IM三乙醇胺)，室温10min。1MPBS洗涤2X5min。(2)预杂交-20°(:保存的预杂交液，先置于37'C孵育60min，预杂交液的用量为2cmx2cm切片面积50^1，本实验组织微阵列切片组织面规格为6.5cmx2.8cm和6.2cmx2.8cm大小，每一切片预杂交液的用量均用250(_d，相应大小的石蜡膜履盖切片，37'C湿盒中预杂交2小时。(预杂交液成份包括2XSSC，10%Dextransulphate，IXDenhardt，ssolution,50mMPhosphateBuffer(PH7.0)，50mMDTT，250^1，100(xg/mlpolyA，5jxg/mlpolydA，250|xg/mlyeastt-RNA，500pg/mlssDNA，47%Deionizedformamide)。移去石蜡膜，甩掉预杂交液，切片置于2XSSC中5min。(3)杂交反应37'C杂交过夜(18-20h)。每一切片加入250pl杂交液并用石蜡膜履盖。预杂交液中加入相应的探针就成为杂交液。杂交液在预杂交时配制，放置37'C孵育，使探针充分溶解于杂交液中，本实验用多条寡核苷酸探针混合，按每一探针500ng/ml浓度配制成探针杂交液。地高辛加尾标记试剂盒标记探针浓度计算依据每一探针的浓度按其与阳性定量探针时检测反应时显色进行比对和lOOpmol30个碱基的裸探针标记反应理论探针产量为900ng两种标准进行综合计算出标记探针的浓度。杂交后洗涤，切片浸入2XSSC，10min，揭去石蜡膜。依次于摇床上摇动洗涤，2XSSC(0.5%SDS)，2X15min—0.25XSSC(0.5%SDS)，2X15min。(4)杂交后显色检测反应采用Anti-Digoxigenin-POD检测地高辛探针与mRNA结合复合物；TSA放大系统增强原位杂交反应显色反应的阳性信号，DAB显色。切片转至TNT缓冲液中，3X5min。滴加TNB阻断缓冲液，300nl/TMAs，室温，30min。不洗，吸去多余阻断剂，1:100稀释的Anti-Digoxigenin-POD(TBS+0.1%TritonX-100+l%阻断剂)，室温4小时。TNTBuffer(0.1MTris-CL，PH7.5，0.15MNaCL，0.05%Tween20)洗涤，3x5min。切片上滴加信号放大试剂BiotinylTyamid，300(xl/TMAs，(BiotinylTyramid忙存液BiotinylTyramid溶解于0.2mlDMSO，BiotinylTyramid工作液IX稀释液，1:50稀释BiotinylTyramid贮存液)，室温10分钟。TNT洗，3X5min。切片滴加SA-HRP(链霉卵白素-辣根过氧化物酶)，300^1/TMAs,室温30min。TNT洗，3X5min。蒸溜水洗涤，lXlmin。DAB显色，显微镜下控制显色反应。苏木素复染，酒精梯级脱水，切片干燥。滴加组织微阵列切片专用封片胶，相应规格的盖玻片盖片，切片胶带转移系统配备的紫外灯下交联切片lmin。结果显示，RB1蛋白在鼻咽癌组织中表达上调，SERPINB6、AGTRL1的在鼻咽癌组织中mRNA的表达下调(参见表3)，这与用本发明的方法所筛选的RB1为上调基因，SERPINB6、AGTRL1为下调基因的结果相符。表3RB1蛋白、AGTRL1、SERPINB6基因mRNA的表达与鼻咽癌病理形态的关系RB1(阳性率)AGTRL1(阳性率)SERPINB6(阳性率)正常鼻咽上皮57扁(53.80/0)61/81(75.310/0)54/71(76.06%)不典型增生鼻咽上皮56/79(70.9%)39/54(72.22%)30/44(68.18%)鼻咽癌354/396(89.4%)173/343(50.44%)186/337(55.19%)权利要求1.一种筛选肿瘤遗传分子标记物的方法，其特征在于包含以下步骤(1)对肿瘤组织标本和非肿瘤组织标本进行显微切割；(2)纯化组织标本，提取纯化组织标本中的RNA；(3)体外转录、线性扩增合成aRNA，aRNA再经逆转录、二轮体外线性扩增制备生物素标记cRNA探针；(4)探针经片段化后与人类全基因组表达谱芯片杂交，信号扫描，输出数据，构建肿瘤纯化组织的基因表达谱；(5)运用权重赋值算法，逐个剔除交叉验证，对数据归一化处理，筛选与肿瘤发生、发展过程相关的分子标记物。2.如权利要求l所述的方法，其特征在于所述肿瘤为鼻咽癌。全文摘要本发明公开了一种筛选肿瘤遗传分子标记物的方法显微切割肿瘤组织标本；纯化提取RNA，体外转录、线性扩增合成aRNA；逆转录、二轮体外扩增制备生物素标记cRNA探针；探针与人类全基因组表达谱芯片杂交，信号扫描，输出数据，构建肿瘤纯化组织的基因表达谱；运用权重赋值算法，使用逐个剔除交叉验证对数据归一化处理，分析筛选与肿瘤相关的分子标记物。本发明结合使用高通量基因芯片、结合显微切割、线性扩增技术，构建不同病理类型、不同临床分期的肿瘤组织中肿瘤基因表达谱，为筛选不同用途的肿瘤分子标记物和潜在的肿瘤药物作用靶点提供了新的方法。文档编号C12Q1/68GK101245385SQ20081003091公开日2008年8月20日申请日期2008年3月26日优先权日2008年3月26日发明者周艳宏,张文玲,曾朝阳,李小玲,李桂源,炜熊,罗晓敏,范松青申请人:中南大学