胆固醇酯酶及其核苷酸序列、重组载体、重组宿主细胞及制法和试剂盒的制作方法

专利名称：胆固醇酯酶及其核苷酸序列、重组载体、重组宿主细胞及制法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酶，编码该酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重组载体，包括所述重组载体的重组宿主细胞，从前述重组宿主细胞中纯化该酶的方法，以及包括上述酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。更具体地，本发明涉及一种胆固醇酯酶，编码该胆固醇酯酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重组载体，包括所述重组载体的重组宿主细胞，从前述重组宿主细胞中纯化该酶的方法，以及包括上述胆固醇酯酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。
背景技术：
胆固醇酯酶是催化胆固醇酯水解成胆固醇和脂肪酸的一种酶。它是临床检测血清总胆固醇的重要酶之一。它能够快速准确的检测出血清中总胆固醇的浓度，以用来作为诊断诸如动脉硬化的脂质紊乱疾病，并且，可以用来研究其他诸多临床相关疾病如糖尿病、肾病等。酯化的胆固醇经酶水解后，经胆固醇氧化酶氧化，所产生的H2A与4-氨基安替比林和苯酚反应生成醌亚胺。醌亚胺在505nm有特异吸收，反应产生的颜色强度与胆固醇含量成正比，因此可以用比色法测定胆固醇的量。胆固醇酯酶不仅广泛存在于哺乳动物的胰腺、肝脏、肾上腺等组织中，而且也可以从微生物的发酵产物中提取获得，能产胆固醇酯酶的微生物，例如，假单胞菌O^eudomonas sp·)、产减杆菌(Alcaligenes sp·)、,廉抱菌(Fusarium sp·)、链霉菌(Streptomyces sp.)寸。但是目前的试剂盒所用的胆固醇酯酶存在着耐热性差的缺点，使试剂盒的运输、 保存和使用过程对环境温度要求较高，容易由于胆固醇酯酶的变性而影响到试剂盒测定的有效性和准确性。此外，目前的试剂盒所用的胆固醇酯酶一般用产胆固醇酯酶的假单胞菌进行自然菌种发酵，产量较低，而且天然胆固醇酯酶耐热性差，在分离纯化过程中酶活损失严重。

发明内容
本发明的一个目的是克服现有的胆固醇酯酶耐热性差的缺点，提供一种耐热性好、能在宽的温度范围内保持较高的稳定性和活性的胆固醇酯酶。本发明的第二个目的是提供编码所述胆固醇酯酶的核苷酸序列。本发明的第三个目的是提供包括所述核苷酸序列的重组载体。本发明的第四个目的是提供包括所述重组载体的重组宿主细胞。本发明的第五个目的是提供包括上述胆固醇酯酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。本发明的发明人付出了大量地创造性劳动，利用随机突变的方法，从现有的委内瑞拉链霉菌(Sti^ptomyces venezuelae ATCC 10712)胆固醇酯酶序列得到本发明具有SEQID NO :1所示的氨基酸序列的胆固醇酯酶。并且本发明的发明人意外地发现，所得胆固醇酯酶具有很好的耐热性，能在宽的温度范围内保持较高的稳定性。本发明提供了一种胆固醇酯酶，其中，所述胆固醇酯酶的氨基酸序列为(I)SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，或者(2)对(1)所述的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其胆固醇酯酶的功能不变的氨基酸序列。本发明还提供了编码本发明所述胆固醇酯酶的核苷酸序列。本发明还提供了包括本发明所述核苷酸序列的重组载体。本发明还提供了包括本发明所述重组载体的重组宿主细胞。本发明还提供了包括本发明所述的胆固醇酯酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。本发明提供的胆固醇酯酶具有耐热性好的优点。参见图3可知，本发明的胆固醇酯酶在65°C下于pH6. 0的缓冲液中静置15分钟后仍具有60%的相对活性，明显高于在相同条件下的对比例1的胆固醇酯酶的相对活性(不到20% )。


图1实施例1的COE基因纯化的琼脂糖凝胶鉴定照片；图2实施例1的COE诱导表达与纯化的SDS-PAGE鉴定照片；图3制备实施例1和对比例1-2的胆固醇酯酶热稳定性对比图；图4制备实施例1和对比例1-2的胆固醇酯酶pH稳定性曲线图。
具体实施例方式本发明提供了一种胆固醇酯酶，其中，所述胆固醇酯酶的氨基酸序列为(I)SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，或者(2)对(1)所述的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其胆固醇酯酶的功能不变的氨基酸序列。本领域人员公知，组成蛋白质的20种氨基酸残基，按照侧链极性可以分成四类1、非极性的氨基酸丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、 甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)；2、极性不带电荷的氨基酸甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸 (Cys)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr)；3、带正电荷的氨基酸精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)；4、带负电荷的氨基酸天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(参见“生物化学”(第二版)上册，沈同、王镜岩，第82-83页，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白质中如果发生同属一个类别的氨基酸残基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代lie，所述残基在蛋白质结构域中所起的作用(比如提供正电荷或形成疏水囊袋结构的作用)没有改变，因此对蛋白质的立体结构并不会产生影响，因此仍然可以实现蛋白的功能。例如，本领域技术人员公知，Ala 禾口 Ser、Val 禾口 He、Asp 禾口 Glu、Ser 禾口 Thr、Ala 禾口 Gly、Ala 禾口 Thr、Ser 禾口 Asn、 Ala 禾口 Val、Ser 禾口 Gly、Tyr 禾口 Phe、Ala 禾口 Pro、Lys 禾口 Arg、Asp 禾口 Asn、Leu 禾口 lie、Leu 禾口Val、Ala和Glu以及Asp和Gly，两两之间相互取代，不会影响蛋白的立体结构和功能。所述同属一个类别的氨基酸残基取代可以发生在胆固醇酯酶上的任意一个氨基酸残基位置上。 相反，不同类别的氨基酸残基发生取代，或者氨基酸的取代不符合上述列举的取代规律，很可能会使蛋白的结构发生变化，功能出现差异。本发明提供的胆固醇酯酶还可以进行修饰或突变，得到衍生的蛋白质。本发明所述“衍生的蛋白质”指与具有上述氨基酸序列的胆固醇酯酶存在氨基酸序列上的差异，或者有不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。所述诱导变异体可以通过各种技术得到，如辐射或诱变剂等产生的随机突变，也可以通过如定点突变法或其他已知分子生物学的技术获得。所述“衍生的蛋白质”还包括具有天然 L型氨基酸的残基的类似物(如D型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如 β-氨基酸、Y-氨基酸等)的类似物。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的蛋白的化学衍生形式，如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。优选情况下，所述胆固醇酯酶的氨基酸序列为SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列。本发明还提供了编码本发明所述胆固醇酯酶的核苷酸序列。本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met (ATG)或Trp (TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆， 冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的胆固醇酯酶活性不变的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。相反，利用本文公开的DNA序列，也可以通过本领域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版， 1989)进行，通过修改本发明提供的核酸序列，得到与本发明所述丙酮酸酶活性一致的氨基酸序列。优选情况下，本发明所述核苷酸序列为(1) SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列；或者( 对SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或增加而得到的核苷酸序列，该核苷酸序列编码的胆固醇酯酶功能不变。所述核苷酸序列更优选为SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。本发明提供的核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列和重组工程菌，可以很容易获得模板和引物，利用PCR进行扩增获得有关序列。序列较长时，可以进行两次或多次PCR扩增，然后将所得片段按正确次序拼接。一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核苷酸序列。本发明还提供了包括本发明所述核苷酸序列的重组载体。本领域公知，所述重组载体一般包括空载体和插入该空载体的目的基因，所述目的基因为本发明所述的胆固醇酯酶的核苷酸序列。在本发明中，所述“空载体”(或称“载体”)可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，本发明优选所述空载体为Iac启动子的载体， 更优选自由PUC19、pGEM和pBluescript所组成的组中。所述空载体可以包括多种常用的检测标记(例如荧光标记、抗生素标记等报告基因)和酶切位点。重组载体构建可采用空载体本身多克隆位点的各种核酸内切酶(如对于pUC19，可用Ava I, Sac I、EcoR I、Hind III和BamH I等)进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。本发明优选将质粒PCN51中的假单胞菌复制子基因克隆至pUC19中，再将胆固醇酯酶基因(COE)也克隆至复制子前，构建成能够在假单胞菌中复制和表达的载体。本发明还提供了包括本发明所述重组载体的重组宿主细胞。可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞中， 如氯化钙法化学转化、高压电击转化，优选电击转化；所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为大肠杆菌、枯草杆菌、酵母(如毕赤酵母)或各种动植物细胞，更优选所述宿主细胞为本领域常用的基因工程菌，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、恶臭假单胞菌或毕赤酵母。更优选所述宿主细胞为大肠杆菌JM109和/或恶臭假单胞菌。最优选所述宿主细胞为恶臭假单胞菌，并且其培养基优选为0. 03-0. 3 %的磷酸二氢钾、0. 1-1 %的磷酸氢二钠、0. 05-0. 5 %的氯化铵、0. 01-0. 1 %的硫酸镁、0. 5-5 %的酵母粉、0. 1-1 %的蛋白胨、0. 001-0. 05%的葡萄糖、2. 5% -10%的甘油、0. -0. 8%的乳糖、0. 1-2%的油酸、 0. 1-1%的卵磷脂，并且调节PH至6. 8。可以使用本领域常用的方法从重组宿主细胞中分离和纯化胆固醇酯酶。例如，离心分离培养基和重组宿主细胞，高压勻浆破碎细胞、离心过滤去除细胞碎片，亲和层析纯化胆固醇酯酶。对于分离纯化所得的胆固醇酯酶的产物，可以使用本领域常用的方法进行纯度鉴定。例如，考马斯亮蓝法、凯氏定氮法、双缩脲法、Iowry法、紫外吸收法、亲和层析、酶活性、抗原抗体法、电泳分析(例如十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)、沉降分析、扩散分析、恒溶度法、蛋白质谱等。此外由于本发明的胆固醇酯酶耐热性好，因此可以采用将重组细胞破碎液在45-65°C加热15-40分钟，然后在8000-15000rpm离心10_20min，来除去不耐热的杂蛋白。优选地，采用将重组细胞破碎液在加热30min，IOOOOrpm离心15min， 来除去大部分不耐热的杂蛋白。本发明还提供了包括本发明所述的胆固醇酯酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。优选情况下，本发明的试剂盒包括胆固醇酯酶，而不包括核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞。更优选本发明的试剂盒包括胆固醇酯酶的干粉，而不包括核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞。可以用本领域常用的方法制备胆固醇酯酶的干粉，只要该方法能够得到胆固醇酯酶的干粉，并且不破坏胆固醇酯酶的干粉的活性即可。例如使用真空减压浓缩器得到浓缩的酶液，然后使用冷冻干燥机干燥浓缩的酶液；或者使用真空减压干燥器等设备。由于本发明的胆固醇酯酶耐热性好，还可以使用喷雾干燥的技术得到该酶的干粉。胆固醇酯酶的干粉在使用时可以通过溶解于PH5. 0-8. 0的缓冲液体系 (例如醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液，优选PH为5. 5-7. 0)中而转化为液体形式。本发明的试剂盒还可以包括本领域常用于测定血清总胆固醇的试剂盒的成分。对应于本发明的试剂盒中的胆固醇酯酶可以是液体形式或固体干粉形式，本发明的试剂盒中的其他成分也可以是液体形式和/或固体干粉形式。例如，当本发明的试剂盒为液体形式时，一般可以含有0.01-0. 5mol/L pH 6. 5磷酸盐缓冲液、10-1000U/L的胆固醇酯酶、 1000-10000U/L 的过氧化物酶、100-5000U/L 的胆固醇氧化酶、0. 01-10g/L 苯酚、0. 01-lg/L 4-氨基安替比林、0. l-10g/L牛血清白蛋白和0. 5-10g/L曲拉通X-100。本发明的试剂盒优选含有0. 05-0. 2mol/L pH 6. 5的磷酸盐缓冲液、100-300U/L的胆固醇酯酶、2000-5000U/L 的过氧化物酶、500-1000U/L的胆固醇氧化酶、l-10g/L苯酚、0.05-0. lg/L 4-氨基安替比林、0. Ι-lg/L牛血清白蛋白和5-10g/L曲拉通X-IOO0本发明液体形式的试剂盒组分可以通过冷冻干燥技术，结合减压蒸馏技术、反渗透技术及超滤技术等，制备成试剂干粉。所述干粉可以在检测待测标本前用选自去离子水、 蒸馏水和双蒸水的溶剂复溶至所述试剂的原有体积。本发明的试剂盒可以包括记载有上述各种组分使用方法和用量的说明书。因此，所述溶液也可以由使用者在使用前按照试剂盒说明书的记载根据现有技术配制即可。适于使用本发明所述试剂盒的待测标本可以是动物体(包括人体)健康状态下以及病理状态下的血液自然凝固后析出的血清。下面结合实施例进一步说明本发明，除非特别说明本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品。制备实施例1A)现,有胆固醇酉旨Sl COE基因的获f导(即获f导序歹U 3所示 射亥苷Il序歹U )Α-1) Streptomyces venezuelae 的培养配制LB培养基蛋白胨10g/L酵母粉5g/LNaCl:10g/L121°C 20min 灭菌。将冻存管中的Mi^ptomyces venezuelae菌种用接种针接种于LB培养基中，26°C 过夜培养。A-2)基因组DNA的提取取步骤1)获得的过夜培养物，在室温下SOOOrpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于 Iml TEdOmM Tris-HCl, ImM EDTA，pH8.0)中。加入 6 μ 150mg/ml 的溶菌酶，37°C作用 2h， 再加入 2mol/L NaCl 50 μ 1,10% SDS 110 μ 1，20mg/ml 的蛋白酶 K 3yl，50°C作用 15min。 之后将所得菌液分装到IOml离心管中，加等体积的酚氯仿异戊醇05 24 1)，混勻后放置5min。12000rpm离心lOmin，吸取上清。重复抽提两次。在上清中加入0. 6倍体积的异丙醇，混勻，室温放置lOmin。12000rpm离心lOmin，沉淀用75%的乙醇洗涤、凉干后，溶于 50 μ 1 ddH20 中.Α-3)带有天然胆固醇酯酶基因的质粒的获得取步骤2)得到的基因组DNA用Ava I 37°C酶切lh，同时以相同条件酶切质粒 pUC19，65°C水浴放置IOmin灭活内切酶后将两者用纽英伦生物技术有限公司(NEB)的T4 连接酶连接12h，转化大肠杆菌JM109。从转化平板中筛选出具有产胆固醇酯酶能力的克隆，测序并分析出胆固醇酯酶的基因。具体操作如下挑取在LB固体培养基上37°C培养16h的大肠杆菌JM109的单菌落，于液体LB培养基中在37°C、150rpm的摇床再培养16h。取Iml所得液体培养物转接于IOOml新鲜液体 LB培养基中，在37°C摇床上以200-250rpm的转速剧烈振荡培养2.证。吸取1. 5ml培养好的菌液至1. 5ml离心管中，在冰上冷却10分钟后，在4°C、3000g下离心5分钟。弃去上清， 加入100 μ 1在冰上预冷的0. lmol/L的CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打勻，重悬细胞， 在冰放置20分钟。然后在4°C、3000g下离心5分钟，弃去上清，加入100 μ 1在冰上预冷的 0. lmol/L的CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打勻，重悬细胞，得到感受态的宿主细胞大肠杆菌JM109。取200 μ 1上述感受态的大肠杆菌JM109置于1. 5ml离心管中，加入体积为10 μ 1 的连接产物溶液轻轻摇勻，冰上放置30分钟。然后在42°C水浴中热击120秒，迅速置于冰上冷却5分钟。向离心管中加入Iml LB液体培养基(不含氨苄青霉素)，混勻后37°C振荡培养lh，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的氨苄青霉素抗生素抗性基因(Amp1O。 将上述菌液摇勻后取100 μ 1涂布于含氨苄青霉素、0. 05mM胆固醇亚油酸酯、1KU/L胆固醇氧化酶、500U/L辣根过氧化物酶、0. 02mM 4-氨基安替比林和0. 02mM苯酚的LB筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37°C培养20h。在筛选平板上出现了大肠杆菌的菌落，即PUC19重组质粒已经转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中；并且存在具有变色圈的克隆，说明得到了包含有胆固醇酯酶整个基因的重组质粒的大肠杆菌JM109。将变色圈克隆在LB中37°C 200rpm培养20h，送英杰(invitrogen)公司进行DNA序列测定，分析序列得到带有Sti^ptomyces venezuelae的天然胆固醇酯酶的基因序列(即序列3)的质粒。A-4)扩增胆固醇酯酶基因(C0E基因)本发明人设计的胆固醇酯酶基因(C0E基因)引物如下胆固醇酯酶基因正向引物(COEF) :AAGCTTG胆固醇酯酶基因反向引物(COER) =GTCGAC胆固醇酯酶基因扩增条件为20mMTris-HCl (pH 8. 8) UOmM KClUOmM(NH4)2SO4, 2mM MgSO4^O. 1% Triton Χ_100、50μΜ dATP、50yM dGTP、50yM dTTP,50y M dCTP、400nM 引物 C0EF、400nM 引物 C0ER、1. 5U PfuDNA 聚合酶(Promega，USA)，20ng 步骤 AD 得到的质粒DNA模板加入反应体系，用无菌水调至反应体积达50 μ L0扩增反应程序为将上述反应体系在95°C下反应5分钟，然后进行30个循环的 "950C 30s,550C 30s和72°C lmin”，最后在72°C下保持10分钟。将得到的PCR扩增基因产物用琼脂糖凝胶电泳分离，并回收700bp左右单一条带的DNA片段。B)带有假单朐,Ifg泡丨子的PUC19表达裁体 射勾建将质粒pCN51中的假单胞菌复制子基因克隆至PUC19中，构建成能够在假单胞菌中复制和表达的载体。具体步骤如下克隆复制子基因(Rep基因)引物如下复制子基因正向引物(ItepF)GGTACCCAGCTGACCAACGACCGGTA复制子基因反向引物(ItepR)GAATTCTCACTCGAGACTCAGTGCCA复制子扩增条件为20mMTris-HCl (pH 8. 8) UOmM KCl UOmM (NH4)2SO4,2mM MgSO4^O. 1% Triton Χ_100、50μΜ dATP、50yM dGTP、50yM dTTP、50 μ MdCTP、400nM 引物 R印F、400nM引物R印R、l. 5U Pfu DNA聚合酶(普洛麦格生物技术有限公司(Promega)， USA)，20ng质粒DNA模板加入反应体系，用无菌水调至反应体积达50 μ L。扩增反应程序为将上述反应体系在95°C下反应5分钟，然后进行30个循环的 "950C 30秒、55°C 30秒和72°C 2分钟”，最后在72°C下保持10分钟。将得到的PCR扩增基因产物用琼脂糖凝胶电泳分离，并用凯杰OiIAGEN)快速提取凝胶试剂盒回收ISOObp左右单一条带的DNA片段。将得到的R印基因经&ic I和EcoR I双酶切4h，与同样经&ic I和EcoR I双酶切4h的pUC19载体连接。ο 猶目 1§髓針_ pi ι mnnm 針_ _养C-1)将胆固醇酯酶基因克隆至步骤B)所得空载体的复制子前，具体步骤如下将步骤B)所得载体经Hind III和BamH I双酶切4h，同时以Hind III和BamH I 双酶切步骤A-4)所得COE基因，通过使用T4DNA连接酶二者连接，构建成为胆固醇酯酶表达载体pCOE。C-2)感受态恶臭假单胞菌(Pseudomonas Putida, ATCC12633)的制备将70°C甘油保存的恶臭假单胞菌(Pseudomonas Putida, ATCC12633)在LB固体平板上活化后，挑取单菌落37°C 120转/分钟摇床培养16小时，将过夜增菌的恶臭假单胞菌，以1 100的比例接种于50ml的SOC培养基中，37°C 120转/分钟摇床培养至菌液吸光度达1. 0，吸取1. 5ml培养好的菌液至1. 5ml离心管中，在冰上冷却10分钟后，在4°C、6000 转/分钟条件下离心15分钟。弃上清加入100 μ 1在冰上预冷的0. lmol/L的CaCl2溶液， 用移液枪轻轻上下吸动打勻，重悬细胞，在冰放置20分钟。然后在4°C、3000g下离心5分钟，弃去上清，加入100 μ 1在冰上预冷的0. lmol/L的CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打勻，重悬细胞，得到感受态的恶臭假单胞菌。C-3)将所述表达载体pCOE电击转化入所述感受态恶臭假单胞菌将步骤C-1)所得的胆固醇酯酶表达载体pCOE加入到步骤C-幻所得的感受态细胞中，混勻并放置不同时间后转入预冷的2mm电极杯，避免产生气泡，其中，所述表达载体 PCOE终浓度为0. 5 μ g/ml，感受态恶臭假单胞菌浓度为4. 6X IO12个/ml，电转化条件为 10%甘油溶液作为电转介质、4°C、电脉冲场强为13kV/cm、，电击脉冲时间为5ms，并迅速向电击杯中加入37°C温浴的SOC培养基，370C 120转/分钟摇床培养1小时，得到重组宿主细胞，即表达天然胆固醇酯酶的恶臭假单胞菌菌株。P)耐热突变胆固醇酯酶筛选将步骤C)得到的表达天然胆固醇酯酶的恶臭假单胞菌菌株分别接种于多个3ml LB培养基中，37°C 200rpm培养至OD6tltl = 1. 0，加入终浓度ImM的IPTG，30°C诱导4h。用超声波破碎细胞(破碎功率200w，破碎时间4min)后，分别在60°C、65°C、70°C下水浴加热
配制如下测活试剂
A 液KH2PO4 4-氨基安替比林胆固醇氧化酶过氧化物酶
14g/L 0.9616g/L 30KU/L 15KU/L
B 液KH2PO4
苯酚
14g/L 6g/L 10g/L 0. 39g/L
曲拉通 X-IOO ( TritonX-IOO )
胆固醇亚油酸酯将所述A液与所述B液以1 3的体积比混合，每孔120 μ 1置于96孔板中，然后每孔加入4μ 1上述加热过的超声波细胞破碎液，37°C温浴5min，变红的孔是具有酶活性的孔。在60°C加热过的酶液中有3个有反应变红的孔，在65°C加热过的酶液中有1个有反应变红的孔，在70°C加热过的酶液中没有反应变红的孔。测序检验所述在65°C加热超声波细胞破碎液后，有反应的孔中所对应克隆，得到编码耐热突变胆固醇酯酶的核苷酸序列(如 SEQ ID No. :2所示)以及表达所述耐热突变胆固醇酯酶的恶臭假单胞菌菌株。E)耐热重组宿主细胞的培养将上述步骤D)获得的带有编码耐热突变胆固醇酯酶的核苷酸序列的对应恶臭假单胞菌克隆在LB培养基中30°C下培养至生长对数生长期(IO6细胞/毫升)，然后以所得种子液(LB培养基和增殖的恶臭假单胞菌)和扩增培养基体积比为1 100的比例，接种于3L成分如下的扩增培养基(％表示重量百分比)中0. 05%的磷酸二氢钾、0.5%的磷酸氢二钠、0. 1 %的氯化铵、0. 05 %的硫酸镁、2 %的酵母粉、0. 5 %的蛋白胨、0. 03 %的葡萄糖、 5%的甘油、0. 5 %的乳糖、的油酸和0. 5%的卵磷脂。调节pH至6. 8。将所述3L扩增培养基加入到5L发酵罐中，在121°C灭菌15分钟。在所得培养基中加入60mL生长至对数生长期的上述恶臭假单胞菌(IO6细胞/毫升)。在37°C下培养至发酵液取样中的细胞密度达到IO8细胞/毫升发酵完毕。F)蛋白产物的分离提纯将步骤E)得到的发酵液在IOOOOrpm下离心lOmin，收集重组宿主细胞沉淀。弃去上清，将所得重组宿主细胞重悬于等体积的20mmol/L的pH为8. O的Bis-Tris缓冲液中。 用高压勻浆机破碎重悬的细胞，先将破碎细胞液在55°C下加热30min，除去大部分不耐热的杂蛋白，在IOOOOrpm下离心15min，收集上清粗酶液，弃取细胞碎片沉淀和变性的不耐热杂蛋白沉淀。将上述所得粗酶液用孔径为0. 22 μ m滤膜过滤后，所得滤液在美国通用电子公司 (GE公司)的安克塔纯化者(AKTA Purifier) 二乙氨基乙基纤维素柱(DEAE CL-6B柱)上进行离子交换层析。其中，上样缓冲液为20讓01/1的？!1为8.0的财8-1^化缓冲液。在流过两个柱体积的上样缓冲液后，使用洗脱缓冲液，其为含有lmol/L NaCl的20mmol/L的pH为6. 0的Bis-Tris缓冲液。当8%的洗脱缓冲液洗柱后以25%的洗脱缓冲液洗脱得到目标蛋白开始收集蛋白，收集实时监测到的蛋白单峰结束(其中在洗脱过程中所述的8%和 25%是指所述洗脱缓冲液占洗脱缓冲液和上样缓冲液之和的体积百分数)。所得溶液用孔径为0. 22 μ m的滤膜过滤后，所得滤液再用葡聚糖凝胶G_25层析柱(S^hadex G-25)脱盐。所述脱盐缓冲液是0. lmol/L的pH为7. 0的磷酸钾缓冲液。在用脱盐缓冲液平衡好的层析柱上上样，其中样品溶液(即上述用0. lmol/L的pH为6. 0的 Bis-Tris缓冲液复溶的蛋白溶液)的流速为5ml/min，然后用脱盐缓冲液以15ml/min的流速洗脱2个柱体积。收集洗脱下的液体共500毫升。所收集的液体在普通冰箱中-10°C下冷冻2小时，然后再_40°C深冷冰箱预冻8小时，在德国科瑞斯特(CHRIST)的ALPHA 1-4LSC型冷冻干燥机中，以真空度0. 04mbar、安全压力0. IOOmbar且冷阱温度_60°C的条件冻干10小时。然后等物料温度与冻干机隔板温度差为零，并且观察在15秒内压力指示不变时，结束冻干。冻干所得蛋白质的量为10克。冻干蛋白在冷冻条件下密封保存。采用《蛋白质电泳试验技术》(郭尧君，132-145页，科学出版社，1999年)记载的 SDS-PAGE电泳的方法测定出本实施例的蛋白质的分子量为64KD，并且根据《生物化学》(王镜岩等，高等教育出版社，2002，见168页)记载的蛋白质一级结构的测定方法(分肽段测定)，测得本实施例的蛋白质有2 个氨基酸残基(参见SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列)， 与由SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列编码的蛋白质结果一致。按照以下方法测定胆固醇酯酶的活性配制如下测活试剂依次加入0. 3ml A液、0. 9mlB液和0. 04ml待测酶液。在37°C下反应5min测定波长505nm。测定4-5min内吸光度的变化率。按照以下公式计算酶活力
酶活力(U/L)= ΔΑ/minXVtX DX1000 = Δ A/min χ 4499 χ D
A 液KH2PO4 4-氨基安替比林胆固醇氧化酶过氧化物酶
14g/L 0.9616g/L
30KU/L 15KU/L 14g/L 6g/L 10g/L 0. 39g/L
B 液KH2PO4
苯酚
曲拉通 X-100 ( TritonX-100 )
胆固醇亚油酸酯
eXVsXdVt 反应液总体积(1. 24ml) e :13. 78(摩尔吸光系数)Vs 待测酶液的体积(0. 04ml) d 比色杯光径(Icm)D 稀释倍数 ΔΑ/min :ABS/min
线性范围为300 600U/L。酶活力(U/mg)=酶活力(U/L)/溶液中酶浓度其中，耐热胆固醇酯酶冻干粉的重量单位为mg，溶液中酶浓度的单位为mg/L。其中，酶活定义为1个酶活单位等于在以下反应条件下1分钟生成1毫摩尔过氧化氢(1/2毫摩尔醌染料)的酶量。以上测到本实施例的蛋白不仅具有胆固醇酯酶的活性(60-70KU/L)，并且具有胆固醇亚油酸酯的Km值为1.9X10_5mol/L，足以满足临床上测定待测标本中血清总胆固醇浓度的试剂盒的对胆固醇酯酶的要求(37°C下的胆固醇亚油酸酯的Km值至多为 2. lXl(T5mol/L)。综上，本发明的发明人得到了一种新的胆固醇酯酶，其来源于委内瑞拉链霉菌 (Streptomyces venezuelae ATCC 10712)，分子量为 52. 7KD、等电点5. 26、具有 SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列以及SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。并且本发明的胆固醇酯酶 PH稳定范围为5-10且热稳定性在65°C下30min不失活。其中，本领域技术人员通过阅读本实施例，可以知晓本发明的核苷酸序列例如SEQ ID NO :2，并可以通过化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此可以在得到具有该核苷酸序列的核酸后，无需实施本实施例第A)和 D)步，而是在得到人工合成的SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列后，直接实施本实施例步骤 B)、C)、E)和F)重复本实施例；或者在得到步骤D)所述耐热突变胆固醇酯酶的恶臭假单胞菌菌株后直接实施本实施例步骤E)和F)重复本实施例。对比例1本对比例为东洋纺公司(Τ0Υ0Β0)生产的假单胞菌来源的胆固醇酯酶，其分子量为300KD,对胆固醇亚油酸酯的Km为5. 4X10"5mol/L,最适pH值7. 0-9. 0，最适温度40°C。对比例2本对比例为实施例1步骤C得到的表达天然胆固醇酯酶的恶臭假单胞菌菌株，其具有SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列以及SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。其分子量为 52KD，对胆固醇亚油酸酯的Km为2. 1 X lO—W/L，最适pH值6. 0-8. 0，最适温度40°C。测试实施例1按照制备实施例1提及的方法测试制备实施例1和对比例1-2的胆固醇酯酶活性，测试结果见下表1表1
胆固醇酯酶制备实施例1对比例1对比例2酶活(KU/mg冻干粉)6010015由以上结果可知，实施例1的胆固醇酯酶其酶活力与对比例1和2相比在同一数量级上，完全能够满足临床上测定待测标本中钾离子浓度的试剂盒的对胆固醇酯酶的要求。测试实施例2按照如下方法测试制备实施例1和对比例1-2的胆固醇酯酶的pH稳定性将0. 5KU的胆固醇酯酶在25°C下，分别溶于PH值为3. 5、4. O、4. 5、5. O、5. 5、6. O、6. 5,7. 0,7. 5,8. 0,8. 5,9. 0和9. 5的IOOmmol/L三乙醇胺缓冲液中，静置20小时。除“酶干粉用PH为7. 6的三乙醇胺缓冲液稀释至1000U/L”的步骤不同外，按照测试实施例1的方法测定酶活。按所测酶活与最大所测酶活的比值百分数即相对活性为纵坐标，PH为横坐标绘制曲线。制备实施例1和对比例1-2的测试结果见图4。从图中可以看出，制备实施例1的pH稳定性显著好于对比例1-2，这样一来包括本发明的胆固醇酯酶的试剂盒能够测定的待测样本的种类比现有技术更多，对试剂盒的运输、保存的条件降低，对使用试剂盒的人员的操作精密精细要求降低，有利于带有胆固醇酯酶的试剂盒的普及。测试实施例3按照如下方法测试制备实施例1和对比例1-2的胆固醇酯酶的热稳定性将IKU的胆固醇酯酶干粉溶于pH值为7. 5的20mmol/L磷酸钾缓冲液中，分别在 25°C、30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C下保持 15 分钟。按照测试实施例 1的方法测定酶活。按所测酶活与最大所测酶活的比值百分数即相对活性为纵坐标，温度为横坐标绘制曲线。制备实施例1和对比例1-2的测试结果见图3。从图中可以看出，制备实施例1的热稳定性显著大于对比例1-2。在60°C加热10 分钟条件下都具有90%以上的相对活性，明显高于在相同条件下的对比例1-2的胆固醇酯酶的相对活性。制备实施例2-5按照表2的配方配制试剂表2
实施例制备实施例2制备实施例3制备实施例4制备实施例5磷酸盐缓冲液 (mmol/L, PH=6.5 )5010050100胆固醇酯酶(U/L)100200100200过氧化物酶(U/L)500010000500010000胆固醇氧化酶(U/L)2000500020005000苯酚(g/L)12124-氨基安替比林 (g/L)0.010.050.010.05牛血清白蛋白(g/L)0.10.20.10.2曲拉通 X-IOO (g/L)510510 制备实施例5和6的试剂分别配制成液体形式即可。制备实施例7和8的试剂分别在如下条件下冷冻干燥在普通冰箱中-10°c下冷冻2小时，然后再-40°c深冷冰箱预冻 8小时，在德国科瑞斯特(CHRIST)的ALPHA 1-4LSC型冷冻干燥机中，以真空度0. 04mbar、 安全压力0. IOOmbar且冷阱温度-60°C的条件冻干10小时。然后等物料温度与冻干机隔板温度差为零，并且观察在15秒内压力指示不变时，结束冻干。冻干得到的试剂干粉可以在使用前用蒸馏水复溶成原液体形式的体积。冻干得到的试剂干粉，比液体形式的试剂保存的时间更长，包装要求较低，并且体积更小，运输更容易。对比例2按照与制备实施例5相同的配方配制成液体形式的试剂盒。测试实施例6本测试实施例测量了两个待测标本一个是5. 20mmol/L的总胆固醇水溶液标准品；另一个为健康状况良好的30岁女性的血清待测标本，抽取其IOml血液，静置至血细胞沉淀分层，取上层血清5ml用于对制备实施例2-5和对比例3的试剂盒进行检验。分别将制备实施例2-5中的Rl取300 μ 1，加上标本3 μ 1，混合液在37°C条件下保温300秒，505nm条件下记录吸光度数值A。测试结果见表3。表权利要求
1.一种胆固醇酯酶，其特征在于，所述胆固醇酯酶的氨基酸序列为(1)SEQID NO :1所示的氨基酸序列，或者(2)对(1)所述的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其胆固醇酯酶的功能不变的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的胆固醇酯酶，其中，所述胆固醇酯酶的氨基酸序列为SEQID NO :1所示的氨基酸序列。
3.一种编码胆固醇酯酶的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列为编码权利要求 1或2所述的胆固醇酯酶的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列为(1)SEQID NO :2所示的核苷酸序列；或者(2)对SEQID NO :2所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或增加而得到的核苷酸序列，该核苷酸序列编码的胆固醇酯酶功能不变。
5.根据权利要求3所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列为SEQIDNO 2所示的核苷酸序列。
6.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体由空载体和插入该空载体的目的基因组成，所述目的基因为权利要求3-5中任意一项所述的编码胆固醇酯酶的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述空载体选自由pUC19、pGEM和 pBluescript所组成的组中。
8.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述空载体为插入了质粒pCN51中的假单胞菌复制子基因的PUC19。
9.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞含有权利要求6-7任意一项所述的重组载体。
10.根据权利要求9所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌 JM109和/或恶臭假单胞菌。
11.一种从权利要求9或10所述的重组宿主细胞中纯化胆固醇酯酶的方法，其特征在于，所述方法采用将重组细胞的破碎液在45-65°C加热15-40分钟，然后在8000-15000rpm 离心10-20min，以除去不耐热的杂蛋白。
12.—种检测血清总胆固醇的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下(a)-(d)中的至少一种(a)权利要求1或2所述的胆固醇酯酶；(b)权利要求3-5中任意一项所述的胆固醇酯酶的核苷酸序列；(c)权利要求6-8中任意一项所述的重组载体；(d)权利要求9或10所述的重组宿主细胞。
全文摘要
本发明公开了一种胆固醇酯酶，其氨基酸序列为(1)SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，或者(2)对(1)所述的氨基酸序列进行一个或几个氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其胆固醇酯酶的功能不变的氨基酸序列。本发明还公开了编码所述胆固醇酯酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重组载体，包括所述重组载体的重组宿主细胞，从前述重组宿主细胞中纯化该酶的方法，以及包括上述胆固醇酯酶、核苷酸序列、重组载体和重组宿主细胞中的至少一种的试剂盒。本发明的胆固醇酯酶耐热性好、稳定性很高。基因的快速、有效且准确的检测，因而能保证及时的病例诊治、准确的病原学调查以及科学的防控政策的制定。
文档编号C12N9/18GK102321595SQ201110253039
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月31日 优先权日2011年8月31日
发明者不公告发明人 申请人:北京利德曼生化股份有限公司