专利名称：一种转基因烟草检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种转基因烟草检测方法及试剂盒，尤指包括适用于各类烟草及其制品的DNA提取、定性检测、定量检测、目的基因检测方法及试剂盒，属于植物分子生物学领域。
背景技术：
近年来植物转基因研究进展十分迅速，在植物抗病、抗虫、抗除草剂和改变植物的某些成份等方面已得到了不少转基因植株，有的已成了品系，为提高作物产量、抗逆能力、改进品质、加快育种进程、降低生产成本等提供了一条诱人的全新途径。目前，不少转基因作物已进入了商业应用。面对转基因产品出现，世界各国都加强了对此类产品检测的研究，成立了转基因产品的专门检测机构和公司，并制定相应标准对市售转基因产品进行规范。
烟草作为分子生物学研究的一种模式植物，其种植在我国曾经一度泛滥。由于缺少有效的检测转基因烟草的方法，我国生产的烟叶在出口过程中受到种种贸易壁垒的限制，蒙受了巨额损失。不仅如此，对于进口烟叶和卷烟的转基因情况也无法进行有效监测，难以保障我国消费者的权利。因此，开发一种有效的转基因烟草的检测方法成为了检验检疫工作的重要课题。
国内已有的检测方法包括烟苗的GUS酶染色、卡那霉素筛选、CAT基因检测及插入基因的PCR检测等，由于这些方法都是从验证转基因是否成功的角度出发，因此存在很多问题，如检测结果不稳定，检测面窄(只能对鲜组织和已知样品)，检测时间长等等。国外的众多实验室普遍采用PCR技术进行转基因烟草检测，但各个实验室在检测方法和结果确认上存在很大差异，应用不同的检测标志、检测体系、检测条件和检测水平，缺乏统一的、标准化的检测方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一套完整、快速、准确、灵敏、可标准化的转基因烟草检测方法。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种使用方便、灵敏度高的转基因烟草检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种转基因烟草检测方法，包括(一)巢式PCR定性检测获得可用于PCR反应的样本DNA，同时检测样本的花椰菜花叶病毒启动子序列CaMV 35s、根癌农杆菌终止子序列nos和抗卡那霉素选择基因序列NPT II，引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.12所示；对检出为转基因阳性的样本，进一步采用(二)荧光实时PCR定量检测采用花椰菜花叶病毒启动子调控序列CaMV 35s通用引物和荧光标记探针，测定样本的荧光强度，矫正Ct值；并代入用梯度稀释的阳性对照得到的标准曲线方程，计算得出样本中转基因的量；CaMV 35s定量检测的引物和探针的核苷酸序列见序列表SEQ ID No.13至SEQ ID No.15；及(三)目的基因PCR检测采用烟草马铃薯Y病毒复制酶基因、烟草马铃薯Y病毒外壳蛋白基因(PVY-CP)、烟草普通花叶病外壳蛋白基因(TMV-CP)、烟草黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因(CMV-CP)、烟草普通花叶病复制酶基因(TMV54KD)、苏云金杆菌杀虫蛋白BT-cryIA(c)基因的PCR扩增引物，对定性检测为阳性的样本进行目的基因扩增，测定样本所转入基因的种类，引物的核苷酸序列见序列表SEQ ID No.16至SEQ ID No.27。
本发明定性检测使用的基因标志是目前几乎所有的转基因烟草都含有的花椰菜花叶病毒启动子序列(CaMV 35s)、根癌农杆菌终止子序列(nos)和抗卡那霉素选择基因序列(NPT-II)，通过对三者同时进行检测，可实现对绝大多数转基因烟草及其产品的定性测定，准确率高于99％。
DNA样本的获取可采用常规的方法，但通过研究，我们发现由于待检样品来源广泛，烤后的烟叶、卷烟和薄片等产品经过加工后DNA降解严重，不利于提取总DNA，采用改良的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取样品DNA能够解决这些问题，带来更优异的提取效果。
本发明进一步研究出确定DNA的可用性的优异方法，采用烟草硝酸还原酶基因序列扩增与260nm-280nm紫外波长扫描联用，克服常规方法仅进行260nm-280nm紫外波长扫描造成的检测结果信度较差的不足。烟草硝酸还原酶基因是烟草基因组(内源基因)拷贝数与CaMV 35s(外源基因)相近的烟草硝酸还原酶基因作为参照，通过烟草硝酸还原酶基因PCR扩增信号的情况来判定提取的DNA是否可以用于PCR检测。烟草硝酸还原酶基因序列的扩增引物如序列表SEQ ID No.28至SEQ ID No.29所示。
为了增加反应的特异性，本发明的定性检测采用巢式PCR，两对引物的互补序列极少，降低了扩增出多个靶位点的可能。我们针对CaMV 35S、nos调控序列和NPT-II选择基因，分别设计并筛选到最佳的外侧引物对和内侧引物对，先用外侧引物对进行第一轮PCR扩增，再以第一轮PCR的扩增产物为模板，用内侧引物对进行第二轮PCR扩增。各引物的长度为20至26bp，GC含量为40％到60％，具有很好的特异性，核苷酸序列见序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.12。
内标准模板的制备及应用确保了定性PCR检测的准确性我们采用引物重叠延伸法分别在CaMV 35S启动子、根癌农杆菌nos终止子调控序列和NPT-II选择基因的检测内侧引物扩增片段中间插入了40bp的核苷酸序列，作为三个检测标记的内标准模板。定性检测过程中，将内标准模板按一定的量(10-50拷贝)加入到每个待测样品的PCR反应液中，同时进行PCR反应。内标准模板有特异性扩增产物消除了PCR过程中内在及外在因素对待测样品检测结果的影响，从而确保了检测结果的准确性。
研究中我们发现，退火温度是影响PCR反应效率的一个重要参数，在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。对于我们所设计的引物序列和目的基因序列，通过Tm值(解链温度)计算设计最佳的退火温度(我们设计的引物一般为64℃)，低于或者高于该温度都会造成扩增效率或者特异性下降，不利于PCR扩增。
本发明对经定性检测为转基因阳性的样品采用实时荧光定量PCR法定量检测，通过实时荧光PCR法测定其35S启动子的拷贝数来对转基因的量精确测定。实时荧光PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于应用了荧光探针，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，克服了常规PCR的许多缺点。本发明选择CaMV 35s启动子序列作为荧光定量检测的标志，探针实时荧光定量检测引物序列和探针序列见序列表SEQID No.13至SEQ ID No.15，探针的5’以荧光报告基团FAM标记，3’以荧光淬灭基团TAMRA标记。
通常的定量测定中，很难保证每个待测DNA样品的纯度及加入DNA模板量一致，以致影响扩增，即Ct值。为减少这些影响，取得更佳的检测效果，本发明设计了内标准NR引物烟草硝酸还原酶基因以消除误差。定量检测的同时，也对各样品的烟草硝酸还原酶基因序列进行扩增，利用35S启动子序列扩增的Ct值与NR引物序列扩增的Ct值之间的差异(ΔCt)作为样品的Ct值，从而消除误差。烟草硝酸还原酶基因的引物序列和探针序列见序列表SEQ ID No.30至SEQ ID No.32，探针的5’端以荧光报告基团TET标记，3’端以荧光淬灭基团TAMRA标记。
自1997年我实验室承担中国烟草进出口转基因检测任务以后，我们对来源于国内外的烟叶、卷烟等样品检测时发现的阳性样品进行了目的基因验证，主要为以下几种基因烟草马铃薯Y病毒复制酶基因，烟草马铃薯Y病毒外壳蛋白基因(PVY-CP)，烟草普通花叶病外壳蛋白基因(TMV-CP)，烟草黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因(CMV-CP)，烟草普通花叶病复制酶基因(TMV54KD)，苏云金杆菌杀虫蛋白BT-cryIA(c)基因。通过国内调查及国外咨询，利用烟草作为模式植物而进行的转基因研究很多，但只有这几种转基因烟草在田间曾经有小量的试验或种植。其PCR检测引物见序列表SEQ ID No.16至SEQ ID No.27。
本发明所述的检测转基因烟草的方法不仅能实现定性测定，同时还能精确定量，另外还能快速检测出目的基因，结果准确可靠，操作规范化，便于推广。2003年7月，由国际12个转基因烟草检测机构参加的CORESTA转基因烟草定量检测共同实验中，我实验室利用本项优化的转基因烟草检测方法，取得了检测结果统计Z值(Z-Score)第1名的优异成绩，其检测精度已达到0.05％，检测结果可靠性居行业国际先进水平，证明我实验室开发的转基因烟草荧光PCR定量检测技术，具有灵敏度高，结果稳定可靠的特点。1998年我们通过目的基因的检测，找出了当时在我国有相当规模种植的转TMV-CP和Bt-cryIA(c)基因烟草种子及来源，为解决我国转基因烟草问题及我国烟叶的出口创汇作出重大贡献。
根据本发明的原理，我们同时开发出了一种检测转基因烟草的试剂盒，该试剂盒由定性检测试剂、定量检测试剂和目的基因检测试剂组成定性检测试剂所使用的检测标志由CaMV 35S、nos调控基因和NPT-II选择标记基因组成，其PCR定性检测扩增引物的核苷酸序列见序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.12；定量检测试剂使用的检测标志由CaMV 35S和烟草硝酸还原酶基因组成，其定量检测扩增引物和探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.13至SEQ ID No.15和SEQ ID No.30至SEQ ID No.32；目的基因检测试剂使用的检测标志由烟草马铃薯Y病毒复制酶基因、烟草马铃薯Y病毒外壳蛋白基因、烟草普通花叶病外壳蛋白基因、烟草黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因、烟草普通花叶病复制酶基因、苏云金杆菌杀虫蛋白BT-cryIA(c)基因组成，其检测扩增引物核苷酸序列见序列表SEQ ID No.16至SEQ ID No.27。
为了获得较好的DNA样本，所述定性检测试剂中还可以加入烟草硝酸还原酶基因序列，其扩增引物如序列表SEQ ID No.28至SEQ ID No.29所示。
所述定性检测试剂、定量检测试剂和目的基因检测试剂由以下组分构成组分I 反应液组分IIEx-Taq DNA聚合酶组分III 定性、定量及目的基因检测引物组分IV各种对照样品及标准样品其中组分I含有100ul 10X Ex-Taq DNA聚合酶buffer，0.2m摩尔dNTPs，合计40ul，770ul超纯水；组分II Ex-Taq DNA聚合酶，每个反应加入0.25ul；组分III为各种检测引物冻干粉，使用浓度为10pmol/ul；组分IV为对照样品，包括定性检测内标准模板对照、定量检测标准样品、目的基因检测阳性对照及阴性DNA对照。所有阳性对照均可充当定性检测阳性对照，目的基因检测阳性对照为分别含有各种目的基因阳性材料，检测时根据检测性质选择合适的对照样品。阴性DNA对照为不含有转基因成分的烟草DNA提取样品。
所述定量检测标准样品为转烟草普通花叶病外壳蛋白基因烟草与阴性样品按百分配比制成，分别含有0.1％、0.5％、1％、2％、5％转基因成分的烟草DNA提取样品。
组分I和组分II为定性检测、定量检测及目的基因检测的通用试剂。使用过程中，对于不确知是否含有转基因成分的烟草或其产品进行检测时一般先做定性检测，然后再针对阳性样品测定转基因成分的含量(定量检测)，最后再测定目的基因种类(目的基因检测)。
本发明的优点是本发明通过多年的实验摸索，建立起一套完整的转基因烟草检测流程，涉及到DNA降解严重的烤后烟叶、卷烟、薄片等的DNA提取方法，稳定灵敏的PCR扩增体系和条件(检测精确度可以达到0.001％阳性含量的转基因烟草)，以及实用的实时性荧光定量PCR检测体系。多年的国内外贸易烟叶及制品的转基因检测工作证明了这一套烟草转基因检测方法的优越性，重复性好，可靠性高，检测费用低，省时省力。本发明所述的试剂盒，灵敏度高、特异性强、操作简便，便于实现转基因烟草检测的规范化。
图1为烟草转基因检测流程2为烟草硝酸还原酶基因序列扩增结果1-3为鲜烟叶样品，4-6为烤后烟叶样品；7-10为卷烟样品图3为第二轮PCR检测结果图泳道1为PCR Marker；2为0.1％；3为0.05％；4-6为0.01％；7-9为0.005％；10-12为0.001％；13-15为阴性；16为PCR对照；17为阳性对照图4为待测样品及标准物质35S启动子序列实时PCR扩增曲线图，纵轴为吸收的荧光信号值，横轴为PCR扩增循环数。
图5为待测样品及标准物质内源基因(硝酸还原酶基因)实时PCR扩增曲线图，纵轴为吸收的荧光信号值，横轴为PCR扩增循环数。
图6为ΔCt值与不同转基因烟草成分含量的标准曲线7为未知阳性样品的目的基因验证PCR结果图1-6为待测样品6种目的基因扩增结果；7-12为6种目的基因扩增阴性对照；13为PCR对照；目的基因扩增顺序如下烟草马铃薯Y病毒复制酶基因，PVY-CP，TMV-CP，CMV-CP，TMV54KD及BT-cryIA(c)基因。
具体实施例方式
实施例1、提取样本DNA一.材料1.鲜烟叶和幼苗来源于黑龙江省烟草科学研究所田间烟株和室内种子发芽培养；2.烤后烟叶取自烟草公司收购的烘烤后烟叶3.卷烟样品来源于各卷烟进口口岸公司及市场4.薄片来源于烟厂5.所有试剂购自于北京天象仕达公司二.方法(一)改良CTAB法提取DNA取100mg鲜烟叶或幼苗液氮研磨后的粉末，加入100ul 2倍CTAB提取缓冲液，充分混匀后在65℃中水浴10min。加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1，v/v)，混匀后在12000g离心4min。(对于烤后烟叶、卷烟及薄片向内盛待测样品的1.5ml离心管中，加入700ul0.75倍CTAB抽提缓冲液，振荡混匀后，65℃的恒温水浴10min。加700ul氯仿/异戊醇(24∶1，v/v)，混匀12000g离心5min)取上清液，加1/10体积的10％CTAB提取缓冲液，加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1，v/v)，混匀在12000g离心4-5min。取上清，加等体积CTAB沉淀缓冲液，混匀15000g下离心8min。去上清，沉淀加100ul高盐TE，65℃水浴10min。加入二倍体积的冷无水乙醇(-20℃冰箱贮存)，-40℃冷置30min。15000g离心8min，沉淀溶于70ul超纯水中备用(-20℃冰箱贮存)。
(二)评价DNA质量和纯度1.DNA产量和纯度应用260nm 280nm紫外波长扫描进行测定。
2.烟草硝酸还原酶基因序列扩增确定所提取DNA的可用性如果扩增得到了烟草硝酸还原酶基因的特异性扩增产物，说明提取的DNA中含有足够长的片段，则可用；否则，即使260nm-280nm紫外波长扫描测得的DNA浓度、纯度较好也不可以应用，原因是DNA降解严重或其中含有影响PCR反应的杂质。必须重新提取。
三、结果见表1及图2。
表1提取DNA产质量测定
结果表明，按照本发明方法得到的各种类型烟草的DNA样本均可用于PCR检测。
实施例2、转基因烟草定性检测一.材料实验设计了16个样品，11个阳性样品(阳性含量0.1％1个，0.05％1个，0.01％3个，0.005％3个，0.001％3个)，3个阴性对照，1个PCR对照，1个阳性对照(阳性含量为0.1％)，阳性材料和阴性材料均来源于中国烟草进出口烟叶检测站。按实施例1进行DNA提取和验证，所有生物试剂来源于北京天象仕达公司，引物由大连宝生物技术有限公司合成。
二.方法
(一)PCR扩增体系(每管的组分浓度、体积如下，总体积50ul)Ex-Taq酶10×buffer5uldNTPs 0.2mM引物1(上游引物) 20pmol引物2(下游引物) 20pmolEx-Taq酶 1u超纯水37-38ulDNA模板*0.2-3ul(60-600ng)“*”DNA模板第一轮PCR扩增加样量，第二轮(巢式PCR)为1ul稀释100倍的第一轮PCR扩增产物。
(二)第一轮及第二轮PCR扩增条件如下95℃下5min 72℃5min三.结果实验结果见图3。0.005％阳性含量以上的样品均可见特异扩增条带，0.001％阳性含量的3个样品中有2个样品可见特异性条带，另一个没有扩增到产物。在实际检测工作中，应用所建立起来的巢式PCR体系，对于0.005％以上阳性含量的样品基本上检测率都是100％。而0.001％以及低于0.001％阳性含量的样品检测的准确率很不稳定。所以，一般情况我们在25ul的PCR扩增体系中加入200-300ng的模板，将巢式PCR反应的阳性标准设置为0.005％，检测阈值定在0.001％。
实施例3、转基因烟草定量检测一.材料1.荧光定量PCR仪为美国MJ公司的OPTICONII，2.实验标准样品含有0.1％，0.5％，1％，2％，5％，0％转基因成分(由英国政府化学家实验室提供)，采用100％阴性样品和100％阳性样品按比例配制。
3.待测样品A，B，C，D，E，F，G由本实验室自行配制，H为阴性对照。
4.CaMV 35S和烟草硝酸还原酶基因扩增引物和探针引物由大连宝生物技术有限公司合成。
二.方法(一)PCR扩增体系(每管的组分浓度、体积如下，总体积50ul)10×buffer5uldNTPs 0.2mM引物1(上游引物) 20pmol引物2(下游引物) 20pmolTaqman探针20pmolEx-Taq酶 1u超纯水37-38ulDNA模板*0.2-3ul(60-600ng)(二)PCR扩增条件95℃下7min
三.结果 表2.待测样品的35S荧光定量PCR检测结果
各样品的实时检测曲线图见图4。从图5的内源基因扩增曲线图可以看出，按照样品DNAOD值统一模板量后，每个反应管中的模板差异很小，每管反应内源基因扩增曲线的CT值接近。在标准曲线图中标准曲线公式为Y＝-0.20X+6.3，R2＝0.986，R为线性系数。根据公式XN＝X0(1+Ex)N，X0代表初始模板量N代表循环数Ex代表扩增效率。根据软件给出标准物质的标准曲线方程Y＝AX+B，经过数学推算，可以从A值算出PCR反应的扩增效率。该反应的扩增效率为58.78％。据内源基因和外源基因的扩增Ct值算出每个样品的ΔCt值(ΔCt＝ΔCt35S-ΔCtNR)，这样0.1％，0.5％，2％，5％的样品对应的ΔCt值为14.884，12.375，10.011，8.765。通过这些数据得出方程Y＝-0.2778X+3.1347.R2＝1，其中X为ΔCt值，Y为logGMO％，R为线性相关系数，再以ΔCt值为横坐标，以logGMO％为纵坐标，做ΔCt值与不同转基因烟草成分含量的标准曲线(图6)，利用这一标准曲线，通过待测样品的ΔCt值得出Y值，从而算出样品的转基因含量，尽管标准曲线的作图范围是0.1％-5％，因为图形呈线性相关，所以可用于计算范围外的样品含量。通过计算样品的ΔCt值得出Y值，从而算出样品的转基因含量(表2)其检测范围是0.1％-5％，因为图形具有线性所以可以根据其趋势算出其范围外的样品。
四.结论本发明定量检测方法的精度最高能够达到0.05％，检测结果灵敏度高、稳定可靠。
实施例4、转基因样品的目的基因检测选一经实施例2方法检测为阳性的样品进行目的基因检测，PCR扩增方法、体系设计同实施例2。PCR结果见图71-6为待测样品6种目的基因扩增结果7-12为6种目的基因扩增阳性对照；13为PCR对照。目的基因扩增顺序如下烟草马铃薯Y病毒复制酶基因，PVY-CP，TMV-CP，CMV-CP，TMV54KD及BT-cryIA(c)基因。检测结果样品为转CMV-CP基因的烟草材料。
实施例5、转基因烟草检测试剂盒一.组分所述定性检测试剂、定量检测试剂和目的基因检测试剂由以下组分构成组分I 反应液组分II Ex-Taq DNA聚合酶组分III定性、定量及目的基因检测引物组分IV 各种对照样品及标准样品其中组分I含有100ul 10XEx-Taq DNA聚合酶buffer，0.2m摩尔dNTPs，合计40ul，770ul超纯水；组分II Taq DNA聚合酶，每个反应加入1.5ul相当于100-250ng；组分III为各种检测引物冻干粉，使用浓度为10pmol/ul；组分IV为对照样品，包括定性检测内标准模板对照、定量检测标准样品、目的基因检测阳性对照及阴性DNA对照。所有阳性对照均可充当定性检测阳性对照，目的基因检测阳性对照为分别含有各种目的基因阳性材料。阴性DNA对照为不含有转基因成分的烟草DNA提取样品。
二.试剂盒使用方法规格试剂盒在-20℃以下保存，低温冷冻运输。使用过程中根据检测需要，分别选用不同的检测引物和对照样品用于定性检测的引物包括CaMV 35S启动子、nos终止子调控序列和NPT-II选择基因的外侧和内侧PCR扩增引物；用于定量检测的引物物包括CaMV 35S启动子定量检测引物和NR内标定量检测引物及Taqman探针；用于目的基因检测的引物包括烟草马铃薯Y病毒复制酶基因、PVY-CP、TMV-CP、CMV-CP、TMV54KD、BT-cryIA(c)基因扩增序列引物。
试剂盒中的参比对照包括阳性含量为0.1％、0.5％、1％、2％、5％阳性标准样品和0％的阴性标准样品及内标准模板。定性检测加内标准模板，并选择阳性含量为0.1％和0％的标准样品作为阳性和阴性参比对照；定量检测使用0.1％、0.5％、1％、2％、5％阳性标准样品和0％的阴性标准样品。
(一)定性检测方法第一轮PCR扩增每个反应取22.75ul组分I、0.25ul组分II、各0.25ul的外侧定性检测引物、1.0ul(100-250ng)的DNA模板和0.5ul内标模板(10-50拷贝/反应)，进行25ul反应体系的PCR扩增。
第二轮PCR扩增同上每个反应取22.75ul组分I、0.25ul组分II、0.25ul相对应的内侧引物、和1ul第一轮PCR反应产物的1％稀释液，进行第二轮PC扩增，PCR扩增条件见实例3。
(二)定量检测方法在荧光定量PCR管中，按每个反应加22.75ul组分I、0.25ul组分II、DNA模板150ng、耙序列和内标序列扩增引物及探针各10pmol扩增体系配置反应液，在荧光定量PCR仪中进行扩增。定量检测方法见实例4。
(三)目的基因检测将0.25ul组分II加入到22.75ul组分I中，同时加入各0.25ul的一对目的基因检测引物及1.5ulDNA模板(100-250ng)。PCR扩增条件同实施例4。
序列表<110>黑龙江省烟草科学研究所<120>一种转基因烟草检测方法及试剂盒<130>
<160>20<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CaMV 35S启动子定性检测的外侧引物序列<400>1ctacaaatgc catcattgcg20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CaMV 35S启动子定性检测的外侧引物序列<400>2gggtcttgcg aaggatagtg20<210>3
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CaMV 35S启动子定性检测的内侧引物序列<400>3acagtggt cc caaagatgga20<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CaMV 35S启动子定性检测的内侧引物序列<400>4gatagttggg attgtgcgtc a21<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>nos终止子定性检测的外侧引物序列<400>5gattgaatcc tgttgccggt20<210>6
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>nos终止子定性检测的外侧引物序列<400>6gtaacataga tgacaccgcg20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>nos终止子定性检测的内侧引物序列<400>7gaatcctgtt gccggtcttg20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>nos终止子定性检测的内侧引物序列<400>8cccatctcat aaataacgtc20<210>9
<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NPT II基因定性检测的外侧引物序列<400>9gccctgaatg aactgcagga cgaggc26<210>10<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NPT II基因定性检测的外侧引物序列<400>10gcaggcatcg ccatgggtca cgacga26<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NPT II基因定性检测的内侧引物序列<400>11acgggcgttc cttgcgcagc t21<210>12
<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NPT II基因定性检测的内侧引物序列<400>12gatcctcgcc gtcgggcatg c21<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CaMV 35S启动子实时荧光定量检测的引物序列<400>13gtcttgcgaa ggatagtggg a21<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CaMV 35S启动子实时荧光定量检测的引物序列<400>14cacgtcttca aagcaagtgg a21<210>15
<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CaMV 35S启动子实时荧光定量检测的探针引物序列<400>15tgcgtcatcc cttacgtcag tggagat 27<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>烟草马铃薯Y病毒复制酶基因序列PCR扩增引物<400>16gaggcagagg cattcttcag20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>烟草马铃薯Y病毒复制酶基因序列PCR扩增引物<400>17gcagtgaacg tcctcgtctt 20<210>18
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>烟草马铃薯Y病毒外壳蛋白序列PCR扩增引物<400>18cagtgcggat ggcatacgac 20<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>烟草马铃薯Y病毒外壳蛋白序列PCR扩增引物<400>19atcctcggtg gtgtgcctct 20<210>20<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>烟草普通花叶病外壳蛋白基因(TMV-CP)PCR扩增引物<400>20gtgttcttgt catcagcgtg ggc 23<210>21
<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>烟草普通花叶病外壳蛋白基因(TMV-CP)PCR扩增引物<400>21caccgttgcg tcgtctactc tacg 24<210>22<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>烟草黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因(CMV-CP)PCR扩增引物<400>22acccaacctt tgtagggagt gagcg 25<210>23<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>烟草黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因(CMV-CP)PCR扩增引物<400>23acatagcaga gatggcggca acg 23<210>24
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>烟草普通花叶病复制酶基因(TMV54KD)PCR扩增引物<400>24gagttgtctg gcatcattga 20<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>烟草普通花叶病复制酶基因(TMV54KD)PCR扩增引物<400>25acaatggtca aagccgggta 20<210>26<211>21<212>DNA7<213>人工序列<220>
<223>苏云金杆菌杀虫蛋白BT-cryIA(c)基因PCR扩增引物<400>26tcccatcgac atctccttgt c 21<210>27
<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>苏云金杆菌杀虫蛋白BT-cryIA(c)基因PCR扩增引物<400>27gcggagagct gggttagtag g 21<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>烟草硝酸还原酶基因序列的扩增引物<400>28gtgtcatgaa cagatggctc20<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>烟草硝酸还原酶基因序列的扩增引物<400>29gattactcgt cgagtgaaga 20<210>30
<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>烟草硝酸还原酶基因实时荧光定量检测的扩增引物序列<400>30tgtcatgaac agatggctct aactct26<210>31<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>烟草硝酸还原酶基因实时荧光定量检测的扩增引物序列<400>31taccttgatt actcgtcgag tgaaga26<210>32<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>烟草硝酸还原酶基因实时荧光定量检测的探针序列<400>32attccctttt ttaatcattt gaaggtactc atttttttcg40
权利要求
1.一种转基因烟草检测方法，其特征在于(一)巢式PCR定性检测获得可用于PCR反应的样本DNA，同时检测样本的花椰菜花叶病毒启动子调控序列CaMV 35s、根癌农杆菌终止子调控序列nos和抗卡那霉素选择标记基因序列NPT II，引物的核苷酸序列见序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.12；对检出为转基因阳性的样本，进一步采用(二)荧光实时PCR定量检测采用花椰菜花叶病毒启动子调控序列CaMV 35s通用引物和荧光标记探针，测定样本的荧光强度，矫正Ct值；并代入用梯度稀释的阳性对照得到的标准曲线方程，计算得出样本中转基因的量；CaMV 35s定量检测的引物和探针的核苷酸序列见序列表SEQ ID No.13至SEQ ID No.15；及(三)目的基因PCR检测采用烟草马铃薯Y病毒复制酶基因、烟草马铃薯Y病毒外壳蛋白基因、烟草普通花叶病外壳蛋白基因、烟草黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因、烟草普通花叶病复制酶基因、苏云金杆菌杀虫蛋白BT-cryIA(c)基因的PCR扩增引物，对定性检测为阳性的样本进行目的基因扩增，测定样本所转入基因的种类，引物的核苷酸序列见序列表SEQID No.16至SEQ ID No.27。
2.根据权利要求1所述的一种转基因烟草定量检测方法，其特征在于所述获得可用于PCR反应的样本DNA是采用改良的十六烷基三甲基溴化铵法提取得到的；采用烟草硝酸还原酶基因序列扩增与260nm-280nm紫外波长扫描联用，确定其可用性；所述烟草硝酸还原酶基因序列的扩增引物如序列表SEQ ID No.28至SEQ IDNo.29所示。
3.根据权利要求1所述的一种转基因烟草定量检测方法，其特征在于所述矫正CT值是指在荧光实时PCR定量检测过程中，通过同时对烟草硝酸还原酶基因序列进行扩增，利用CaMV 35s序列扩增的Ct值与烟草硝酸还原酶引物序列扩增的CT值之间的差异ΔCT作为样品的Ct值，消除误差；烟草硝酸还原酶扩增引物和荧光探针的核苷酸序列见序列表SEQ ID No.30至SEQ ID No.32。
4.根据权利要求1所述的一种转基因烟草定量检测方法，其特征在于所述探针序列的5’以荧光报告基团FAM标记，3’以荧光淬灭基团TAMRA标记。
5.根据权利要求3所述的转基因烟草定量检测方法，其特征在于所述探针序列的5’端以荧光报告基团TET标记，3’端以荧光淬灭基团TAMRA标记。
6.一种检测转基因烟草的试剂盒，其特征在于该试剂盒由定性检测试剂、定量检测试剂和目的基因检测试剂组成定性检测试剂所使用的检测标志由CaMV 35S、nos调控基因和NPT-II选择标记基因组成，其PCR定性检测扩增引物的核苷酸序列见序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.12；定量检测试剂使用的检测标志由CaMV 35S和烟草硝酸还原酶基因组成，其定量检测扩增引物和探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.13至SEQ ID No.15和SEQ ID No.30至SEQ ID No.32；目的基因检测试剂使用的检测标志由烟草马铃薯Y病毒复制酶基因、烟草马铃薯Y病毒外壳蛋白基因、烟草普通花叶病外壳蛋白基因、烟草黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因、烟草普通花叶病复制酶基因、苏云金杆菌杀虫蛋白BT-cryIA(c)基因组成，其检测扩增引物核苷酸序列见序列表SEQ ID No.16至SEQ ID No.27。
7.根据权利要求6所述的一种检测转基因烟草的试剂盒，其特征在于所述定性检测试剂中还含有烟草硝酸还原酶基因序列，其扩增引物如序列表SEQ IDNo.28至SEQ ID No.29所示。
8.根据权利要求6或7所述的一种定量检测转基因烟草的试剂盒，其特征在于所述定性检测试剂、定量检测试剂和目的基因检测试剂由以下组分构成组分I反应液组分II Ex-Taq DNA聚合酶组分III 定性、定量及目的基因检测引物组分IV 各种对照样品及标准样品其中组分I含有100ul 10XEx-Taq DNA聚合酶buffer，0.2m摩尔dNTPs，合计40ul，770ul超纯水；组分II Ex-Taq DNA聚合酶，每个反应加入1.5ul相当于100-250ng；组分III为各种检测引物冻干粉，使用浓度为10pmol/ul；组分IV为对照样品，包括定性检测内标准模板对照、定量检测标准样品、目的基因检测阳性对照及阴性DNA对照。所有阳性对照均可充当定性检测阳性对照，目的基因检测阳性对照为分别含有各种目的基因阳性材料。阴性DNA对照为不含有转基因成分的烟草DNA提取样品。
9.根据权利要求8所述的一种检测转基因烟草的试剂盒，其特征在于所述定量检测标准样品为转烟草普通花叶病外壳蛋白基因烟草与阴性样品按百分配比制成，分别含有0.1％、0.5％、1％、2％、5％转基因成分的烟草DNA提取样品。
全文摘要
本发明公开了一种转基因烟草检测方法，包括(一)巢式PCR定性检测获得可用于PCR反应的样本DNA，同时检测样本的花椰菜花叶病毒启动子调控序列CaMV 35s、根癌农杆菌终止子调控序列nos和抗卡那霉素选择标记基因序列NPT II，引物的核苷酸序列见序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.12；对检出为转基因阳性的样本，进一步采用(二)荧光实时PCR定量检测和(三)目的基因PCR检测。本发明还公开了一种检测转基因烟草的试剂盒，由定性检测试剂、定量检测试剂和目的基因检测试剂组成。本发明的优点是该方法重复性好，可靠性高，检测费用低，省时省力；试剂盒灵敏度高、特异性强、操作简便，便于实现转基因烟草检测的规范化。
文档编号C12Q1/68GK1718743SQ20051008039
公开日2006年1月11日 申请日期2005年7月4日 优先权日2005年7月4日
发明者郭兆奎, 张丽萍, 万秀清, 颜培强, 李丽杰, 范志新, 魏继承, 于艳华 申请人:黑龙江省烟草科学研究所