专利名称：一种与男性生殖功能障碍相关的精浆微小核糖核酸组合及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种与男性生殖功能障碍相关的精浆微小核糖核酸(microRNA，简称miRNA)组合及其应用。
背景技术：
据WHO统计，不育(孕)夫妇约占育龄夫妇的10% 15%，其中男性因素约占 30% 40% [1’2]。近年来，男性不育的比例呈上升趋势，而人们对优生优育的要求越来越高， 因此为了有效诊断和治疗男性不育，寻找临床价值更高的男性不育标志物迫在眉睫。目前国内临床实验室通过检测精液中精子的密度和活力、精浆生化指标、血液中性激素水平、染色体核型和Y染色体微缺失等方法来判断男性睾丸的生精功能。但目前的临床检测手段对许多无、少精子症的病因无法作出解释和判断，给临床治疗带来了极大的困扰。精液中除精子外，绝大部分是精浆。精浆由附睾、精囊、前列腺、睾丸网及尿道旁腺的分泌物组成，其化学成分中除90 %的水外，还有糖、脂质、蛋白质、肽类激素、胺类、有机酸、有机碱以及无机离子等多种成分。研究表明，相对于正常男性，男性生殖功能障碍患者的精液，特别是精浆中的化学成分往往会发生一定程度的改变。目前开展的常规精浆检测项目包括果糖、α -葡糖苷酶、酸性磷酸酶、锌和肉毒碱以及一些免疫学指标，包括抗精子抗体和抗弓行虫抗体等， 这些检测项目仅有助于诊断有限的几种男性附属性腺功能异常及个别免疫学因素，不能直接反映睾丸的生精功能和全面评价精液质量^。因此亟待找到一种比现有方法更可靠同时又简单易行的新方法来鉴定男性睾丸的生精功能以及判断附属性腺的病理。miRNA是真核生物中一类长约22个核苷酸并参与基因转录后水平调控的非编码单链小核糖核酸分子。miRNA通过与靶mRNA的3’端非翻译序列完全或部分互补结合，导致靶mRNA降解或转录后翻译抑制来调控靶基因的表达M。它们在进化上高度保守，广泛存在于动植物细胞中。近五年来，在人类、小鼠、大鼠等多种生物物种中鉴别出数百种miRNA分子。miRNA存在于几乎每一种组织细胞中，对各种生命过程包括生殖、发育都会产生潜在影响，人体30%的蛋白质编码基因都由miRNA调控[5’6]。睾丸是男性的主要生殖器官，睾丸的精子中也存在miRNA。在各级生精细胞中一些特定的miRNA高度表达，表明这些miRNA参与精子的发生，对精原细胞的增殖和精子生成起着重要作用[h]。因此，对这些miRNA进行研究就有可能寻找到一些与男性生殖功能，特别是与睾丸生精功能密切相关的miRNA作为标志物，进而用于男性生殖功能障碍的临床诊断和预测。
发明内容
本发明的目的是提供一种与男性生殖功能障碍相关的精浆微小核糖核酸组合。本发明的另一个目的是提供上述精浆微小核糖核酸组合的应用。
本发明人发现精浆中能够检测到高表达丰度的miRNA，特别是发现其中一组 miRNA的表达异常与生殖功能有关，例如它们在精浆中的表达水平与睾丸的生精功能密切相关。因此，本发明通过研究男性生殖功能障碍过程中精浆miRNA的特异性变化，筛选出在不育及正常生育状态下表达差异显著的精浆miRNA，通过检测这些miRNA，为诊断男性生殖功能障碍提供新的信息和标志物，对提高男性生殖功能障碍的发现率，病程监控、预后和药效评价过程中的针对性以及疗效都具有积极的意义。本发明的上述目的是采用以下技术方案来实现的一种与男性生殖功能障碍相关的精浆微小核糖核酸组合，该miRNA组合包括下列 miRNA :miR-34c-5p, miR_181a，miR_374b 和 miR-509_5p。所述的精浆微小核糖核酸组合，该miRNA组合还包括miR-146-5p和miR-513a-5p， 进一步，该miRNA组合还包括miR-122。所述的精浆微小核糖核酸组合，其中男性生殖功能障碍是指无精、少精和/或弱 Ib ο所述的精浆微小核糖核酸组合，其中与无精和/或弱精相关的精浆微小核糖核酸组合包括miR-3^-5p，miR-181a, miR_374b和miR-509_5p。进一步地，该组合为 miR-34c-5p, miR-181a, miR-374b, miR-509_5p，miR-122, miR-146_5p 禾口 miR-513a_5p。所述的精浆微小核糖核酸组合，其中与少精相关的精浆微小核糖核酸组合包括 miR-34c-5p，miR-181a, miR-374b 和 miR-509_5p。进一步地，该组合为 miR-34c_5p， miR-181a, miR_374b，miR-509_5p，miR-146_5p 和 miR-513a_5p。上述的精浆微小核糖核酸组合在制备诊断或监测男性生殖功能障碍的试剂中的应用，其中男性生殖功能障碍是指无精、少精和/或弱精。上述miRNA组合的筛选方法包括以下步骤(1)收集生育正常男性以及生殖功能障碍男性的精浆，并提取总RNA ；(2)采用高灵敏度、精确性和高重复性的Solexa测序技术(Solexa sequencing technology)，对上述RNA进行检测，初筛选出生殖功能障碍与正常男性精浆中表达差异显著的一组miRNA ；(3)进一步用适时荧光定量PCR方法验证。具体来说(结合
图1及实施例)，上述筛选方法包括以下步骤(1)分别收集正常生育男性及生殖功能障碍男性的精浆，并提取总RNA，其中所述生殖功能障碍包括无精(非梗阻性)、少精或弱精；( 根据已知的人全部成熟miRNA，对上述RNA进行测序和检测，初筛出生殖功能障碍男性与正常男性精浆中表达差异明显的一组miRNA ； (3)将抽提的RNA逆转录为cDNA，采用荧光定量PCR (TaqMan探针法)方法进一步对初筛出的miRNA进行复筛和验证，挑选出稳定、特异表达的一组miRNA，进行临床价值评估。本发明使用的检测方法可以选自=RT-PCR方法、Solexa测序技术(Solexa sequencing technology) ,Real-time PCR方法以及生物芯片方法中的一种或几种，这些方法是本领域技术人员熟知的方法，采用的试剂均可从商业途径得到。例如，精浆中miRNA分子的检测方法包括以下步骤(1)使用Trizol试剂Gnvitrogen公司)提取精浆总RNA ；(2)通过RNA逆转录反应得到cDNA ；
(3)根据人全部成熟体miRNA设计引物进行PCR反应；(4)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；(5) EB染色后在紫外灯下观察结果。在所述步骤( 之后还可以包括下列步骤用TaqMan探针法检测并比较精浆样本相对于正常男性精浆中miRNA的量的变化。本发明提供了一种用于检测和/或预测男性生殖功能障碍的miRNA组合，其包括下列miRNA的组合
权利要求
1.一种与男性生殖功能障碍相关的精浆微小核糖核酸组合，其特征在于该HiiRNA组合包括下列 miRNA :miR-34c-5p, miR-181a, miR-374b 和 miR-509_5p。
2.根据权利要求1所述的精浆微小核糖核酸组合，该miRNA组合还包括miR-146_5p和 miR-513a_5p0
3.根据权利要求2所述的精浆微小核糖核酸组合，该miRNA组合还包括miR-122。
4.根据权利要求1、2或3所述的精浆微小核糖核酸组合，其特征在于男性生殖功能障碍是指无精、少精和/或弱精。
5.根据权利要求4所述的精浆微小核糖核酸组合，其特征在于与无精或弱精相关的精浆微小核糖核酸组合为 miR-34c-5p，miR_181a，miR_374b，miR-509_5p，miR-122, miR-146-5p 和 miR-513a_5p。
6.根据权利要求4所述的精浆微小核糖核酸组合，其特征在于与少精相关的精浆微小核糖核酸组合包括 miR-34c-5p，miR-181a, miR-374b 和 miR-509_5p。
7.根据权利要求6所述的精浆微小核糖核酸组合，其特征在于与少精相关的精浆微小核糖核酸组合为 miR-34c-5p，miR-181a, miR-374b, miR-509_5p，miR-146_5p 和 miR-513a_5p0
8.权利要求1、2或3所述的精浆微小核糖核酸组合在制备诊断或监测男性生殖功能障碍的试剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于男性生殖功能障碍是指无精、少精和/或弱 冃ο
全文摘要
本发明属于生物技术领域，公开了一种与男性生殖功能障碍相关的精浆微小核糖核酸组合及其应用。该miRNA组合包括下列miRNAmiR-34c-5p，miR-181a，miR-374b和miR-509-5p。该组合可用于制备诊断或监测男性生殖功能障碍的试剂。
文档编号C12N15/113GK102286625SQ201110252889
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月30日 优先权日2011年8月30日
发明者姚兵, 张春妮, 张辰宇, 杨翠华, 王成 申请人:中国人民解放军南京军区南京总医院, 南京大学