专利名称：一种用于检测高脂血症易感性的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疾病易感性检测用的试剂盒，尤其是一种检测高脂血症易感性的试剂盒，通过同时检 测血浆胆固醇酯转移蛋白基因(cholesteryl ester transfer protein, plasraa， CETP)、载脂蛋白B基 因(apolipoprotein B， APOB)和脂蛋白脂酶基因(lipoprotein lipase, LPL)的单核苷酸多态性位点 (SNP)来预测个体对髙脂血症的易感性。
背景技术：
由于脂肪代谢或运转异常使血浆中一种或几种脂质高于正常称为高脂血症(hyperlipidemia),可表现 为髙胆固醇血症(hyperchoesterolemia)、高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia)或两者兼有(混合型 高脂血症)。脂质不溶或微溶于水，必须与蛋白质结合以脂蛋白形式存在，才能在血液循环中运转，因此， 高脂血症常为高脂蛋白血症(hyper 1 ipoproteinemia)的反映。由于逐渐认识到血浆中高密度脂蛋白降低也 是一种血脂代谢紊乱，因而称之为血脂异常(dyslipidemia)更为全面、准确地反映血脂代谢紊乱状态。目 前冊0将高脂蛋白血症分为五大类，主要为根据血浆脂蛋白升高的程度不同进行的表型分类:家族性高乳糜微粒血症(家族性高甘油三酯血症)、家族性高胆固醇血症(家族性高e脂蛋白血症)、家族性异常e脂 蛋白血症、高前e脂蛋白血症、混和型高甘油三酯血症(混和性高脂血症)。脂蛋白的蛋白部分是一种特殊蛋白，因与脂质结合担负在血浆运转脂类的功能，故称为载脂蛋白(即叩rotein)。载脂蛋白除了与脂质结合形成水溶性物质,成为转运脂类的载体以外，还有其他特殊功能， 尤其是参与酶活动的调节，以及参与脂蛋白与细胞膜受体的识别和结合反应。血浆中的脂蛋白呈微粒状， 核心主要为甘油三酯和胆固醇酯，外层由磷脂、胆固醇、载脂蛋白构成。水溶性酶可透过表层进入内层起 作用。脂蛋白的代谢有两条途径①外源性代谢途径是指饮食摄入的胆固醇和甘油三酯在小肠中合成CM 及其代谢过程；②内源性代谢途径是指由肝合成的VLDL转变为IDL和、LDL，以及LDL被肝或其他器官 代谢的过程。其中乳糜微粒CM不能进入动脉壁内， 一般不致动脉粥样硬化，但易诱发胰腺炎。血浆极低密度脂蛋 白VLDL水平升高是冠心病的危险因素。低密度脂蛋白LDL容易进入动脉壁并被氧化修饰，是主要的致动 脉粥样硬化的因素。髙密度脂蛋白HDL水平升高有利于外周组织移除胆固醇，防止动脉粥样硬化发生。髙脂血症(高脂蛋白血症)临床上可分为两类①原发性，属遗传性脂代谢紊乱疾病；②继发性，常 见于控制不良的糖尿病、饮酒、甲状腺功能减退症、肾病综合征、透析、肾移植、胆道阻塞、口服避孕药 等。血脂异常与心血管病，尤其与冠心病的发生和发展密切相关，是代谢综合症的组成成分之一。已知部分原发性高脂血症是由先天性基因缺陷所致,如LDL受体基因缺陷可引起家族性离胆固醇血症。而常见继发性高脂血症病因有下列几种1、 高胆固醇血症糖尿病、肾病综合症、甲状腺功能减退、Cushing综合症；2、 高甘油三酯血症糖尿病(未控制)、肾病综合症、尿毒症(透析时)、肥胖症、雌激素治疗、糖原贮 积症(I型)、饮酒、系统性红斑狼疮、异常Y-球蛋白血症、痛风；3、 高异常脂蛋白血症各种原因引起的肝内外胆道梗阻、胆汁淤积性肝胆病、包括肝内胆小管性肝炎、 胆汁性肝硬化。我国人群血脂平均水平低于发达国家，但其升高幅度却很惊人。我国对不同地区9组人群，从20世 纪80年代初至90年代末的20年间进行了 3次可比性调査，结果表明血清总胆固醇(TC)〉5.20咖o1/ L(200mg/dl),男性患病率由17%连续上升至33%,女性患病率由9%连续上升至32%。因此，积极检出、 预防和控制血脂异常成为经济发达地区心血管病预防工作的主要内容之一。SNP(single nucleotide polymorphism),即单核苷酸多态性标记，是一类基于单碱基变异引起的DNA 多态性，被遗传学界称为第三代遗传标记。主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，3 包括单碱基转换、颠换，以及单碱基的插入/缺失等。它是基因组中最为广泛存在的一类多态性标记，占 大约90%。这些基因组序列变异可以导致个体间表型的差异以及不同个体对疾病，特别是复杂疾病的易感 性、和对环境因素、药物反应的差异。CETP(cholesteryl ester transfer protein, plasma )是血浆胆固醇酯转移蛋白编码基因，由该基 因编码的蛋白是脂代谢中重要的转运蛋白之一，它主要介导胆固醇的逆向转运过程，即在高密度脂蛋白 (HDL)颗粒与其他脂蛋白或细胞膜之间不断地进行脂质成分交换的同时增加胆固醇从组织细胞中流出转 运至肝脏的过程。近年来研究认为CETP基因上的多态现象与多种异常脂蛋白血症(异常e脂蛋白血症， 家庭性高胆固醇血症和混合型高脂蛋白血症)，肥胖、糖尿病、肾病综合征以及AS型心脑血管疾病等因素 相关。CETP基因的缺陷可以引起HDL中CE蓄积、TG降低；VLDL、 LDL中的CE减少，TG增加。而CETP活 性增加，脂肪摄取过多易沉积于肝，更多富含CE和LDL颗粒和VLDL残粒集聚于血浆中，过多的LDL就聚 集在动脉壁细胞内，导致CE沉积于动脉壁内，从而引发多种症状。国内外大样本研究均表明CETP基因上 的rsl7237904号SNP位点(SEQ ID NO: 1所示序列中146位)基因型与血浆高密度脂蛋白胆固醇水平的 升高有显著关系，rsl7237904号位点是位于第16染色体上CETP基因第1内含子的酶切位点Taq IB处的 一个的G/A多态SNP位点，低频等位基因A即为国内外文献中常见的TaqlB的B2位点，可以降低血浆内 胆固醇脂转运蛋白的浓度，抑制高密度脂蛋白向低密度脂蛋白的转化，因此对于心脑血管疾病的发生有一 定的保护作用。APOB为apolipoprotein B (载脂蛋白B)的编码基因，血浆中的apoB蛋白有两中亚型， 一种为肠道 分泌的apoB48蛋白，另一种为肝脏细胞分泌的apoB100蛋白，其中即oB100是血浆中乳糜微粒和低密度 脂蛋白(LDL)主要的构成蛋白。APOB基因上的多态性被认为与血浆中的脂蛋白水平和血脂水平都有很重要 的关系。APOB基因的突变可能导致低密度脂蛋白与肝脏细胞上的LDLR受体结合能力下降，血浆内的甘油 三脂和胆固醇清除速度减慢。低密度脂蛋白的堆积进一步可以引起动脉粥样硬化和冠心病的发生。国内外 的大量的关联分析(中国人群共大于1000名)均表明APOB基因上rsl7247263号SNP位点(SEQ ID NO: 2 所示序列中156位)的该基因型对载脂蛋白和血脂都具有影响，rsl7247263位点是APOB基因上的一个C/T 多态，低频率等位基因型T导致编码的蛋白与LDLR的受体结合能力下降，对血浆内的脂质清除能力受到 阻碍，低密度脂蛋白的堆积进一步可以引起动脉粥样硬化和冠心病的发生。LPL基因编码脂蛋白脂酶，该酶在心脏、肌肉和脂肪组织中进行表达。LPL以同型二聚体蛋白的形式 行使功能，其分子生物学的作用包括两部分，一部分为甘油三脂的水解酶作用，另一部分则是受体介导的 脂蛋白内吞作用的桥梁。LPL蛋白上的位点突变在严重的情况下可以导致I型高脂蛋白血症，而较轻程度 上则引起体内脂蛋白代谢的紊乱。LPL基因上rs320位点(SEQ ID NO: 3所示序列中118位)是位于第八 号染色体8p22上的脂蛋白脂酶LPL第八号内含子的多态，由T到G的改变使原有的HindIII酶切位点消 失。国内外研究表明LPL的HindIII位点与血脂水平相关。大样本的中国人群的关联分析(共3000多例) 结果显示带有H—单倍型的个体具有更低的甘油三脂水平和更高的高密度脂蛋白胆固醇水平，可能是保护 个体不受到血脂异常危害的单倍型。国内外的大量的关联分析表明，CETP基因上的rsl7237904号SNP位点基因型为A时能够降低高脂血 症的发生；APOB基因上rsl7247263号SNP位点基因型为C时能够降低高脂血症的易感性、延缓动脉粥样 硬化进展程度；LPL基因上rs320号SNP位点基因型为T时能够降低甘油三脂水平，保护个体不受到血脂 异常的危害。这二个SNPs位点的多态性可用于评估个体对高脂血症的易感性，目前已通过中国科学院国 家生物基因检测技术应用评估认证中心的认证。发明内容基于CETP基因上的rsl7237904号SNP位点、AP0B基因上rsl7247263号SNP位点和LPL基因上rs320 号SNP位点的多态性可用于评估个体对高脂血症的易感性的基础上，本发明提供一种检测离脂血症易感性 的试剂盒。该试剂盒包括检测CETP基因SEQ ID NO: 1中第146位SNP的特异性引物对及特异性荧光探针、检 测APOB基因SEQ ID NO: 2中第156位SNP的特异性引物对及特异性荧光探、检测LPL基因SEQ ID NO: 3 中第118位SNP的特异性引物对及特异性荧光探、TaQ酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应 缓冲液、去离亍水。本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对SEQ ID NO: 1中第146位SNP、 SEQ ID NO: 2中第156位 SNP位点和SEQ ID NO: 3中第118位SNP位点而设计，能特异性扩增出SEQ ID NO: 1中包含第146位SNP 位点的DNA片段、SEQ ID NO: 2中包含第156位SNP位点的DNA片段的引物对和SEQ ID NO: 3中第118 位SNP位点的DNA片段。设计这类引物对是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有 SEQ ID NO: 4和5所示序列的引物对、具有SEQ ID NO: 6和7所示序列的引物对以及具有SEQ ID NO: 8 和9所示序列的引物对。特异性引物对可用常规的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发 明的引物不限于这三对引物。本试剂盒中所述的特异性荧光探针是指针对SEQ ID NO: 1中第146位SNP、 SEQ ID NO: 2中第156 位SNP位点和SEQ ID NO: 3中第118位SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这三个 SNPs位点高脂血症易感基因型的探针。设计这类探针是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒 中包含具有SEQ ID NO: 10、 ll和12所示序列的Taqman探针。特异性荧光探针可用常规的合成技术进行 合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的特异性荧光探针不限于这三条探针，所有可用于荧光定量PCR 检测SEQ ID NO: 1中第146位SNP、 SEQ ID NO: 2中第156位SNP和SEQ ID NO: 3中第118位SNP位点 的探针均在本发明范围内。本发明试剂盒的组分和含量包括-ljxl 10 X荧光定量PCR反应缓冲液，0. 25mM dNTP混合液，0.5^1 25mM MgCl2溶液，0.02fil (5units/pl) Taq DNA聚合酶，20nM特异性引物对(六条)各0.225pl，10nM特异性荧光探针(三条)各0.25nl，去离子水4. 28fil。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20'C。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，或按照厂商所建议的条件。实施例l.检测试剂盒的使用 步骤l: DNA模板的抽取 用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。 步骤2:荧光定量PCR反应使用可检测高脂血症易感性的荧光定量PCR检测试剂盒，其中，含有下列引物对和荧光探针有义引物l:5'- AACAGCCAGGTATAGGGAT --3'(SEQ ID NO:4) Tm值为56°C反义引物l:5'-TATACACCAACCTCCTAATC-3'(SEQ ID NO:5) Tm值为56'C有义引物2:5'-TCMTTGGTTACAGGAGGC --3'(SEQ ID NO:6) Tm值为56°C反义引物2:5'-GTATCGTTGMGTTCCTGC --3'頃ID NO:7) Tm值为56°C有义引物3:5'-AGGGTGAGATTCCAAGATAA-3'(SEQ ID NO:8) Tm值为56'C反义引物3:5'-CAAGCAAATGACT薩AGAA -3'(SEQ ID NO: 9) Tm值为56^
荧光探针l: 5' — GGTTCGAGTTAGGGTTCAGATC -3' (SEQ ID NO: 10) Tm值为66°C 荧光探针2: 5' - CCGAGAGACTCTAGMGATACA -3' (SEQ ID NO: 11) Tm值为64'C 荧光探针3: 5， - CGCTATAGGATTTAAAGCTTTTATA -3' (SEQ ID NO: 12) Tra值为64匸有义引物1,反义引物1和荧光探针1特异地针对检测CETP基因上的rsl7237904号SNP位点(SEQ ID NO: 1所示序列中146位)多态性；有义引物2，反义引物2和荧光探针2特异地针对检测AP0B基因上的 rsl7247263号SNP位点(SEQ ID NO: 2所示序列中156位)多态性；有义引物3，反义引物3和荧光探针 3特异地针对检测LPL基因上rs320号SNP位点(SEQ ID NO: 3所示序列中118位)多态性。荧光定量PCR反应体系为总体积10nl，包含浓度为20ng/nl的DNA模板2fxl、 ljd 10 X荧光定量PCR 反应缓冲液、0. IjaI 25mM dNTP混合液、0.5" 25mM MgCh溶液、0.02^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶、 20nM的有义引物1、 2和3各0. 225fU、 20一的反义引物1、 2和3各0. 225^1、 IO一的荧光探针1、 2和 3各0.25nl，去离子水4.28pl。在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50°C、 2分钟，95°C、 10分钟，进行60个循环的 95°C、 30秒，60'C、 l分钟。反应结束后在ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。步骤3: SNP基因型分析将荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量和正常对照相对比，荧光探针1最终的荧光信号明显离于 正常对照，说明被检测DNA的CETP基因上的rsl7237904号SNP位点基因型携带有G型，为高脂血症易感 型；荧光探针2最终的荧光信号明显高于正常对照，说明被检测DNA的APOB基因上rsl7247263号SNP位 点基因型携带有T型，为高脂血症易感型；荧光探针3最终的荧光信号明显高于正常对照，说明被检测DNA 的LPL基因上rs320号SNP位点基因型携带有T型，为高脂血症易感型。实施例2.指导人们主动预防高脂血症的服务目前在上海主健生物工程有限公司已经开展了这项服务。 步骤l: DNA提取对被检测者进行服务前咨询，由被检测者签署知情同意书，填写生活饮食习惯问巻调査表。依照取样 盒中的指示使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，釆用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。 步骤2:基因分型检测使用本发明提供的试剂盒，对被检测者DNA的CETP基因上的rsl7237904号SNP位点、APOB基因上 rsl7247263号SNP位点和LPL基因上rs320号SNP位点同时进行荧光定量PCR检测，确定这三个SNPs位 点的基因型。步骤3:指导人们主动预防高脂血症通过对被检测者SNPs基因型的分析，出具基因分型检测报告和被检测者个体化健康指导报告。基因 检测报告详细说明了被检测者高脂血症易感程度的高低以及患病的概率大小。个体化健康指导报告以被检 测者的基因分型检测结果为基础，结合其生活饮食习惯问巻调査结果，评估被检測者高脂血症遗传易感的 相对风险。同时制定出针对于被检测者的个性化健康行动方案，方案包括在饮食习惯、生活方式上的改进 建议等，并为被检测者普及预防高脂血症的健康知识。
序列表<110>上海主健生物工程有限公司<120〉 一种用于检测高脂血症易感性的试剂盒<歸12<210〉 1<211〉 300 <212〉醒<213>人属，人种(Homo sapiens, human)<400〉 1gggagatgggctgagcggagctgtcatcaccccctcctgacctcgccttcaaggtcaagt60tctttggtgag卿gtcctagctgcattgcaetacagccaggtatagggatttgtgtttgt120ctg卿cccag肪tcactggggttcgagtt鄉gttc柳tctgagccaggtt鄉gggt180tgagtc鄉gggtaaagatt鄉&ggttggtgtatatttggtgttgggggtcactctatg240gcca卿tcaggggttgccatgagctcaggtgacggaggctccatcactg8Ctgttgtgt300<210〉 2<211> 300<212> DNA<213>人属，人种(Homo sapiens, human)〈400> 2gaagcattaaaactgtttttaaggccacagUgcagtgtatctggaaagc60ctaceiggacacc幼肌taaccttaatcatcaattggttacaagttcagca120tctttggctcacatgaaggccaaattccgagEtgactctag肪gat3C3cgagaccg肪tg180tatcaaatggacattcagcagg咖ttCEiacgatacctgtctctggt鄉cc鄉tttat240agcacacttgtcacctacatttctgattggtggactcttgctgcta卿accttactgac300〈210〉 3 〈211〉 300 〈212〉腿〈213〉人属,人种(Homo sapiens, human)<■ 3tcaaaccaac ctcttcaaga agggtgagatcccacccatg tgtacccata aaatgaattatatactaaat gtgctgggat tttgcaaactactctaagU aggattgaca aattatttcttccaagataa tctcaacctg tctccgcagc 60cac卿gatc gctataggat ttaaagcttt 120atagtgtgct gttattgtta atttaaaaaa 180ctttagtcat ttgcttgtat caccaaagaa 240gc肪3ca肪c 83ac338aaa 3aaa3ga333 agstcttggg gatggs犯tg tt3ta38g33 300<210〉 〈211〉 <212> <213><220〉 <223>419DNA人工序列i物<柳> 4幼C3gcc3gg tatsggg3t 19<210> 〈211〉 <212> <213〉520 瞧人工序列〈220><223>引物 <400> 5tatacaccaa cctcctaatc 20<210> <211> <212> <213>619DNA人工序列<220><223〉引物 <400> 6tcaattggtt acaggaggc 19〈210〉 7 <211〉 19 <212> DNA <213>人工序列 〈223>引物 <400> 7gtatcgttga agttcctgc〈210〉 8<211> 20 〈212〉薩 〈213〉人工序列<220><223>引物 <400> 83gggtg柳t tccaagataa〈210> 9<211> 21〈212> DNA <213>人工序列<220〉<223>引物 〈400〉 9<210〉 10 <211> 22 <212> DNA <213>人工序列<220〉<223〉探针 <400> 10ggttcgagtt agggttcaga tc 〈210〉 11
<211> 22 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列<220〉<223>探针 <400> 11ccg8g柳ct ctagaagsta cs 22<210〉 12<211> 25<212〉 DM 〈213〉人工序列〈220><223〉探针 <400> 12cgctatagga tttaaagctt ttata 2权利要求
1. 一种检测高脂血症易感性的试剂盒，包括同时检测CETP基因SEQIDNO: 1中第146位SNP位点、 AP0B基因SEQ ID NO: 2中第156位SNP位点和LPL基因SEQ ID NO: 3中第118位SNP位点的特异性引物 对及特异性荧光探针、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对SEQIDNO: 1中第146 位SNP、 SEQ ID NO: 2中第156位SNP位点和SEQ ID NO: 3中第118位SNP位点而设计，能特异性扩增 出包含SEQ ID NO: 1中第146位SNP位点的DNA片段、包含SEQ ID NO: 2中第156位SNP位点的DNA片 段和包含SEQ ID NO: 3中第118位SNP位点的DNA片段的引物对。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性荧光探针是指针对SEQ ID NO: 1中第 146位SNP、 SEQ ID.NO: 2中第156位SNP位点和SEQ ID NO: 3中第118位SNP位点而设计，能通过荧光 定量PCR技术特异性检测出这三个SNPs位点高脂血症易感基因型的探针。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性引物对选自具有SEQ ID NO: 4和5所 示序列的引物对、具有SEQ ID NO: 6和7所示序列的引物对以及具有SEQ ID NO: 8和9所示序列的引物 对。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性荧光探针选自具有SEQIDNO: 10、 11 和12所示序列的Taqraan探针。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括lul IOX荧光定量PCR反 应缓冲液，0. 25mM dNTP混合液，0.5^1 25mM MgCl2溶液，0.02^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶， 20nM特异性引物对(六条)各0.225nl， 10一特异性荧光探针(三条)各0.25^1,去离子水4.28nl。本 试
全文摘要
本发明公开了一种检测高脂血症易感性的试剂盒。该试剂盒包括同时检测CETP基因SEQ ID NO1中第146位SNP位点、APOB基因SEQ ID NO2中第156位SNP位点和LPL基因SEQ ID NO3中第118位SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针、用于荧光定量PCR检测的常规组件等。本发明的试剂盒通过同时检测分析个体的CETP基因、APOB基因和LPL基因上SNPs位点基因携带型来预测个体对高脂血症的易感性。
文档编号G01N21/00GK101144772SQ20061011609
公开日2008年3月19日 申请日期2006年9月15日 优先权日2006年9月15日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司