专利名称：一种检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法。
背景技术：
环介导等温扩增技术(LAMP)是2000年由日本荣研株式会社开发的一种简单、快速、特异、经济的新型核酸扩增技术，该方法的特点是针对靶基因的6个区域设计4个特异的引物，利用一种链置换DNA聚合酶在恒温条件下反应几十分钟即可完成。具有高特异性和等温扩增的特点，Ih之内可将靶基因扩增IO9 101°倍。在DNA延伸合成时，从脱氧核苷三磷酸基质(dNIPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子结合，会产生一种焦磷酸镁衍生物的白色沉淀，利用这一特点用肉眼即可判断扩增与否。环境中细胞失去生存能力后，其DNA依然具有持续生存能力，而基于传统的DNA检测方法不能区分阳性信号是来自靶微生物中的活细菌还是死细菌，无法有效区分死菌和活菌，可能导致对致病菌风险的过高估计或得出假阳性结果。
发明内容
本发明是要解决现有的LAMP检测方法不能有效区分死菌和活菌，导致对致病菌风险的过高估计的问题，提供一种检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法。本发明检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法，按以下步骤进行一、受检乳样的前处理向ImL受检乳中加入PMA，使PMA的浓度为3 μ g/mL,然后置于冰上暗处放置5 30min,接着置于距650W卤素灯15 20cm处，曝光3 5min ；二、对步骤一处理后的受检乳进行DNA提取，得提取物；三、以提取物作为模板进行LAMP扩增，得到LAMP扩增产物；四、鉴定取5 μ L LAMP扩增产物，点样于质量浓度为2%的琼脂糖凝胶中，以100V电压在1 X TAE 电泳缓冲液中电泳30min，然后在凝胶成像系统中成像，即完成检测。本发明针对金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因(nuc)来设计引物，进行LAMP扩增。 本发明使用的荧光染料PMA(Propidium Monoazide)结构中带有一个叠氮基团(_N3)，在光激发下脱去(_拟)形成活跃的氮宾中间体，能插入死细胞DNA与其形成共价键(-NH-CH2-)， 使DNA不能发生扩增反应，从而抑制LAMP扩增，可以有效区分死细菌和活细菌，避免造成对待测样品中实际存活的金黄色葡萄球菌含量的错误评估。将本发明的电泳结果使用凝胶成像系统成像，能够检测出扩增条带的即说明受检乳中含有金黄色葡萄球菌。本发明的方法检测灵敏度高，对金黄色葡萄球菌的最低检出限为lOOfg。本发明为食品中致病菌的检测开辟了新思路。
图1为具体实施方式
十四的检测结果电泳图；图2为具体实施方式
十四中PMA抑制金黄色葡萄球菌死菌的LAMP扩增结果电泳图；图3为具体实施方式
十四中荧光染料STOR Green I验证LAMP反应的结果图；图4为具体实施方式
十四灵敏度测试实验中LAMP扩增的电泳图；图5为具体实施方式
十四灵敏度测试实验中PCR扩增的电泳图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法，按以下步骤进行一、受检乳样的前处理向IrnL受检乳中加入PMA，使PMA的浓度为3μ g/mL，然后置于冰上暗处放置5 30min，接着置于距650W卤素灯15 20cm处，曝光3 5min ；二、对步骤一处理后的受检乳进行DNA提取，得提取物；三、以提取物作为模板进行LAMP扩增，得到 LAMP扩增产物；四、鉴定取5 μ L LAMP扩增产物，点样于质量浓度为2%的琼脂糖凝胶中， 以100V电压在IXTAE电泳缓冲液中电泳30min，然后在凝胶成像系统中成像，即完成检测。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中置于冰上暗处放置5min。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中置于冰上暗处放置30min。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中置于冰上暗处放置10 20min。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中置于冰上暗处放置15min。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤一中置于距650W卤素灯15cm处。其它与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤一中置于距650W卤素灯18cm处。其它与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤一中置于距650W卤素灯20cm处。其它与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一至八之一不同的是步骤一中曝光:3min。其它与具体实施方式
一至八之一相同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
一至八之一不同的是步骤一中曝光細化。其它与具体实施方式
一至八之一相同。
具体实施方式
十一本实施方式与具体实施方式
一至八之一不同的是步骤一中曝光5min。其它与具体实施方式
一至八之一相同。
具体实施方式
十二 本实施方式与具体实施方式
一至十一不同的是步骤二中所述对步骤一处理后的受检乳进行DNA提取的方法为a、向步骤一处理后的受检乳中加入 ImL的DNA提取液、IOyL浓度为10mg/mL的蛋白酶K和10 μ L浓度为10mg/mL的溶菌酶，然后于37°C、200r/min条件下振荡1. 5h，再加入200 μ L质量浓度为20%的SDS，然后于65°C 水浴lh，之后以13000r/min的转速离心5min，取上清液；b、在沉淀中加入0. 75mL的DNA提取液和75 μ L浓度为20%的SDS，在涡旋振荡器上振荡IOs后，于65°C水浴20min，然后在室温下以13000r/min离心5min，取上清液；C、合并步骤a和步骤b得到的上清液，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液，于13000r/min离心5min，回收水相，在水相中加入0. 6倍体积的4°C的异丙醇，在_20°C放置1.证，然后于13000r/min离心lOmin，弃掉上清液，将沉淀用4°C的体积浓度为70%的乙醇洗涤3 5次，干燥后加入300 μ L的TE缓冲液，即为提取物；步骤a和步骤b中所述DNA提取液由0. lmol/L的Tris-HCl、0. lmol/L的EDTA、0. Imo 1/ L的Νει3Ρ04、1. 5mol/L的NaCl和质量浓度为10A的CTAB组成，DNA提取液的pH值为8 ；步骤 c中氯仿和异戊醇的混合液中氯仿与异戊醇的体积比为M 1。其它与具体实施方式
一至十一相同。
具体实施方式
十三本实施方式与具体实施方式
一至十二不同的是步骤三中 LAMP扩增的反应体系为50 μ L反应体系，由下列成分组成
成分模板
40|imol/L 的引物 FIP 5，- GGATGCTTTGTTTCAGGTGTATCATGTACAAAGGTCAACCAATG -3'
40|imol/L 的引物 BIP 5，- AGAGAAATATGGTCCTGAAGCAAGCCTTTGTCAAACTCGACTTC -3
ΙΟμιηοΙ/L 的引物 F3 5，- CGATTGATGGTGATACGGTTA -3‘
ΙΟμιηοΙ/L 的引物 B3
5，- CCACGTCCATATTTATCAGTTC -3'
IOxBst 酶 Buffer 10mmol/L WdNTP 2.5mmol/L 的 Mg2+ 12.5mol/L的甜菜碱 200U 的 Bst 酶去离子水LAMP 扩增条件为95°C 5min,迅速置于 4°C加入 Bst 酶，63°C 60min, 80°C 2min。其
它与具体实施方式
一至十二相同。
具体实施方式
十四本实施方式检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法，按以下步骤进行一、受检乳样的前处理向ImL受检乳中加入PMA，使PMA的浓度为3 μ g/mL,然后置于冰上暗处放置5min，接着置于距650W卤素灯20cm处，曝光^iin ；二、对步骤一处理后的受检乳进行DNA提取，得提取物；三、以提取物作为模板进行LAMP扩增，得到LAMP扩增产物；四、鉴定取5μ L LAMP扩增产物，点样于质量浓度为2%的琼脂糖凝胶中，以100V电压在IXTAE电泳缓冲液中电泳30min，然后在凝胶成像系统中成像，即完成检测。本实施方式步骤二中所述对步骤一处理后的受检乳进行DNA提取的方法为a、 向步骤一处理后的受检乳中加入ImL的DNA提取液、10 μ L浓度为10mg/mL的蛋白酶K和 10 μ L浓度为lOmg/mL的溶菌酶，然后于37°C、200r/min条件下振荡1. 5h，再加入200 μ L
6
用量 2μL
2μL
2μL
Ιμ Ιμ
5μL 8|iL 4μL 6μL 2μL 17|iL质量浓度为20%的SDS，然后于65°C水浴Ih，之后以13000r/min的转速离心5min，取上清 液；b、在沉淀中加入0. 75mL的DNA提取液和75 L质量浓度为20%的SDS，在润旋振荡器 上振荡10s后，于65°C水浴20min，然后在室温下以13000r/min离心5min，取上清液；e、合 并步骤a和步骤b得到的上清液，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液，于13000r/min离 心5min，回收水相，在水相中加入0. 6倍体积的4°C的异丙醇，在-2(rC放置1. 5h，然后于 13000r/min离心lOmin，弃掉上清液，将沉淀用4°C的体积浓度为70%的乙醇洗涤3 5次， 干燥后加入300 iiL的TE缓冲液，即为提取物；步骤a和步骤b中所述DNA提取液由0. Imol/ L 的 Tris-HCl、0. Imol/L 的 EDTA、0. Imol/L 的 Ne^PCVI. 5mol/L 的 NaCl 和质量浓度为 的CTAB组成，DNA提取液的pH值为8 ；步骤e中氯仿和异戊醇的混合液中氯仿与异戊醇的 体积比为对1。本实施方式步骤三中LAMP扩增的反应体系为50 L反应体系，由下列成分组成
成分用量
模板2|iL
40|imol/L 的引物 FIP
5 ’ - GGATGCTTTGTTTCAGGTGTATCATGTACAAAGGTCAACCAATG -3'^
40|imol/L 的引物 BIP
5 ’ - AGAGAAATATGGTCCTGAAGCAAGCCTTTGTCAAACTCGACTTC -3'^
10|imol/L 的引物 F31 L
5，- CGATTGATGGTGATACGGTTA -3'^
10|imol/L 的引物 B31 L
5 ’ - CCACGTCCATATTTATCAGTTC -3'^
lOxBst 酶 Buffer5|iL
lOmmol/L 的 dNTP8|iL
2.5mmol/L 的 Mg2+4|iL
12.5mol/L 的甜菜碱6|iL
200U 的 Bst 酶2|iL
去离子水17|iLLAMP 扩增条件为95°C 5min,迅速置于 4°C加入 Bst 酶，63°C 60min, 80°C 2min。本实施方式步骤四中使用凝胶成像系统为美国UVP凝胶成像系统。本实施方式的 检测结果如图1所示，图1中M为DNA Marker,泳道1为受检乳1，泳道2为受检乳2，从图 1中可看出受检乳1中含有金黄色葡萄球菌，而受检乳2中不含有金黄色葡萄球菌。为了证明本实施方式的方法能够选择性只扩增活菌，进行以下试验取相同浓度 的活菌液和死菌液，分为四组:A组和B组为活菌液，e组和D组为死菌液，每组的菌液浓度 和体积均相同。分别对B组和D租的的菌液按照本实施方式步骤一的方法进行PM处理， 然后对四组菌液分别进行DNA提取，以DNA为模板，按照本实施方式步骤三的方法进行LAMP 扩增，然后对产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。图2中M为DNA Marker，泳道1 表示阴性对照(以去离子水作为模板)，泳道2表示A组的活菌液(未经PMA处理)，泳道3表示B组的经过PMA处理的活菌液，泳道4表示C组的死菌液(为经PMA处理)，泳道5表 示D组的经过PMA处理的死菌液。从图2可看出，未经PMA处理的死菌和活菌都能够扩增出条带，而经过PMA处理 后，只有活菌能够扩增出条带，而死菌没有条带。由此可知本实施方式的方法能够有效地抑 制死菌的扩増，只检测出活菌，从而防止假阳性结果的产生。利用荧光染料STOR Green I对上述实验LAMP反应是否发生进行验证，LAMP反应 结束后，取部分LAMP反应的产物，向产物中加入1 y L 10倍稀释后的STOR Green I染料。 SYBR Green I染料本身的颜色是橙色，如果LAMP反应发生了，染料颜色会从橙色变成绿色。 验证结果如图3所示，NC表示阴性对照(以去离子水作为模板)，1号管表示A组的活菌液 (未经PMA处理)，2号管表示B组的经过PMA处理的活菌液，3号管表示C组的死菌液(未 经PMA处理)，4号管表示D组的经过PMA处理的死菌液。从图3可看出，4号管中没有发生LAMP反应，可以说明PMA可以抑制死菌的LAMP 扩增。对本实施方式的方法进行灵敏度的测试，具体如下人工接种金黄色葡萄球菌于 灭菌乳中，于37°C、200r/min振荡培养8h。调整乳中菌体浓度为108cuf/mL，然后进行10倍 梯度稀释，使浓度为IO8、107、IO6、105、IO4、103、IO2、IO1和10°cfu/mL,分别进行PMA处理后提 取菌体DNA，以菌体DNA为模板进行LAMP扩增和PCR扩增。PCR反应体系为50 U L，由下列成分组成
成分用量
模板4 uL
10|imol/L的正向引物2uL
5 ‘ - GCCGAATTCGTTATGACAGAATACT -3'‘
10|imol/L的反向引物2 uL
5，- CAAGTCGACCAGCGTTGTCTTCGC -3，‘
IOxTaq Buffer5uL
10mmol/L WdNTPmix 5uL
2.5mmol/L 的 Mg2+ 4uL
200U 的 Taq 酶2uL
去离子水26uLPCR 扩增条件为94°C 5min, 30 个循环94°C 45s_62°C 45s_72°C 30s, 72°C 5min。LAMP扩增结果的电泳图如图4所示，图4中从左到右依次为marker、108、107、106、 105U04U03U02U0\10°和去离子水；PCR扩增结果的电泳图如图5所示，图5中从左到右 依次为 marker、纯活菌、108、IO7,106、105、104、IO3, IO2UO1UO0 和去离子水。由图4和图5可以看出，PMA+LAMP结合技术可以检测到10°cfu/mL的菌体，通过检 测DNA在260nm与280nm波长下的吸光度，最低检测量为lOOfg，而PMA+PCR技术可以检测 到IO1CfuAiL的菌体。所以，LAMP技术比PCR技术灵敏10倍以上。
权利要求
1.一种检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法，其特征在于检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法，按以下步骤进行一、受检乳样的前处理向ImL受检乳中加入PMA，使PMA的浓度为3 μ g/mL,然后置于冰上暗处放置5 30min，接着置于距650W卤素灯15 20cm处， 曝光3 5min ；二、对步骤一处理后的受检乳进行DNA提取，得提取物；三、以提取物作为模板进行LAMP扩增，得到LAMP扩增产物；四、鉴定取5 μ L LAMP扩增产物，点样于质量浓度为2%的琼脂糖凝胶中，以100V电压在IXTAE电泳缓冲液中电泳30min，然后在凝胶成像系统中成像，即完成检测。
2.根据权利要求1所述的一种检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法，其特征在于步骤一中置于暗处放置5min。
3.根据权利要求1或2所述的一种检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法，其特征在于步骤一中置于距650W卤素灯18cm处。
4.根据权利要求3所述的一种检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法，其特征在于步骤一中曝光3min。
5.根据权利要求4所述的一种检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法，其特征在于步骤二中所述对步骤一处理后的受检乳进行DNA提取的方法为a、向步骤一处理后的受检乳中加入ImL的DNA提取液、10 μ L浓度为10mg/mL的蛋白酶K和10 μ L浓度为10mg/mL的溶菌酶，然后于37°C、200r/min条件下振荡1. 5h，再加入200 μ L质量浓度为20%的SDS，然后于65°C水浴lh，之后以13000r/min的转速离心5min，取上清液；b、在沉淀中加入0. 75mL的 DNA提取液和75 μ L浓度为20%的SDS，在涡旋振荡器上振荡IOs后，于65°C水浴20min，然后在室温下以13000r/min离心5min，取上清液；C、合并步骤a和步骤b得到的上清液，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合液，于13000r/min离心5min，回收水相，在水相中加入0. 6 倍体积的4°C的异丙醇，在_20°C放置1.证，然后于13000r/min离心lOmin，弃掉上清液，将沉淀用4°C的体积浓度为70%的乙醇洗涤3 5次，干燥后加入300 μ L的TE缓冲液，即为提取物；步骤a和步骤b中所述DNA提取液由0. lmol/L的Tris_HCl、0. lmol/L的EDTA、 0. lmol/L的Na3PO4,1. 5mol/L的NaCl和质量浓度为1 %的CTAB组成，DNA提取液的pH值为8;步骤c中氯仿和异戊醇的混合液中氯仿与异戊醇的体积比为M 1。
6.根据权利要求5所述的一种检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法，其特征在于步骤三中LAMP扩增的反应体系为50 μ L反应体系，由下列成分组成成分用量模板2|iL
全文摘要
一种检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法，涉及一种检测乳中金黄色葡萄球菌活菌的方法。本发明是要解决现有的LAMP检测方法不能有效区分死菌和活菌，导致对致病菌风险的过高估计的问题。方法一、受检乳样的前处理；二、对步骤一处理后的受检乳进行DNA提取，得提取物；三、以提取物作为模板进行LAMP扩增；四、取LAMP扩增产物点样于琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像系统中成像，即完成检测。本发明的方法检测灵敏度高，对金黄色葡萄球菌的最低检出限为100fg。可广泛应用于食源性致病菌检测领域。
文档编号C12Q1/68GK102311997SQ20111025319
公开日2012年1月11日 申请日期2011年8月30日 优先权日2011年8月30日
发明者刘春波, 刘颖, 卢雁, 姜毓君, 杨士芹, 满朝新, 胡惠秩, 董鑫悦, 蒋亚男, 郎友 申请人:黑龙江省乳品工业技术开发中心