转基因水果的多重pcr反应的检测方法

专利名称：：转基因水果的多重pcr反应的检测方法
技术领域：
：本发明属于转基因水果安全与检测
技术领域：
，具体涉及了一种转基因水果的多重PCR检测方法；本发明还涉及了检测转基因水果的试剂盒。
背景技术：
：通过基因工程技术将外源基因导入至其他特定生物体中，使其产生正向遗传突变，改造了生物的遗传物质，使其在形状、营养品质、消费品质等方面向人们所需要的目标转变，成为一种具有全新特性的新型生物体。该生物体称为转基因生物体或基因修饰生物体(GeneticallyModifiedOrganisms,GMOs),包括转基因动物、植物和微生物。转基因生物直接食用，或者作为加工原料生产的食品，统称为"转基因食品"(GeneticallyModifiedFoods,GMF)。然而转基因生物体在给人类带来福利的同时，也可能给人类健康或生态环境带来风险。转基因生物体引发的生物安全问题包括转基因生物体对人类健康的安全性问题和对自然生态环境的安全性问题。在市场经济背景下，对转基因生物技术及其产品开发、研究和市场化存在着较大的经济刺激和驱动因素，从而导致转基因生物技术及其产品的发展存在受商业利益支配的倾向。由于转基因生物体的大规模环境释放和转基因食品商品化生产可能会带来一定的环境风险与健康隐患，所以需要对转基因作物做进一步研究。虽然现在还不能最后确定转基因技术(包括转基因食品)的安全性问题，但其对生态环境和人类健康的潜在风险不应低估，防范于未然很有必要。由于转基因生物安全性为人们所关注，各国均要求对进口的转基因食品进行严格的安全检测，确保生物安全和消费者的利益。我国已开始对转基因生物实施安全评价和标识管理，但目前对转基因食品安全性评价和管理体制还处在起步阶段，现有的检验鉴别技术无法满足各级检测机构对转基因食品中各种影响安全性的因素进行全面准确的测定要求。植物性转基因食品的检测采用的技术路线有两条，一是应用PCR、Southern杂交检测插入的外源基因，该手段主要基于PCR技术和核酸探针的杂交检测技术能精确、快速地检测GMO中是否有外来基因(包括目的基因、标记基因和引物)；二是应用ELISA、Western杂交检测表达的重组蛋白，主要采用化学分析、凝胶电泳和酶联免疫的方法，检测工作较为繁杂。目前，美国和欧盟国家主要采用PCR扩增技术对转基因产品进行检测，使用化学分析方法的较少。PCR技术应用于转基因食品的检测，其敏感快速简便的特点是其它检测技术所无法比拟的。此外，转基因食品的检测还发展了定量PCR，用于确定样品中GMO百分比。虽然荧光定量PCR技术可获得DNA模板的准确定量结果，但定量PCR检测仪价格昂贵，相当多的实验室只能是望而却步。随着现代转基因技术的发展，转基因食品中所含的转基因成分越来越多，当食品中含有未知转基因成分时，就需要对每种耙序列分别进行检测，才能最终确定食品中所含的转基因成分。这个检验过程需要进行多次PCR反应，不仅花费较多时间，检验成本也很髙。近年来，发展起来多重PCR技术，可以在一个反应中同时扩增两个或多个目标基因序列。有关转基因生物体检测方法大体可以分为以测定核酸为基础与测定蛋白质为基础两种。不同的方法有不同的特点，综合而言，以测定核酸为基础的PCR法可用于加工食品，检测范围比以测定蛋白质为基础的免疫学方法要宽，故应用更为广泛。聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)，是一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性一一退火一一延伸三个基本反应步骤构成。模板DNA经加热至93'C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；这是模板DNA的变性步骤；模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55'C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合，这是模板DNA与引物的退火(复性)步骤；DNA模板——引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，这是引物的延伸步骤。通过重复循环变性_一退火__延伸三过程，就可获得更多的"半保留复制链"，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。耐热DNA聚合酶——Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90'C以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，使得PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。以测定核酸为基础的PCR法来测定转基因生物体也是因于此。转基因生物体中转基因细胞转入的基因成分一般包括启动子(Promotor)、报告基因(ReporterGene)、目的基因(TargetGene)、终止子(Terminator),其中启动子和终止子为表达目的基因所必需的。至今，转基因植物常用的是花椰菜花叶病毒启动子(CaMV35S)和根癌农杆菌终止子(NOS)。通过PCR扩增这些特殊的启动子和终止子序列，是目前最常用的鉴定食品中有无转基因成分的方法。尽管已开发出了用于转基因生物检测的DNA提取试剂盒和一系列检测方法，而对水果中转基因成分的检测尚缺乏研究。当前国内外对于转基因植物检测的研究，主要集中在大豆、玉米等转基因农作物上，少有对于转基因水果的研究。如Shirai等通过对35S启动子、NOS终止子的检测，实现了对抗草甘膦大豆RoundupReady转基因成分的筛选检测。曹际娟等对转基因玉米及其粗加工食品，如爆米花、熟玉米棒、速溶玉米片的基因进行了PCR定性检测。但定性的PCR方法对转基因玉米原材料的灵敏度比转基因大豆原材料略低，如检测0.1%的转基因玉米种的35S启动子的假阴性数量是14个，而相应的转基因大豆的35S启动子的假阴性数量是5个。PCR方法已经发展为检测转基因RoundupReady大豆的方法，呈现髙度特异性和敏感度(0.01XGMF),适用于从大豆到豆制品、大豆蛋白质、卵磷脂及豆油的半成品和终产品样品。此外，对转基因水果的检测，国内亦未有标准的方法。鉴于水果往往是人们直接进行食用，其中含有转基因成分大都未经过任何加工处理，其安全性更值得关注。目前转基因水果的检测主要有定性PCR法。定性PCR法以其髙灵敏性、较好特异性和快速简便性被广泛采用，但PCR法也存在着问题基因高效扩增可能产生假阳性结果且难以进行定量检测。随着现代转基因技术的发展，转基因食品中所含的转基因成分越来越多，当食品中含有未知转基因成分时，就需要对每种耙序列分别进行检测，才能最终确定食品中所含的转基因成分。这个检验过程需要进行多次PCR反应，不仅花费较多时间，检验成本也很髙。为了能够对转基因水果做出综合评价和实施有效监管，建立和推广准确、快速、髙效的转基因成分检测技术迫在眉睫。近年来，发展起来多重PCR技术，可以在一个反应中同时扩增两个或多个目标基因序列。多重PCR(multiplexPCR),又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。多重PCR的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定。现阶段对水果进行转基因研究在国内外还是空白，本发明由此而来。
发明内容本发明的主要目的在于提供一种转基因水果的多重PCR检测方法，解决了现有技术中转基因水果难以进行检测或通过常用的PCR方法易导致假阳性等问题。为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是一种转基因水果的多重PCR检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(1)设计并选取包括如下的两对引物序列；35SFZMP1:SEQIDNo:35SFZMP2:nosFZMP1SEQIDNo:2SEQIDNo:34nosFZMP2:SEQIDNo:(2)以十六烷基三乙基溴化铵法提取待测水果基因组DNA并测定DNA浓度；以所提取的DNA为模版在包括步骤(1)的引物序列的PCR反应体系中对35S启动子、NOS终止子、植物内源rbcl基因进行多重PCR扩增(3)限制性内切酶对多重PCR扩增结果进行酶切反应，经琼脂糖凝胶电泳分析及DNA测序证明水果是否含有转基因成分。优选的，所述的引物序列为三对引物序列35SFZMP1:SEQIDNo:135SFZMP2:nosFZMP1:nosFZMP2:rbcL-F:rbcL-R:SEQIDNo:2SEQIDNo:3SEQIDNo:4SEQIDNo:5SEQIDNo:6优选的，所述待测水果选自木瓜、梨、哈密瓜、香蕉。优选的，所述步骤(2)中测定DNA浓度包括对提取的DNA稀释定倍量后，以ddH20为对照，通过紫外可见分光光度计测定A26。、A28。值来得到。DNA浓度(ng/mL)=50xA26oX稀释倍数。从八260和A280比值分析DNA质量,优选的，步骤(2)中PCR反应体系终浓度组成为终浓度10X;PCR缓冲液dNTPs引物序列模板DNATaqDNA聚合酶MgCl20.20.4mM;终浓度为0.2mM;110ng/pL;0.04~0.08U/fiL;终浓度为6mM;溶剂为ddH20;PCR反应条件为95"C预变性5min;95"变性30s,59"退火lmin,72"延伸30s，35个循环；72'C延伸10min。优选的，所述步骤(3)中酶切反应的酶切位点为Xmnl酶切位点5'…GAANN丄NNTTC…3'Mph酶切位点3'."CTT丽个丽AAG…5，5，...ATGCAiT."3，3'…T个ACGTA…5，；Van91I酶切位点5'…CCANNNN丄NTGG…3'EcoRV酶切位点XbaI酶切位点3，...GGTTNT丽丽ACC…5，；5，...GAT丄ATC."3，3，…CTATTAG.,.5，；5'…T丄CTAGA…3，3，…AGATCTT…5，优选的，所述步骤(3)中酶切反应的限制性内切酶选自PdmI(XmnI)限制性内切酶、EcoRV限制性内切酶、Mph限制性内切酶、Van91I限制性内切酶、Xbal限制性内切酶。优选的，所述步骤(3)中琼脂糖凝胶电泳分析是经2%琼脂糖凝胶电泳后根据电泳结果是否出现特异性条带，判断待测水果是否含有相应外源基因。优选的，所述步骤(3)中对扩增出的DNA基因测序后通过进行序列同源性分析确证是否为相应外源基因。优选的，所述步骤(2)中以十六垸基三乙基溴化铵法提取待测水果基因组DNA的步骤包括以下步骤称取适量样品，与预提取缓冲液冰上研磨至匀浆后，加入CTAB提取缓冲液，经破碎细胞壁、裂解细胞膜、除去多糖和多酚等次生物质、变性分离蛋白质、沉淀核酸、去除RNA和浓縮DNA等步骤，得到样品组织的DNA。更为优选的，包括以下步骤将样品与预提取缓冲溶液研磨至匀浆后，加入65'C预热的CTAB提取缓冲液及适量的P-巯基乙醇，65C混匀保温1h，冷却至室温，加入氯仿/异戊醇，离心至分相；上清液加入RnaseA贮液，37"保温30min;加入预冷的异丙醇，-20^放置20miii以上；冷冻离心沉淀DNA。弃上层清液后，加入70%乙醇洗涤沉淀再次离心沉淀DNA。最为优选的，包括以下步骤将样品与少量石英与预提取缓冲溶液研磨至匀浆后移入离心管，加入65C预热的CTAB提取缓冲液及适量的P-巯基乙醇，65"混匀保温lh，冷却至室温，加入氯仿/异戊醇，离心至分相，上清液加入RnaseA贮液，37"保温30miii;加入预冷的异丙醇，-20"€放置20以上；冷冻离心沉淀DNA。弃上层清液后，加入70。/。乙醇洗涤沉淀2-3次；再次离心沉淀DNA,将管口倒扣于吸水纸上，用枪头吸去残留的乙醇，室温风干；DNA沉淀溶解于lxTE缓冲液中；除部分DNA用于0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，其余DNA于-20。C保存备用。优选的，当样品为°植物叶片时，直接取叶片进行研磨；当样品为果肉组织时，将样品制成冻干粉后进行研磨。优选的，所述方法中预提取缓冲液按其终浓度组分为Tris'HCl50mmol/L(pH8.0);NaCl0.7mol/L;EDTA10mmol/L(pH8.0)。优选的，所述方法中CTAB提取缓冲液终浓度组分为CTAB2%(m/V);PVP2%(m/V);p-巯基乙醇20mL/L。优选的，所述方法步骤(2)中以十六垸基三乙基溴化铵法提取待测水果基因组DNA包括以下步骤(A)根据待测植物的组织对样品进行预处理后，与预提取缓冲液低温研磨至匀浆后，加入651C预热的CTAB提取缓冲液和适量的p-巯基乙醇，混勾保温30minlh;冷却至室温；(B)加入氯仿/异戊醇，离心至分相，取上清液加入RnaseA贮液，37"保温30min;加入预冷的异丙醇，-20'C放置20min以上；冷冻离心沉淀；(C)沉淀加入70%乙醇洗涤沉淀，离心分离沉淀；加入TE缓冲液溶解保存。本发明的另一目的在于提供一种转基因水果的多重PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括有效检测量的上述的引物序列。本发明通过选用通用引物扩大了检测转基因水果中外源目的基因的范围，一次PCR反应即可检测转基因水果常用的35S启动子、NOS终止子。根据待测水果的不同，可以检测转基因木瓜的植物内源rbcl基因、外源PRSV基因。同时，本发明选用引物是在各引物浓度为0.2fiM的等摩尔条件下进行扩增，扩增产物通过一次普通的琼脂糖凝胶电泳即可有效的分开，方法简单易行。本发明所建立的方法只通过一次PCR反应就能同时检测上述的外源基因，而且检测的灵敏度达到0.1%的水平，优越性非常明显。PCR缓冲液终浓度为IOX，是指反应体系中PCR缓冲液各组分含量为1XPCR缓冲液各组分浓度的IO倍；实际应用中，可取一定体积的10XPCR缓冲液按照各组分在反应体系中的浓度进行稀释，如要求PCR缓冲液终浓度为2X,则取反应体系总体积的1/5体积的10XPCR缓冲液即可。10XPCR缓冲液成分为100mMTris-HClpH8.0，500mMKC1,15mMMgCl2。本发明在现有技术中转基因水果的普通PCR技术基础上，采用至少两对不同引物序列的组合、不同PCR缓冲液的浓度和不同的引物序列浓度来建立和优化检测转基因水果的多重PCR技术体系。转基因产品检测中所用引物扩增的目标片段都是小于500bp的短片段，因为从加工后的转基因产品提取的DNA大部分是已经降解的片段。在多重PCR反应中，短片段扩增产物的引物在髙盐浓度下扩增结果更好，髙盐浓度会使长片段扩增产物难于变性解链，难以得到有效的扩增。本发明多重PCR检测35s，Nos时使用PCR缓冲液浓度为10X,引物浓度为0.2mM,退火温度60C既可以保证各引物的有效扩增，又减少了引物二聚体的干扰和非特异带的产生。三重PCR和四重PCR检测35s，Nos时选择缓冲液浓度为2X，引物浓度为0.2mM，退火温度60'C即可以保证各引物的有效扩增，又减少了引物二聚体的产生。本发明所检测的水果选自木瓜、梨、哈密瓜、香蕉；这些水果的外源目的基因在目前转基因水果中较为常见，因此本发明具有实用性。另外，本发明的方法可以縮短检测时间，单个样品从样品制备到结果检测出来只需要1天时间；本发明检测所用的方法为常规定性PCR和普通琼脂糖凝胶电泳检测，只需目前常规的分子生物学试剂，成本较低；而且本发明检测灵敏度髙，能达到国家标准制定的0.1%水平，同时相比于单引物PCR检测，本发明准确率髙，假阳性比率低。通过不同的PCR仪器对比检测以及不同的检测人员操作比对均能得到稳定的检测结果。本发明的有益效果在于仅一次PCR可快速、准确检测当前转基因水果，灵敏度可达0.1%，且成本低，准确率髙，假阳性率低。下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述图1为本发明实施例常青树嫩叶片DNA(阴性对照)PCR扩增图；其中1为XHindIIImarker,2、3为以常青树嫩叶提取之DNA;图2为本发明实施例转基因木瓜DNA、不同稀释浓度的常青树嫩叶片DNA(阴性对照)、ddH20(空白对照)PCR扩增比较图；其中1为50bpDNAladder，27分别为以转基因木瓜DNA、常青树嫩叶DNA、常青树嫩叶DNA、常青树嫩叶DNA稀释10倍、常青树嫩叶DNA稀释20倍及ddH20;图3为本发明实施例转基因木瓜DNA(阳性对照)、常青树嫩叶片DNA(阴性对照)、ddH20(空白对照)、海南和泰木瓜DNA、旺牌木瓜DNA为模板的PCR扩增比较图；1为50bpDNAladder;2为海南和泰木瓜DNA;3为旺牌木瓜DNA;4为阳性对照；5为阴性对照；6为空白对照；图4为35S基因比对图；图5为NOS基因比对图；图6为rbcl基因比对图7为本发明实施例哈密瓜DNA、老谢牌木瓜DNA、香蕉DNA、梨DNA、阳性对照DNA、常青树嫩叶片DNA(阴性对照)、ddH20(空白对照)、为模板的PCR扩增比较图；其中1为50bpDNAladder,29模板DNA分别为2-哈密瓜，3-老谢牌木瓜，4-空白，5-空白，6-香蕉，7-香蕉，8-空白，9-梨，10-阳性对照，ll-阴性对照，12-空白对照；图8为本发明实施例35S基因单一PCR扩增与其他模板DNA的对照图；其中为中1为50bpDNAladder,29模板DNA分别为2-哈密瓜，3-旺牌木瓜，4-老谢牌木瓜，5-和泰牌木瓜，6-和泰木瓜，7-和泰木瓜，8-香蕉，9-梨，10-阳性对照，ll-阴性对照，12-空白对照；图9为本发明实施例对PCR扩增产物酶切与其他模板DNA的对照图；1为50bpDNAladder,29模板DNA分别为2-哈密瓜，3-旺牌木瓜，4-老谢牌木瓜，5-和泰牌木瓜，6-和泰木瓜，7-和泰木瓜，8-香蕉，9-梨，10-阳性对照，ll-阴性对照，12-空白对照；图10为PRSV-rp基因基因比对图11为35S基因酶切位点示意图12为NOS基因酶切位点示意图13为rbcl基因酶切位点示意图14为35S单一PCR扩增产物酶切结果图；其中l为50bpDNAladder,2、3为35S单一PCR扩增产物；图15为35S单一PCR扩增产物又一酶切结果图；其中1、2为35S单一PCR扩增产物，3为NOS单一PCR扩增产物，4、5为rbcl单一PCR扩增产物，15中分别加入Xmnl、EcoRV、Nsil、PflMI与Xbal酶，6为50bpDNAladde"具体实施例方式为了更详尽的表述上述发明的技术方案，以下本发明人列举出具体的实施例来明技术效果；需要强调的是，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例1对转基因木瓜的二重PCR检测验证1、PCR引物的合成本发明的PCR引物序列为合成的引物序列；引物序列信息如下表表l引物序列信息表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2、样品DNA的提取仪器设备Bio-radPCR热循环仪；Bio-rad电泳仪及凝胶成像系统;紫外可见分光光度计；微量移液器；微量离心机和冷冻离心机；DK-80型电热恒温水槽；冷冻干燥设备；各种常用玻璃器皿。材料预备预提取缓冲液50mmol/LTHs'HCl(pH8.0),0.7mol/LNaCl,10mmol/LEDTA(pH8.0)。CTAB提取缓冲液预提取缓冲液中加入2%(m/V)CTAB，2%PVP,20mL/Lp-巯基乙醇(用前加入)。氯仿/异戊醇(24:1;70%乙醉；1xTE缓冲液10mmol/LTris'HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0);RNaseA(10mg/mL):用0.15mol/LNaCl,0.015mol/L拧檬酸三纳配成10mg/mL:使用前100'C热处理15min以除去残留的Dnase活性；琼脂糖；DNA相对分子质量标准物(XHindIII);PCR反应4种dNTP,引物1,引物2，Taq酶，DNA相对分子质量标准物(50bpladder)。采用常青树嫩叶片作为阴性对照。实验步骤，称取适量转基因木瓜和常青树嫩叶片样品(常青树嫩叶片组织取20mg-40mg、转基因木瓜去皮新鲜瓜果20r:冷冻干燥l-2天制成粉末，取0.1g冻干粉)，将样品与少量石英与500pL预提取缓冲溶液研磨至匀浆后移入5mL离心管，加入65"C预热的CTAB提取缓冲液500pL及40mmol/L的p-巯基乙醇，65'C混匀保温1h,冷却至室温，加入450fiL氯仿/异戊醇，离心10min(12000r/min)至分相，加入5fiLRnaseA贮液，37"C保温30min;加入600fiL预冷的异丙醇，-20'C放置20min以上；冷冻离心10min(12000r/min),沉淀DNA。弃上层清液后，加入80070%乙醇洗涤沉淀2-3次再次离心(12000r/min)5min，沉淀DNA,将管口倒扣于吸水纸上，用枪头吸去残留的乙醇，室温风干；DNA沉淀溶解于50jiLlxTE缓冲液中；取5DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，其余DNA于-20*0保存备用。取所得DNA20fiL稀释100倍，以ddH20为对照，用紫外可见分光光度计测定A26()、A28Q值，并计算其浓度，由二者比值分析DNA质量。DNA浓度(pg/mL)=50xA26。x稀释倍数。3、PCR扩增、酶切反应和凝胶电泳采用2个引物对，分别对35S启动子，NOS终止子，植物内源基因rbcL进行扩增。二重PCR反应体系为10x扩增缓冲液2.5pL,dNTP终浓度0.4mM，引物终浓度为0.2nM，MgC12终浓度6mM，TaqDNA聚合酶为1.5U,模板DNA量为lpL，加入dd无菌水将总体积调整为25pL。PCR反应条件为95X:预变性5min:95'C变性30s,59"退火lmin，72"延伸30s,35个循环；72'C延伸lOmin。取5-6pLPCR产物，经2%琼脂糖凝胶电泳检测。所述酶切反应的酶切位点及如下(1)Xmnl酶切位点5，…GAANN丄NNTTC…3'3，…CTTNNT丽AAG."5"其所用缓冲液组分为10xBufferTango:330mMTris-acetate(pH7.9)，lOOmM醋酸镁，660mM乙酸钾，l.Omg/mlBSA。(2)Mph酶切位点5'…ATGCA丄T…3，3'…TtACGTA…5'其所用缓冲液组分为10xBufferR:100mMTris-HCl(pH8.5)，lOOmMMgC12,1000mMKC1，l.Omg/mlBSA。(3)Van91I酶切位点5，…CCANNNN丄NTGG…3'3，...GGTTNtNNNNACC...5'其所用缓冲液组分为10xBufferR:同(2)Mph酶切位点所用缓冲溶液。(4)EcoRV酶切位点5'…GAT丄ATC."3，3，…CTATTAG...5，其所用缓冲液组分为10xBufferH:500mMTris-HCl(pH7.5)，lOOmMMgC12,10mMDithiothreitol，1000mMNaCl。(5)Xbal酶切位点5'…T丄CTAGA…3'3'…AGATC丁T…5'其所用缓冲液组分为10xBufferM:100mMTris-HCl(pH7.5)，100mMMgC12,10mMDithiothreitol,500mMNaCl。酶切反应操作步骤如下(1)采用Pdml(Xmnl)限制性内切酶对35S基因单重PCR扩增结果进行酶切反应，依次加入PCR反应混合液10jiL,ddH2016pL、10xBufferTangoTM2nL、XmnIlpL，轻缓混匀，低速离心10秒钟，在37"C下保温lh，然后在65'C下保温20min热停止。(2)采用EcoRV限制性内切酶对35S基因单重PCR扩增结果进行酶切反应，依次加入PCR反应混合液10jiL，ddH2016jiL、10xBufferH2pL、EcoRVlfiL,轻缓混匀，低速离心10秒钟，在37t!下保温lh，然后在65'C下保温20min热停止。(3)采用Mph限制性内切酶对NOS基因单重PCR扩增结果进行酶切反应，依次加入PCR反应混合液10fiL，ddH2018fiL、10xBufferR2fiL、MphlpL,轻缓混匀，低速离心10秒钟，在37'C下保温lh,然后在65t:下保温20min热停止。(4)采用Van91I限制性内切酶对RBCL基因单重PCR扩增结果进行酶切反应，依次加入PCR反应混合液10pL，ddH2018pL、lOxBufferR2fiL、Van91IlpL,轻缓混匀，低速离心10秒钟，在37"下保温lh,然后在65"下保温20min热停止。(5)采用XbaI限制性内切酶对RBCL基因单重PCR扩增结果进行酶切反应，依次加入PCR反应混合液10pL，ddH2016L、lOxBufferM2fiL、XbaIlfiL,轻缓混匀，低速离心10秒钟，在37^下保温lh,然后在65'C下保温20min热停止。分别将1HindIIImarker,以常青树嫩叶提取的DNA和50bpDNAladder、GMO木瓜DNA、常青树嫩叶DNA、常青树嫩叶DNA、常青树嫩叶DNA稀释10倍、常青树嫩叶DNA稀释20倍及ddH20为模板进行的三重PCR扩增后进行2%琼脂糖凝胶电泳结果如图l、图2;其中GMO木瓜组中扩增处了三个条带，而以常青树DNA不同稀释倍数为模板只扩增出一个条带(rbcl基因条带)，未有35s和iios条带。而常青树DNA不同稀释倍数，扩增出的一个条带亮度亦有相应变化。实施例2对海南和泰木瓜、旺牌木瓜的三重PCR检测1、PCR引物的合成本发明的PCR引物序列为合成的引物序列；引物序列信息如下表:表2引物序列信息表引物扩增基因引物序列(5'-3')产物大小(bp)35SFZMP1P35SSEQIDNo:115835SFZMP2SEQIDNo:2nosFZMP1NOSterSEQIDNo:3125nosFZMP2SEQIDNo:4rbcL-FRbcLSEQIDNo:5433rbcL-RSEQIDNo:62、样品DNA的提取实验仪器和实验试剂同实施例1。以常青树嫩叶片提取的DNA为阴性对照，以ddH20为空白对照，以转基因木瓜DNA为阳性对照，对海南和泰木瓜、旺牌木瓜两种产品进行检测。实验步骤类似如实施例1，其中DNA提取的CTAB提取缓冲液和P-巯基乙醇70r预热。PCR扩增时采用三个引物对，分别对35S启动子，NOS终止子，植物内源基因rbcL进行扩增。三重PCR反应体系中lOx扩增缓冲液2.5nL,dNTP终浓度为0.4mM,引物终浓度为0.2fiM,MgC12终浓度6mM，TaqDNA聚合酶为2.0U,模板DNA量为lfiL，加入dd无菌水将為体积调整为25jiL。PCR反应条件为92'C预变性5miii;97"变性30s，56"退火lmin,75'C延伸30s，35个循环；75"C延伸10min。取5-6fiLPCR产物，经2%琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果如图3所示，可以看到，以和泰木瓜和旺牌木瓜DNA为模板(图3中为2号样品)扩增出了三重目的条带，说明和泰木瓜、旺牌木瓜存在转基因成分，很可能为转基因产品。为了确定这些目的条带的基因序列，对扩增的三重目的条带的基因进行了测序。并用DNAMAN分析软件进行序列同源性分析。三重目的条带分别为35S基因、NOS基因、rbcl基因。分析结果如下图46。对35S测序结果如下SEQIDNo:9;经Genbank査询，与标准序列比对情况如图4所示，同源性为97.44%。由于NOS基因片段过小，不易直接测序，对PCR产物纯化后克隆测序，测序结果如下SEQIDNo:10;经Genbank査询，实际扩增部分与标准序列比对情况如图5所示，同源性为100%。对扩增出的rbcl基因测序结果如下SEQIDNo:11,经Genbank査询，与标准序列比对情况如图6所示，同源性为100%。实施例3对老谢牌木瓜、哈密瓜、香蕉、梨的三重PCR检测选取老谢牌木瓜、哈密瓜、香蕉、梨为受试样品进行检测，步骤类似实施例1,以常青树嫩叶片提取的DNA为阴性对照，以ddH20为空白对照，以转基因木瓜DNA为阳性对照，对老谢牌木瓜、哈密瓜、香蕉、梨四种产品进行检测。其中DNA提取的CTAB提取缓冲液和P-巯基乙醇60r预热。PCR扩增时采用三个引物对，分别对35S启动子，NOS终止子，植物内源基因rbcL进行扩增。引物序列信息如下表表3引物序列信息表引物名称扩增基因引物序列(5、3')目标片段大小(bp)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>三重PCR反应体系中lOx扩增缓冲液2.5fiL，dNTP终浓度为0.4mM,引物终浓度为0.2fiM，MgC12终浓度6mM,TaqDNA聚合酶^/2.0U，模板DNA量为lfiL，加入dd无菌水将总体积调整为25(iL。PCR反应条件为97"C预变性5min;92t:变性30s，60'C退火lmin，70"C延伸40s，40个循环；70"C延伸12min。取5-6nLPCR产物，经2%琼脂糖凝胶电泳检测。结果见图7。由图7可以看出，老谢牌木瓜中(第3号样品)同时扩增出三重DNA条带，与阳性对照情况相同，故老谢木瓜可能有转基因成分。而以哈密瓜、香蕉、梨为模板进行的三重PCR反应中，只扩增出了植物内源基因rbcl基因，与阴性对照情况相同，故所购买的哈密瓜、香蕉、梨中没有转基因成分。为了进一步确定各种水果是否为转基因产品，对35S基因进行单一PCR扩增，结果如图8、图9。单重PCR反应体系为10x扩增缓冲液2.5fiL，dNTP终浓度为0.2mM，引物终浓度为0.2fiM，MgC12终浓度6mM，TaqDNA聚合酶为1U,模板DNA量为lfiL,加入dd无菌水将总体积调整为25fiL。PCR反应条件为95'C预变性5min;95C变性30s,59"C退火lmin,72C延伸30s，35个循环；72'C延伸lOrnin。取5-6jiLPCR产物，经2%琼脂糖凝胶电泳检测。从图8中可以看出，以旺牌木瓜、老谢牌木瓜、和泰牌木瓜为模板进行单一PCR反应，均扩增出了35S基因；而以哈密瓜、香蕉和梨为模板没有目的条带出现。用PdmI(XmnI)限制性内切酶对扩增出的35S基因进行切割，实验结果如图9所示。可以看到，样品号为37与10中有约为100bp酶切产物片断存在，说明了PCR反应的特异性。本实施例还对PRSV-rp基因进行了测序，测得的PRSV-rp基因序列为SEQNo:12。，经Genbank査询，与标准序列比对情况，同源性为100%,如图10。结合图8与图9可以判断，老谢牌木瓜为转基因产品，哈密瓜、梨、香蕉为非转基因产品。所以通过三重PCR反应以及单一PCR和酶切反应结合的方法，可以较准确的判断水果类产品是否为转基因产品。实施例4对扩增产物的酶切反应确证通过对35S基因序列进行分析，在以下碱基位点可以被限制性内切酶所切割表4限制性内<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>35S(158bp)基因切割为58bp和100bp两部分；EcoRV可将35S切割为98bp和60bp。对NOS基因序列进行分析，在扩增出的125bp碱基中，NOS基因仅能在83bp处被Nsil所切割，如图12所示。理论上可以切为83bp和42bp两部分。对rbcl基因序列进行分析，在以下碱基位点可以被限制性内切酶所切割表5限制性内切酶酶切位点<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>选择PflMI与XbaI进行酶切反应，如图13。理论上PflMI可将rbcl基因(433bp)切割为279bp和154bp两部分，XbaI可将rbcl基因切割为224bp和209bp两部分。对35S基因PCR扩增产物进行酶切反应，采用PdmI(XmnI)限制性内切酶，在37'C下保温lh,然后在65T下保温20min，经2%琼脂糖凝胶电泳后观察(结果如图14)，可以看到35S基因(约为158bp)被切成约为58bp和100bp两段，与假设相符合。从而进一步证明了PCR方法的准确可靠，所得产物确为Camv35S启动子。用Xmnl切割35S,用EcoRV切割Camv35S,用Mphll03(Nsil)切割NOS,用Van91I(PflMI)切割rbcl,用Xbal切割rbcl进行酶切反应，所得结果如图15所示可以看到，35S(158bp)可被被Xmnl酶切成约为58bp和100bp两段，可被EcoRV切成约98bp和60bp;Nos(125bp)可被Mphll03(Ava111)切为83bp:rbcl"33bp)可被Van91I(P謹I)切为279bp和154bp，被Xbal切为224/209bp。与所预测基本符合，表明了PCR产物为非假阳性。本发明实施例中通过应用CTAB法提取出了木瓜、哈密瓜、香蕉、梨等的DNA，方法建立的多重PCR法对35S启动子、NOS终止子、植物内源rbcl基因、转基因木瓜外源PRSV复制酶基因进行扩增，通过酶切反应对35S、NOS、rbcl基因进行切割，并对35S、NOS、rbcl、Prsv-rp基因进行测序，结果证明了PCR反应的特异性，通过对单一PCR产物进行酶切分析，可以进一步确定水果类产品是否含有转基因成分，显示此方法可以成功区分转基因水果和非转基因水果。其有效性体现在，通过对水果中转基因成分的快速、便捷、准确的测定。上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。SEQUENCELISTING<110>陈军肖琳戴岚陈骏锋朱振华<120>转基因水果的多重PCR反应的检测方法<160>12<170>Patentlnversion3.5<210><211><212><213>21DNA人工序列<400>1ccgacagtggtcccaaagatg21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2sgsggssgggtcttgcgssgg21<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序歹U<400>3gaatcctgttgccggtcttg20<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序歹U<400>4gcgggactctaatcataaaaacc23<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序歹!j<400>533tcttctsctggtsc3tggsc22<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序歹!j<400>6tC3tcstctttggt3333tc33g23<210>7<211>20<212>DNA<213>人T一序歹lJ<400>73tscc33tggtgstgstctc20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序歹!j<400>8tt3Cttsg3ctggtgs33cs20<210>9<211>119<212>DNA<213>花椰菜花叶病毒(Cauliflowermosaicvirus)<400>9agccttacgtcagtggagatatcacatcaatccacttgctttgaagacgtggttggaacg60<210>10<211>289<212>DNA<213>禾艮癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)<400>10tatgttgtgtggaattgtgagcggstsacaatttcacacaggaascagctatgsccatga60ttacgaattcgagctcggtacccggggatcctctagagattgaatcctgttgccggtctt120gcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaa1803ggc3tgc33gcttggcsctggccgtcgttttscsscgtcgtgsctggg289<210〉11<211〉389<212>DNA<213>植物叶绿体(ribulose1,5-bisphosphatecarboxyloseLargeGene)<400〉11ccagccttgatcgttacsaaggacgatgctacggcstcgsgcccgttcctggsgaagsaa60acatgtttacttccattgtgggtaatgtatttgggttcaaagccctgcgcgctctacgtc180t3g3gg3tctgcgsstccctcctgcttststtssssctttccsgggsccscctcstggts240tccaagttgaaagagataaattgaacaagtatggtcgtcccctattaggatgtactatta300gtggacttgattttaccaaagatgatgaa389<210>12<211〉541<212>DNA<213>番木瓜环斑病毒(Papayaringspotvirus)<■>12ctc333ggc3ccg333t333cssgstttgtggttcstgtc3c3tcg3ggt3ttctg3tcg120gatatgaggagctascgcsccagatccgcaggttctatcaatgggtgcttgagcaggctc300csttcaatgaattagcgssgcagggcsgggctccatatgtgtctgaggttggattgaggc360ttgagcgagaaaggggagattcgcctgagctactggtgtattatgaatcgagsagcactg480a54权利要求1.一种转基因水果的多重PCR检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(1)设计并选取至少包括下列两对引物序列；35SFZMP1SEQIDNo1；35SFZMP2SEQIDNo2；nosFZMP1SEQIDNo3；nosFZMP2SEQIDNo4；(2)以十六烷基三乙基溴化铵法提取待测水果基因组DNA并测定DNA浓度；以所提取的DNA为模版在包括步骤(1)的引物序列的PCR反应体系中对35S启动子、NOS终止子、植物内源rbcl基因进行多重PCR扩增；(3)限制性内切酶对多重PCR扩增结果进行酶切反应，经琼脂糖凝胶电泳分析及DNA测序证明水果是否含有转基因成分。2、根据权利要求1所述的多重转基因水果的多重PCR检测方法，其特征在于所述的引物序列对为三对引物序列35SFZMP1:SEQIDNo:35SFZMP2:SEQIDNo:2;nosFZMP1:SEQIDNo:3;nosFZMP2:SEQIDNo:4;rbcL-F:SEQIDNo:5:rbcL-R:SEQIDNo:6。3、根据权利要求1所述的多重转基因水果的多重PCR检测方法，其特征在于所述待测水果选自木瓜、梨、哈密瓜、香蕉。4、根据权利要求1所述的多重转基因水果的多重PCR检测方法，其特征在于所述步骤(2)中测定DNA浓度包括对提取的DNA稀释定倍量后，以ddH20为对照，通过紫外可见分光光度计测定A260、A280值来计算。5、根据权利要求1所述的多重转基因水果的多重PCR检测方法，其特征在于步骤(2)中PCR反应体系终浓度组成为PCR缓冲液终浓度10X;dNTPs0.20.4mM;引物序列终浓度为0.2mM;模板DNAl~10ng/nL;TaqDNA聚合酶0.04~0.08U/fiL;MgCl2终浓度为6mM:溶剂为ddH20;PCR反应条件为9297'C预变性49min;9297'C变性2040s，5660'C退火4070s，7075'C延伸2040s,3040个循环；7075"C延伸812min。6、根据权利要求1所述的多重转基因水果的多重PCR检测方法，其特征在于所述步骤(3)中酶切反应的酶切位点为Xmnl酶切位点5，...GAANN丄NNTTC…3，3，…CTT丽T歴AAG…5，；Mph酶切位点5，…ATGCA丄T…3，3，…T丫ACGTA…5，；Van91I酶切位点5，...CCANNNN丄NTGG...3，3'…GGTTNT歷丽ACC".5，；5，…GAT工ATC…3'3，…CTA丁TAG...5":5'…T丄CTAGA…3"3，…AGATC丁T…5'。EcoRV酶切位点XbaI酶切位点7、根据权利要求1所述的多重转基因水果的多重PCR检测方法，其特征在于所述步骤(3)中酶切反应的限制性内切酶选自PdmI(XmiiI)限制性内切酶、EcoRV限制性内切酶、Mph限制性内切酶、Van91I限制性内切酶、XbaI限制性内切酶。8、根据权利要求1所述的多重转基因水果的多重PCR检测方法，其特征在于所述步骤(3)中琼脂糖凝胶电泳分析是经2%琼脂糖凝胶电泳后根据电泳结果是否出现特异性条带，判断待测水果是否含有相应外源基因。9、根据权利要求1所述的多重转基因水果的多重PCR检测方法，其特征在于所述方法步骤(2)中以十六烷基三乙基溴化铵法提取待测水果基因组DNA包括以下步骤(A)根据待测植物的组织对样品进行预处理后，与预提取缓冲液低温研磨至匀浆后，加入6070'C预热的CTAB提取缓冲液和适量的P-巯基乙醇，混勾保温30minlh;冷却至室温；(B)加入氯仿/异戊醇，离心至分相，取上清液加入RnaseA贮液，37匸保温30mill;加入预冷的异丙醇，-20"放置20mill以上；冷冻离心沉淀；(C)沉淀加入70%乙醇洗涤沉淀，离心分离沉淀；加入TE缓冲液溶解保存。10、一种转基因水果的多重PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括有效检测量的权利要求l所述的引物序列。全文摘要本发明公开了一种转基因水果的多重PCR检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(1)设计并选取合适的引物序列；(2)以十六烷基三乙基溴化铵法提取待测水果基因组DNA并测定DNA浓度；以所提取的DNA为模版在包括步骤(1)的引物序列的PCR反应体系中对35S启动子、NOS终止子、植物内源rbcl基因进行多重PCR扩增；(3)限制性内切酶对多重PCR扩增结果进行酶切反应，经琼脂糖凝胶电泳分析及DNA测序证明水果是否含有转基因成分。该方法可以成功区分转基因水果和非转基因水果，可以对水果中转基因成分的快速、便捷、准确的测定。文档编号C12Q1/68GK101575648SQ20091011517公开日2009年11月11日申请日期2009年4月2日优先权日2009年4月2日发明者岚戴,朱振华,琳肖,军陈,陈骏锋申请人:陈军;肖琳;戴岚;陈骏锋;朱振华