一种血瘀证勃起功能障碍动物模型的制作方法

一种血瘀证勃起功能障碍动物模型的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种血瘀证勃起功能障碍动物模型的制作方法，包括如下步骤：S1：将大鼠置于电击设备中，给予持续电刺激；S2：将大鼠置于噪声设备中，给予高频噪声刺激；S3：将大鼠放入冰水混合的游泳设备中，使其冰泳。本发明通过采用电击、噪音和冰泳的复合因素成功地建立了血瘀证ED大鼠模型，避免了采用一种刺激强度较弱，成模时间延长，成模率低等情况，同时避免了单一较弱刺激动物容易出现适应现象的问题。另外，本发明的复合因素实施较为方便，容易定量，将电流和噪音控制在合适的范围内，成模率高。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学和动物行为学领域，涉及一种血瘀证勃起功能障碍动物模型的建 立方法。 一种血瘀证勃起功能障碍动物模型的制作方法

【背景技术】
[0002] 勃起功能障碍（erectile dysfunction, ED，中医称为"阳痿"）是一种常见的男 性疾病，一直以来是泌尿外科及男科的研究热点。在中医病因病机理论中，多认为因情志刺 激影响肝的疏泄功能而使肝郁气滞，或因纵欲房劳、久病体虚而精血亏虚、耗伤肾气，致瘀 血阻络，宗筋气血循行不畅，而发阳痿，其中肝郁和肾虚是最重要的两个基础病机，血瘀则 是阳痿的重要病理因素[李柳骥，严季澜。阳痿病因病机述略。吉林中医药，2011,31(9): 819-821.]。由上病机阐述可见，阳痿病人，尤其是病情严重或久治不愈的病人，多存在血瘀 证候表现。
[0003] 血瘀证动物模型的相关研究已有多年历史，但这些模型多以血液循环障碍与微循 环障碍为特征，仅从机体某一局限性生化、病理等指标变化来反映血瘀这一中医证候，并非 从整体出发，不能反映机体整体情况，模型判断标准也存在一些问题。一个理想的中医证候 模型，应该体现中医学"有诸内必行诸于外"的整体观念，利用动物的生物体表特征来模拟 人体证候的特征[田金洲，王永炎，时晶，等。证候模型研究的思路。北京中医药大学学报， 2005,28(6) :18-21.]。血瘀证在人身上主要以舌暗、有瘀点或瘀斑、舌下静脉曲张、唇痿舌 青、口燥但欲漱水不欲咽、疼痛夜甚或痛处不移、脉微大来迟或涩等为表现特征[时晶，田 金洲，王永炎，等。血瘀证的生物学基础研究。中华中医药杂志，2006,21(6) :363-364.]，在 动物模型上，则体现在动物的舌象、唇象、耳廓、尾尖、眼球、毛皮以及动物行为等方面，主要 表现为舌质色泽紫暗，舌下脉络色泽紫暗，脉络明显增长、增粗，耳廓等部位脉络亦出现相 似改变；进食、饮水及活动减少等。此类能够模拟人体证候特征的动物模型目前有一种报道 [尹军祥，田金洲，王永炎，等。寒凝血瘀证表征模型的建立。北京中医药大学学报，2006， 29 (10) :682-685.]，但无该造模方法导致ED的报道。
[0004] 目前用于ED研究的中医证候动物模型多为肝郁型ED模型[刘林锡，赵秀珍，刘煜 德。勃起功能障碍的中医研究概况。亚太传统医药，2010,6(6) :170-171.]及肾阳虚型ED 模型[樊金卿，孙一鸣，赵兵，等。鹿仲温肾水丸对肾阳虚型勃起功能障碍的研究。中医药 信息，2013 (4) :36-37.]，其它证候ED模型建立较少，至今为止未见血瘀型ED动物模型相关 报道。
[0005] ED的西医治疗主要使用磷酸二酯酶-5抑制剂，总体而言能使65% -70%的患者 成功完成性交[McMahon C G. Erectile dysfunction. Internal medicine journal, 2014, 44(1) :18-26.]。但该类药物的使用存在一些禁忌症，同时也有不同程度的副作用，甚至可 能导致严重的心血管事件发生，且对重度ED合并其它性功能障碍者疗效欠佳。而中医药对 于"久病成瘀"、"久病入络"的慢性疾病治疗存在优势，并能从整体上提高性功能，改善全身 健康状况[刘保兴，陈斌，王琦。论西地那非与中医药治疗勃起功能障碍的优势与不足。北 京中医药大学学报（中医临床版），2004, 2 :004.]，能弥补西药的不足。因此，建立一个合 适、可靠的血瘀证ED模型对于筛选用于血瘀证ED治疗的中药、研究其作用机制及评估其治 疗效果有重要意义
[0006] 相应地，动物模型的制作方法千差万别，动物模型的不同势必导致制作方法的不 同，而且其间通常不具备借鉴意义。现有的肝郁型ED模型的制作方法，通常使用束缚筒束 缚大鼠进行造模，需时50天，并且需要逐步改变束缚时间及束缚强度，操作较为复杂，且存 在束缚强度难以定量，造模时间较长等问题[张立侠，王慧.肝郁证勃起功能障碍大鼠模 型建立的实验研究.中国男科学杂志，2007, 20(11) :29-31.]。虽然有血瘀证的动物模型报 道，但尚未有报道血瘀证ED动物模型。现有的外伤血瘀、热毒血瘀、血虚血瘀等模型多采用 急性造模刺激因素，与ED的慢性发病过程不相符合；气虚血瘀、寒凝血瘀、痰浊血瘀等慢性 刺激模型存在仅在局部刺激、模型仅有生化指标改变而不能产生动物的血瘀证生物表征、 模型不稳定，易逆转等缺点[颜琳琳，周利红，李琦.中医血瘀证动物模型研究概况.中 医杂志，2014, 55 (3) : 255-258.]。


【发明内容】

[0007] 为了解决上述现有技术存在的问题，本发明旨在提供一种血瘀证勃起功能障碍动 物模型的制作方法。
[0008] 本发明所述的血瘀证勃起功能障碍动物模型的制作方法，包括如下步骤：S1 :将 大鼠置于电击设备中，给予持续电刺激；S2 :将大鼠置于噪声设备中，给予高频噪声刺激； S3 :将大鼠放入冰水混合的游泳设备中，使其冰泳。
[0009] 所述步骤S1中的每次电刺激的电流为0. 8-1. 2mA，刺激时间为60-lOOs。
[0010] 所述步骤S1包括每间隔10-20min重复一次电刺激，共刺激6-10次。
[0011] 所述步骤S1包括分别在4-6周的造模周期内的每天的上下午分别进行所述6-10 次电刺激。
[0012] 所述步骤S2中的噪声频率为10000-20000HZ，强度为100-150dB，持续时间为 80-160s〇
[0013] 所述步骤S2包括每间隔10-20min重复一次噪声刺激，共刺激6-10次。
[0014] 所述步骤S2包括分别在4-6周的造模周期内的每天的上下午分别进行所述6-10 次噪声刺激。
[0015] 所述步骤S3中的冰泳时间为5-10min。
[0016] 所述步骤S3包括分别在4-6周的造模周期内的每天的上下午各进行一次冰泳。
[0017] 在所述步骤S3之前和/或之后，给大鼠注射肾上腺素。
[0018] 本发明通过属于强烈的情志刺激的电击，令动物因电击痛楚产生恐惧、抑郁的情 绪；通过属于较弱的情志刺激的噪音，令动物因声音干扰产生烦躁、焦虑的情绪；通过属于 寒凝刺激的冰泳,使动物气血行运不畅，同时亦使动物产生恐惧、抑郁的情绪。通过评价，本 发明提供的方法能够成功地建立了血瘀证ED大鼠模型，通过采用电击、噪音和冰泳的复合 因素，避免了采用单一刺激强度较弱，成模时间延长，成模率低等情况，同时避免了单一较 弱刺激动物容易出现适应现象的问题。另外，本发明的复合因素实施较为方便，容易定量， 例如将电流和噪音控制在合适的范围内，成模率高。而且，肾上腺素属于血管活性药物，具 有缩血管作用，在冰泳前后应用可使血管收缩，加强寒凝刺激产生的脉络瘀阻作用。

【具体实施方式】
[0019] 下面给出本发明的较佳实施例，并予以详细描述。
[0020] 材料与方法
[0021] 实验动物：Sprague Dawley(SD)大鼠，清洁级，由上海交通大学医学院实验动物中 心提供。
[0022] 实验器材：电刺激设备（电击箱：Coulbourn Precision Animal Shocker ;型 号：H13-15 ;通电网：Coulbourn Instruments Habitest Operant Cage, Modular Shock Floor ;型号：H10-11R-TC-SF ;美国），噪声刺激设备（Pyl印rol PT600A Integrated Stereo Amplifier, 300W Powerful Amplifier System, Multi-function Remote Controlled System,型号：PT-600A-0801-0145 ;美国），大鼠游泳桶（高60cm，直径25cm圆柱形塑料 桶），多道生理信号采集处理系统（冊-6240,成都仪器厂）。
[0023] 实验试剂：阿扑吗啡（购自美国Sigma-Aldrich Corporation)，盐酸肾上腺素注 射液（lml :lmg)。
[0024] 饲养环境：清洁级笼盒中饲养，温度18°C_22°C，相对湿度55%-65%，光线自动控 制，明（07:00-19:00)暗（19:00-07:00)交替，自由进食、饮水。
[0025] 造模方法：采用电击+噪音+冰泳复合刺激方法进行血瘀证ED造模，造模周期为 4-6 周。
[0026] 实施例1
[0027] (1)电击：将大鼠置于铺有钢丝网的电击设备中，给予持续电刺激（电流lmA)80s， 每间隔15min重复一次，共刺激8次。每日上下午各进行一次。
[0028] (2)噪声：将大鼠置于密闭的噪声设备中，给予高频噪声刺激（100dB，10000Hz)， 持续80s，每间隔15min重复一次，共刺激8次。每日上下午各进行一次。
[0029] ⑶冰泳：刺激前皮下注射0. 1%盐酸肾上腺素0. 08ml/kg，间隔lh后，将大鼠放 入冰水混合的游泳桶中，游泳桶加水至约桶身2/3高度，并加入约400g碎冰（保持温度为 〇°C )。进行冰泳5min，结束后迅速用干毛巾擦干，冰泳后lh再进行一次肾上腺素注射，剂 量同前。每日上下午各进行一次。
[0030] 实施例2
[0031] (1)电击：将大鼠置于铺有钢丝网的电击设备中，给予持续电刺激（电流 0.8mA) 100s，每间隔10min重复一次，共刺激6次。每日上下午各进行一次。
[0032] (2)噪声：将大鼠置于密闭的噪声设备中，给予高频噪声刺激（100dB，10000Hz)， 持续160s，每间隔10min重复一次，共刺激6次。每日上下午各进行一次。
[0033] (3)冰泳：刺激前皮下注射0· 1 %盐酸肾上腺素0· 05ml/kg，间隔0· 5h后，将大鼠 放入冰水混合的游泳桶中，游泳桶加水至约桶身2/3高度，并加入约400g碎冰。进行冰泳 10min，结束后迅速用干毛巾擦干，冰泳后0. 5h再进行一次肾上腺素注射，剂量同前。每日 上下午各进行一次。
[0034] 实施例3
[0035] (1)电击：将大鼠置于铺有钢丝网的电击设备中，给予持续电刺激（电流 1. 2mA) 60s，每间隔20min重复一次，共刺激10次。每日上下午各进行一次。
[0036] (2)噪声：将大鼠置于密闭的噪声设备中，给予高频噪声刺激（150dB，20000Hz)， 持续80s，每间隔20min重复一次，共刺激10次。每日上下午各进行一次。
[0037] (3)冰泳：刺激前皮下注射0. 1 %盐酸肾上腺素0. lml/kg，间隔1. 5h后，将大鼠 放入冰水混合的游泳桶中，游泳桶加水至约桶身2/3高度，并加入约400g碎冰。进行冰泳 lOmin，结束后迅速用干毛巾擦干，冰泳后1. 5h再进行一次肾上腺素注射，剂量同前。每日 上下午各进行一次。
[0038] 其中应当注意：电流优选为0. 8-1. 2mA，刺激时间优选为60-lOOs。噪声频率优 选为10000-20000HZ，强度优选为100-150dB，持续时间优选为80-160S。冰泳时间优选为 5-10min。其中，电击需能引起大鼠在电网内跑动及惊叫，强度过大，刺激时间过长可导致 大鼠麻痹，局部肢体损伤，影响大鼠一般健康情况。噪声频率需稍低于敏感听阈，在敏感听 阈长期刺激可影响大鼠发情及交配行为，刺激强度及时间不足则影响成模率。冰泳时间过 短则寒凝刺激不足，时间过长如大于lOmin易导致部分大鼠溺死或低体温时间过长，不利 于实验。电击和噪声刺激可交替进行，减少大鼠对刺激的适应。注射肾上腺素可以加强寒 凝刺激产生的脉络瘀阻作用，其剂量根据需要调整，优选为冰泳前后的0. 5h-l. 5h内，注射 〇· 1%盐酸肾上腺素〇· 05-0. lml/kg。
[0039] 模型评价方法：造模刺激结束后禁食不禁水24h，进行评估实验。
[0040] (1)血瘀证生物学表征评估：观察60min大鼠进食、饮水及活动情况，称量体重。 用3%戊巴比妥钠溶液，按0. lml/100g体重剂量腹腔注射麻醉后，观察舌下脉络情况，眼结 膜、耳部、唇周、爪部末梢血液循环等其他特征。舌象包括：（1)舌质色泽紫暗，（2)舌下脉络 色泽紫暗，（3)脉络明显增长、增粗。其他特征包括：（1)耳廓、口唇及爪等部位脉络增粗、增 多或色泽较深，（2)进食、饮水或活动减少，（3)体重减轻。出现2项舌象指标改变，2项其 它特征改变判定为符合血瘀证表征动物。
[0041] (2)勃起功能评估：
[0042] 交配实验：将雄性大鼠和发情的雌性大鼠放在同一笼内，适应环境lOmin后，观察 60min内爬背次数、插入次数。
[0043] 阿扑吗啡阴茎勃起实验：阿扑吗啡颈后皮下注射（5ml/kg)后，观察30min，记录有 无勃起及阴茎勃起次数。
[0044] 阴茎海绵体测压实验：用多通道电生理仪连续监测阴茎海绵体内压30min，记录 最大勃起现象，测量海绵体内压改变。
[0045] 统计学方法：两组间计量资料比较采用Student's t test方法分析，连续观察的 计量资料采用paired t test方法分析，p〈0. 05计为有统计学意义，使用SAS软件进行统 计。
[0046] 通过实现获得如下数据：
[0047] 表1正常对照组大鼠与造模组大鼠体重变化
[0048]

【权利要求】
1. 一种血瘀证勃起功能障碍动物模型的制作方法，其特征在于，所述制作方法包括如 下步骤： 51 :将大鼠置于电击设备中，给予持续电刺激； 52 :将大鼠置于噪声设备中，给予高频噪声刺激； 53 :将大鼠放入冰水混合的游泳设备中，使其冰泳。
2. 根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述步骤S1中的每次电刺激的电流 为0. 8-1. 2mA，刺激时间为60-100s。
3. 根据权利要求2所述的制作方法，其特征在于，所述步骤S1包括每间隔10-20min重 复一次电刺激，共刺激6-10次。
4. 根据权利要求3所述的制作方法，其特征在于，所述步骤S1包括分别在4-6周的造 模周期内的每天的上下午分别进行所述6-10次电刺激。
5. 根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述步骤S2中的噪声频率为 10000-20000HZ，强度为 100-150dB，持续时间为 80-160s。
6. 根据权利要求5所述的制作方法，其特征在于，所述步骤S2包括每间隔10-20min重 复一次噪声刺激，共刺激6-10次。
7. 根据权利要求6所述的制作方法，其特征在于，所述步骤S2包括分别在4-6周的造 模周期内的每天的上下午分别进行所述6-10次噪声刺激。
8. 根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述步骤S3中的冰泳时间为 5_10min〇
9. 根据权利要求8所述的制作方法，其特征在于，所述步骤S3包括分别在4-6周的造 模周期内的每天的上下午各进行一次冰泳。
10. 根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，在所述步骤S3之前和/或之后，给 大鼠注射肾上腺素。
【文档编号】A61B19/00GK104055579SQ201410320952
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年7月4日 优先权日:2014年7月4日
【发明者】戴继灿, 陈翔, 胡超, 崔杰峰 申请人:上海交通大学医学院附属仁济医院