专利名称：一种预测2型糖尿病易感性的方法及试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种预测2型糖尿病易感性的方法及试剂，更具体地说是通过测定人TNFRSF9基因多态性预测受试者对于2型糖尿病的易感性，该方法可用于疾病的辅助诊断、治疗和新药开发，属于生物技术领域。
背景技术：
2型糖尿病(T2DM)是一种常见多发的慢性代谢性疾病，受遗传和环境因素的双重影响，具有复杂发病机制，在人群中的患病率约为5％～15％。由于其高比例的大血管并发症，直接导致心、脑血管疾患引起死亡，以及微血管并发症引起的残疾，已经成为全球严重危胁生命和健康的前几位疾病之一，每年为此消耗了大量人力、物力和财力(钱荣立，杨泽，佟之复主编.21世纪的糖尿病防治.河南医科大学出版社，郑州，2000.)。迄今为止，关于T2DM的病因仍然不清，但是即往大量研究表明，T2DM在家系分析、双生子研究均呈现高度遗传一致性(Zimmet P，Alberti KG，Shaw J.Globaland societal implications of the diabetes epidemic.Nature，2001；414782-787.)。遗传因素在发病机制中的重要性得到了很多人群证据的证明，如染色体2q(NIDDM1)位点是墨西哥美国人的相关位点，染色体12q(NIDDM2)是在芬兰人群中发现的，在Pima印第安人中常染色体基因组扫描发现了几个LOD分数较高的染色体区域(3q24，9q21和22q12)(Walker M.Gene detection in type 2 diabetes.International DiabetesMonitor，1998；1014-15)。
目前进行T2DM遗传病因研究，多采用SNPs作为基因组标志的关联分析方法，是有效的，已得到证明(Horikawa Y，Oda N，Cox NJ，et al.Genetic variation in the geneencoding calpain-10 is associated with type 2 diabetes mellitus.Nat Genet，2000；26163-175.)。SNP是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的频率需＞1％，SNPs是双等位基因标记，这种单碱基变化中有70.1％为同型碱基之间的转换如G/A或T/C，29.1％为发生在嘌呤和嘧啶之间的颠换。C(胞嘧啶)是人类基因组中最易发生变化的位点，因为大多数是甲基化胞嘧啶，能够自发脱氨基转换为T(胸腺嘧啶)，SNPs包含了已知多态性的80-90％，是最常见的遗传变异。
由于生存的选择压力导致SNP在单一基因和整个基因组中的分布呈不均匀性。SNPs在基因非编码区的数量是编码区的4倍，总数可达3百万个(Brookes AJ.Theessence of SNPs.Gene，1999；234177-186.)。SNPs以其密度高，平均每1kb就有1个；代表性强，位于基因内部的SNPs可能直接影响蛋白质结构或表达水平；遗传稳定性好，同微卫星多态性比较而言；易于自动化分析，因SNPs在人群中为双等位基因标记，可简单以“+/-或1/0”直接分型，成为很好的遗传标志。(Collins FS，Brooks LD，Chakravarti A.A DNA polymorphism discovery resource for research on human geneticvariation.Genome Res，1998；81229-1231)。
位于染色体1p36的TNFRSF9基因编码肿瘤坏死因子受体超家族组分9的分子蛋白，具有重要的功能，包括促进免疫反应，细胞凋亡和在自身免疫反应中的重要作用。TNFRSF9也称为CD137或ILA，编码255个氨基酸的跨膜蛋白，分为胞外区富半胱氨酸序列；跨膜区和短的氮-端胞桨区含有磷酸化信号传导位点。有限研究指出，当淋巴细胞和单核细胞活化时，刺激启动了TNFRSF9表达，而后TNFRSF9呈现抑制活化T淋巴细胞的增殖并诱异细胞出现程序化死亡的作用。(Schwarz H，BlancoFJ，VonKempis J，et al.ILA，a member of the tumor necrosis factor family，is located onchromosome 1p36，in a cluster of related genes，and colocotizes with several malignancies，Biochem Biophys，Res Commun 1997；235699-703)。由于在T2DM发病机制中存在着低水平的免疫反应，包括IL-6、TNFα、C-反应蛋白和resistin等细胞因子在循环中和病灶发生的表型部位均可检测到。如果病灶发生在肝脏、肌肉和脂肪组织，可以产生胰岛素抵抗，如果病灶发生在胰腺可引致胰岛素分泌量减少(Ferandez-Real JM，RicartW，Insulin resistance and Chronic cardiovascular in flammatory syndrome，Endocr Rev2003；34278-301)。在T2DM中TNFα的机制已得到证明，因此，TNFRSF9作为受体一定在其中发挥重要作用。
经过现有国内外文献检索，未见有TNFRSF9与T2DM相关联的研究报道，也未见TNFRSF9基因多态性位点与T2DM相关联的报道。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种预测2型糖尿病易感性的方法。
本发明的第二个目的是提供一种预测2型糖尿病的试剂，包括PCR引物和含有该引物的试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种预测2型糖尿病易感性的方法，通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的TNFRSF9基因内含子非编码区第91位碱基多态性位点的基因型，预测受试者对2型糖尿病的易感性TNFRSF9基因型为T/T纯合子时，受试者的易感性最低；TNFRSF9基因型为C/C纯合子时，受试者的易感性较高；TNFRSF9基因型为C/T杂合子时，受试者的易感性最高。
本发明提供了一种分离核酸，具有SEQ ID NO1所示的碱基序列，在第91位为C。该核酸序列为TNFRSF9。图1为位于1p36的TNFRSF9基因结构及其多态性变异位点的示意图，附图中包含有8个外显子，rs161810位点标在TNFRSF9基因图中内含子1的相应位置。
本发明提供了一组等位基因特异性的引物，具有SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示的碱基序列，长度为19-22bp，而且可以特异性地扩增出SEQ ID NO1所示序列中第91位的SNP的扩增产物。
本发明提供了一种检测T2DM易感性的诊断试剂盒，其中含有本发明特异性扩增TNFRSF9基因的引物对和用于PCR扩增检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。检测扩增产物与正常TNFRSF9基因第91位SNP相互对比是否存在变异时，所需的化学试剂还包括特异性内切酶等。本发明试剂盒中的全部组分、含量、来源和使用方法如下本发明试剂盒供10人份检测应用，其组分、含量和来源包括60ul 10X PCR缓冲液(Pharmacia)，50ul 10mM dNTP混合液(Pharmacia)，10ul(2unit/ul)Taq DNA聚合酶(Takara)，各12ul(50pmol/ul)F1(SEQ ID NO.2)和R1(SEQ ID NO.3)引物(自制)，1.5ml纯水(自制)，20ul 10X限制酶反应缓冲液(Biolab)，10ul(2unit/ul)限制酶Mn1I(Biolab)。
使用方法1)通过PCR扩增TNFRSF9基因的外显子1和内含子1部分片段，简言之，制备混合液，加入基因组DNA溶液100ng、5ul 10X PCR缓冲液、4ul 10mM dNTP、1.25单位Taq DNA聚合酶和50pmolF1和R1分别为有义引物和反义引物，实施例2叙述的每种引物。接着，加入纯水，使总体积为50ul。反应在95℃0.5分钟，58℃0.5分钟，72℃0.5分钟，进行30个循环。反应完成后，将10ul每种PCR反应液在7.5％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳检测，如扩增了253bp的片段，获得了单一条带，即为扩增成功。
2)通过用限制酶处理PCR反应产物测定TNFRSF9基因5’-非编码区的多态性。往10ul上述扩增的PCR反应产物中加入1ul限制酶反应缓冲液、1ul限制酶Mn1I，并在37℃水浴中消化过夜。之后，在7.5％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳。
3)多态性定型用限制酶Mn1I处理片段，在第91个碱基是T等位基因时，出现151bp和102bp的条带。如为C等位基因时，仅出现253bp一个条带。
本发明的测定方法测定了来源于人的基因组DNA，样品没有限制如，体液(如血液、腹水和尿液)、组织细胞(如肝组织)等。通过提取和纯化这些样品可制备基因组DNA。
从基因组DNA中，可扩增含TNFRSF9基因突变点的DNA片段，以获得用于测定的大量样本。这种通过扩增含TNFRSF9基因突变点的DNA片段获得的样品，特别适于用作测定材料。例如，可按PCR方法，使用引物进行扩增，此引物经合理设计以便仅扩增含TNFRSF9基因多态性的非编码区的部分。这种引物可经常规方法制备。待扩增区的碱基长度不受限制。在一般情况下，碱基长度约100bp至500bp。当按本发明所述制备引物时，可获得适宜的测定样品，其作为扩增的DNA片段，并具有特异性长度。
进行PCR-RFLP方法时，欲扩增的DNA被设计成含有能适用于此后RFLP方法的特异性酶切位点。
对此设计无限制，只要用酶切割DNA区获得的片段长度在突变基因和野生型基因的两种情形中不同。可使用通过TNFRSF9基因的突变产生或丢失的限制酶位点。
因此，根据PCR方法扩增的所需DNA片段，通过上述合理选择的限制酶得以设计。酶切产生的片段通过电泳证实，它们显示特定的条带。根据在上述方法中获得的带型，可测定TNFRSF9基因多态性。
在进行本发明的基因诊断时，优选使用用于测定根据TNFRSF9基因的突变类型存在的诊断试剂，诊断试剂包括作为必要成分的特定试剂，其对应于用于测定TNFRSF9基因突变类型的方法。特定的试剂按采用的测定方法来适当地选择。试剂的特征是，组成测定由TNFRSF9基因定义的突变类型的手段是必要的，如，DNA片段/和/或作为用于测定的特异限制酶。试剂，例如特定制备的用于PCR扩增步骤的引物，该步骤用于包含TNFRSF9基因的突变点的特定扩增片段，不被认为是本发明诊断试剂的必要成分，它们也包含于本发明的诊断试剂之中。
本发明的优点是本发明首次阐明了TNFRSF9基因多态性位点与T2DM的相关性，提供了一种预测T2DM易感性的方法，该方法可用于T2DM的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步叙述，以使公众对发明内容有更深入的了解，并非对本发明的限制。
图1为位于1p36的TNFRSF9基因结构及其多态性变异位点的示意图。
具体实施例方式
用于下列实施例中表示试剂的英文缩写如下。
需要时，用高压锅(120℃，20分钟)灭菌EDTA乙二胺四乙酸二钠SDS十二烷基硫酸钠TE10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA(pH8.0)10×PCR缓冲液100mM Tris-HCl(pH8.3)，500mM KCl，15mM氯化镁(MgCl2)0.01％(W/V)白明胶dNTP脱氧核苷三磷酸甲酰胺颜料95％去离子甲酞胺，0.05％葡聚糖蓝APS过硫酸铵→10×TBETris(108g)，硼酸(55g)，EDTA2Na(9.3g)，溶于纯水中，总体积为1升。
实施例1血液样本收集和基因组DNA的提取按WHO(1999)标准明确诊断入选病例，须经空腹8-12小时口服溶入300ml温水中的75g无水葡萄糖，2小时后检测其血浆葡萄糖值≥11.1mmol/L或者以前经由县市以上级别医院明确诊断的糖尿病患者，共计收集来自黑龙江、北京、大连和银川的无亲缘关系T2DM患者690例，平均年龄49岁±21.2岁，其中男性300例，同地区的健康对照志愿者710例，平均年龄47岁±19.6岁，其中男性325例。所有受检者均为汉族，且签署知情同意书，这一研究也得到了本单位伦理委员会批准。
根据下列方法，用人外周血制备基因组DNA。在抗凝剂EDTA存在下，将收集的10ml人外周血在2500rpm，离心分离30分钟除去血清。接着加入0.2％NaCl溶液，使总体积为50ml。轻轻振荡溶液5-6次，并使其放置于冰上15分钟。此后，在2500rpm离心分离30分钟，借此收集沉淀物。用0.2％的NaCl溶液，以类似于前面的方式再进行洗涤。在如此获得的沉淀物中，加入10mMTris-HCl(pH8.0)和10mM EDTA(4ml)，以悬浮该沉淀物。将10％SDS，25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入悬液中，其加入量分别为4ml、16ul和20ul，接着上下颠倒悬液轻轻混合。然后，在37℃过夜温育悬液。过夜后，加入4ml酚/Tris溶液，上下颠倒混合物混合所得的混合物。以3000rpm进行离心分离10分钟除去水层。将水层和4ml酚/氯仿溶液混合，接着逆混合并以3000rpm离心分离10分钟。除去水层。最后，用氯仿提取两次，以获得水相，往其中加1/10，3M NaAC(pH5.2)，两倍量的冷无水乙醇，使DNA沉淀。用70％的乙醇洗涤以获得基因组DNA。使这样获得的DNA，基因组DNA溶解于TE中，然后定量测定混合物在260nm的吸收率。DNA工作液浓度校正至30ng/ul，置-20℃冰箱保存。
实施例2 SNP的识别确定本发明采用PCR-RFLP和PCR测序技术同时对TNFRSF9基因的内含子1的第91位SNP位点(其等位位点对为T/C)进行检测。
1)引物的确定定位在TNFRSF9基因转录起始点上游启动子区-11bp到内含子1非编码区+242bp，全长253bp，确定了正义链(-11--+8bp)和反义链(222--242bp)特异性引物如下F15′-CAG AAG CCT GAA GAC CAAG～3′(SEQ ID NO2)R15′-TTG AGA TGT AAG TTT GTA TGG～3′(SEQ ID NO3)2)通过PCR扩增TNFRSF9基因的外显子1和内含子1部分片段，简言之，制备混合液，加入上述实施例1制备的基因组DNA溶液100ng、5ul 10X PCR缓冲液、4ul 10mMdNTP、1.25单位Taq DNA聚合酶和50pmol上述步骤1)叙述的每种引物。接着，加入纯水，使总体积为50ul。反应在95℃0.5分钟，58℃0.5分钟，72℃0.5分钟，进行30个循环。反应完成后，将10ul每种PCR反应液在7.5％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳获得了单一的条带，观察在BioRad成像仪，应用Gel Doc 2000程序。
3)通过用限制酶处理PCR反应产物测定TNFRSF9基因5’-非编码区的多态性简言之使用F1和R1分别为有义引物和反义引物进行PCR。结果，扩增了253bp的片段。往10ul上述扩增的PCR反应产物中加入1ul限制酶反应缓冲液、1ul限制酶MnlI，并在37℃消化过夜。此后，在7.5％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳。多态性的测定为用限制酶Mn1I处理片段，在第91个碱基是T等位基因时，出现151bp和102bp的条带。如为C等位基因时，仅出现253bp一个条带。
实施例3 TNFRSF9基因SNP与T2DM的相关统计方法利用STATA8.0和SPSS11.0软件中Pearson卡方检验计算TNFRSF9基因多态性的等位位点，基因型频率，Hardy-Weinberg平衡检测，进行连续校正和单侧渐近概率分析，统计学的显著性水平设定为P＜0.05。采用单因素Logistic回归分析计算T2DM的患病风险OR值及其95％可信区间(CI)。
结果1)健康人TNFRSF9基因多态性分布按实施例1和2的方法测定了710个健康人的基因多态性。584人在第91位碱基有多态性，发现231人有T的纯合子(32.65％)，353人有T和C的杂合子(49.66％)，126人有C的纯合子(17.69％)。
2)T2DM病人TNFRSF9基因多态性分布按实施例1和2的方法测定690个健康人的基因多态性。481人在第91位碱基有多态性，发现136人有T的纯合子(19.70％)，345人有T和C的杂合子(50.00％)，209人有C的纯合子(30.30％)。
3)T2DM病例和健康对照组比较T2DM病例和健康对照组比较其TNFRSF9基因上的rs161810，其等位位点对为T/C多态性的频率分布，详见表1。
表1 TNFRSF9基因rs161810位点的基因型和等位基因频率风险性在T2DM和健康正常人群中的比较样本数 基因型 (％) 等位基因(％)C/C C/T T/TCT2型DM人 690 209 30.30 345 50.00 136 19.70 763 55.30 617 44.70正常人 710 126 17.69 353 49.66 231 32.65 604 42.53 816 7.48P (df＝2)0.0001 0.0026(df＝1)OR(95％CI) 2.458(1.345-4.492)表1可见，TNFRSF9基因第91位的常见SNP位点(rs161810)的A等位位点，即在其DNA互补链上为T等位位点，当突变为C，互补链上为G时，在患者群体中的分布频率大大高于在健康正常人群中的频率，相差约12％，有显著性差别(P＝0.0026)。而且OR值反映突变位点C的频率在T2DM中高出正常人2.46倍，95％CI下限＞1，均表明这是T2DM患病的一个较高风险的等位基因。与T2DM显著相关的SNP(rs161810)位点，位于内含子1靠近外显子1的剪切点侧，可能通过影响DNA的空间结构，从而，这一突变位点影响DNA的转录和剪切。
实施例4检测试剂盒制备检测T2DM相关风险的试剂盒，包含有可扩增出TNFRSF9基因SNP(rs161810)位点的引物对，及其PCR-RFLP相应试剂，成分和含量如下，于-20℃保存60ul 10X PCR缓冲液(Pharmacia)，50ul 10mM dNTP混合液(Pharmacia)，10ul(2unit/ul)Taq DNA聚合酶(Takara)，各12ul(50pmol/ul)F1(SEQ ID NO.2)和R1(SEQ ID NO.3)引物(自制)，1.5ml纯水(自制)，20ul 10X限制酶反应缓冲液(Biolab)，10ul(2unit/ul)限制酶MnlI(Biolab)。
本发明具有实用性的例证1)本发明的TNFRSF9基因多态性的检测方法可用于分析人常染色体1p36区的TNFRSF9基因上的常见SNP(rs161810)的T等位位点，即在其DNA互补链上为A等位位点，应用在对T2DM的辅助性诊断和对个体是否有多大的T2DM患病风险进行评估。以利于开展T2DM的早期干预和治疗。
2)利用本发明阐述TNFRSF9基因第91位碱基变异，作为生物标志物之一，可用作药物设计的分子靶标的筛选，以帮助寻找具有调节TNFRSF9表达的活性分子，促进T2DM新药开发。
3)本发明建立的检测TNFRSF9基因多态性的核酸序列和T2DM相关位点，可高灵敏度，特异性地应用于T2DM基因诊断用的试剂盒。
如上所述，得出结论，TNFRSF9基因在第91位碱基的多态性与T2DM具显著相关性。因此，根据本发明，测定此多态性可用于进行基因诊断。
本发明叙述了TNFRSF9基因T2DM相关的新突变点，并提供了一种测定TNFRSF9基因多态性的方法。而且，根据本发明，只需要少量DNA样品就足以测定TNFRSF9基因的多态性。结果，本发明提供了一种测定T2DM相关基因多态性的基因诊断方法。
序列表<110>卫生部北京医院<120>一种预测2型糖尿病易感性的方法及试剂<130>
<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2116<212>DNA<213>人属，人种(Homo sapiens，human)<400>1agaccaagga gtggaaagtt ctccggcagc cctgagatct caaggtctgt ccatctgggg 60gagtgggtgg gggcactgag aaggggtgag cttggaactt ttgctccctt tgcccatttc120tagacttttt ctcctaatat gtaataactt ctcttcaata gccctttaaa taaacatcaa180taacttagcc tgaagagttt ttcactcctt agttttgtta ccatacaaac ttcacatctc240aaaacatgtc tctgtttaag aaaatgtgtt agtgagttga acagggaggt ctttccacat300gttagtagtt aggtgttcag ctaaaggggg aagagtgatt atgtgatagc ttcttcttga360
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<210>2<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>2cagaagcctg aagaccaag 19<210>3<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>3ttgagatgta agtttgtatg g 2权利要求
1.一种预测2型糖尿病易感性的方法，其特征在于该方法通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的TNFRSF9基因内含子非编码区第91位碱基多态性位点的基因型，预测受试者对2型糖尿病的易感性TNFRSF9基因型为T/T纯合子时，受试者的易感性最低；TNFRSF9基因型为C/C纯合子时，受试者的易感性较高；TNFRSF9基因型为C/T杂合子时，受试者的易感性最高。
2.一种分离核酸，具有序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列，在第91位为C。
3.一组预测2型糖尿病易感性的引物，其长度为19～22bp，能特异性地扩增出含TNFRSF9基因的SEQ ID NO.1所示序列中的第91位SNP的扩增产物，具有序列表SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的碱基序列。
4.一种预测2型糖尿病易感性的试剂盒，其特征在于，含有权利要求3所述的引物序列和以下试剂，包括60ul 10X PCR缓冲液，50ul 10mM dNTP混合液，10ul(2unit/ul)Taq DNA聚合酶，各12ul(50pmol/ul)F1和R1引物，1.5ml纯水，20ul 10X限制酶反应缓冲液，10ul(2unit/ul)限制酶Mn1I；本试剂盒供10人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
全文摘要
本发明公开了一种预测2型糖尿病易感性的方法，通过提取宿主细胞基因组DNA，测定受试者的TNFRSF9基因内含子非编码区第91位碱基多态性位点的基因型，预测受试者对2型糖尿病的易感性TNFRSF9基因型为T/T纯合子时，受试者的易感性最低；TNFRSF9基因型为C/C纯合子时，受试者的易感性较高；TNFRSF9基因型为C/T杂合子时，受试者的易感性最高。本发明中TNFRSF9基因的单核苷酸多态性(SNP)具有SEQ ID NO.1所示的核酸序列的位于1p36区域定位在内含子1非编码区第91位(rs161810)位点上的C碱基替换，是与2型糖尿病发病相关的高风险位点之一。本发明的优点是首次阐明了TNFRSF9基因多态性位点与T2DM的相关性，提供了一种预测T2DM易感性的方法，该方法可用于T2DM的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。
文档编号C12N15/11GK1710106SQ200510080248
公开日2005年12月21日 申请日期2005年6月30日 优先权日2005年6月30日
发明者杨泽, 纪立农, 蔡晓凌, 孙宏, 唐雷, 史晓红, 朱小泉, 孙亮, 屈彦纯, 张宁 申请人:卫生部北京医院