专利名称：预测中国人2型糖尿病易感性的试剂盒及引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于预测2型糖尿病易感性的试剂盒及引物，更具体地，本发明涉及利用新鉴别的2型糖尿病易感基因KCNJ11(potassium inwardly-rectifying channel，subfamily J，member 11)的一个单核苷酸多态性(SNP)位点设计的预测2型糖尿病易感性的试剂盒和引物。本发明还涉及KCNJ11基因在制备预测2型糖尿病易感性的诊断剂中的应用。
背景技术：
大量流行病学资料表明，糖尿病是一种具有明显遗传倾向的复杂的多基因遗传病。遗传因素可明显影响机体对胰岛素的敏感性。目前对糖尿病易感基因的研究策略主要包括定位克隆法、候选基因法以及二者相结合的定位候选克隆法近年来，大多数研究者致力于通过定位克隆法寻找糖尿病相关基因，即寻找患病家系成员间共享的染色体DNA区域间的连锁。已发现2型糖尿病中的一些相对较少见的单基因形式，称为青年晚发型糖尿病(maturity-onset diabetes of the young，MODY)，是由于突变导致了β细胞功能低下。这些病人通常在青春期到成人早期发病，表现为葡萄糖反应性胰岛素分泌缺陷。这些致病基因中有6个分别编码葡萄糖激酶、转录因子HNF1α、1β、4α及胰岛素启动因子(IPF1)，神经细胞分化蛋白(NeuroD1)。这些基因突变最终导致高血糖血症。这些单基因糖尿病的发病率还不确切，估计占所有2型糖尿病的5％。然而，单纯利用定位克隆的策略来确定多基因遗传病的成功报道尚不多见。
除定位克隆法外，目前对多基因遗传病的相关基因进行研究还有一种常用的方法-候选基因法，即直接研究疾病候选基因的变异与疾病表型之间的关系。该方法主要基于对家系或人群的病例-对照关联分析。关联分析不需要大的家系研究，而是比较某个或某一套标记在患者和正常个体的分布程度。某种标记如果在患病个体中分布十分明显，那么就可以认为该标记与疾病表型相关联。
但是，候选基因法中由于对致病基因所在位置没有足够了解，在选择候选基因上存在较大的盲目性，主要针对与疾病发生发展相关的一些代谢通路进行研究。将上述两种方法相结合的定位候选克隆法在一定程度上弥补了任何单一一种方法的局限性，为目前多基因遗传病研究中所普遍采用的策略。
目前糖尿病候选基因的选择主要有两个来源，一是与疾病发生发展相关的一些代谢通路，一是由定位克隆法所确定的染色体区域。2型糖尿病是一种多基因遗传病，其易感性是多个基因相互作用的结果，因而本发明人以一种新的思路来选择候选基因，即以本组以往研究所获得的中国汉族人群2型糖尿病易感基因为靶基因，在其共表达基因和所处的代谢通路中寻找候选基因，以期构建2型糖尿病易感基因网络图。
同遗传病研究策略相对应，其研究工具-多态性标记也从第一代的限制性片段长度多态性(Restrictive Fragment Length Polymorphism，RFLP)，第二代的微卫星标记(Microsatellite Marker)发展到第三代的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)。尤其在对多基因遗传病进行病例-对照关联分析中，需要利用大量高密度的标记物，前两代多态性标记已不能满足这种要求。因此，近年来，SNP作为第三代遗传图谱的构建者已越来越引起人们的广泛关注。
单核苷酸多态性(SNP)主要是指基因组水平上由单核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛分布，平均每500-1000个碱基中就有1个，其总数估计可达300万个甚至更多。近年来，随着人类基因组及遗传学研究的进展，SNP在全面深入地了解个体和群体间基因组的变异或多态性及疾病研究等方面也越来越显示出其重要意义。将SNP用于疾病易感基因定位的一个最大的优点就是它的分布广泛性。其次是它有比微卫星更高的稳定性，可以最大限度地减少遗传过程中由于序列变异所导致的信息遗失。另外，SNP很容易实现高通量的分型，短时间内可以产生大量的结果，这一点是微卫星所无法比拟的。SNP的上述特点决定了它非常适合于进行像糖尿病这样的多基因疾病，尤其是多个微效基因所导致的疾病的定位研究。选择合适的病例和正常对照，采取关联分析的研究方法，对SNP而言，是非常适合的。
本发明人近几年来一直从事中国北方汉族人群2型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病，NIDDM)易感基因定位研究。在先前本组进行的候选定位克隆研究中，发现了6个中国汉族人2型糖尿病易感基因(PRKCZ，UTS2，CASP9，CDC212，PGD，SAC)，本发明人以一种新的思路，尝试从上述基因所处通路中的功能相关基因及共表达基因中选择合适的候选基因，利用SNP进行病例-对照关联分析，最终鉴定了一个中国汉族人群2型糖尿病易感基因(即KCNJ11基因)，以及该基因上的一个与中国汉族人2型糖尿病特别相关的SNP位点。由此经过深入研究完成了本发明。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了一种预测2型糖尿病易感性的试剂盒，所述试剂盒包含基于图1A或图1B的序列设计的用于PCR扩增的特异引物以及通过核酸扩增进行检测的试剂盒所含的常规组件。所述引物针对图中所示的SNP位点而设计，长度为18bp-28bp。优选地，所述引物选自SEQ ID NO1-17组成的一组，根据本发明的一个更优选的实施方案，所述引物为具有SEQ ID NO18-21所示序列的扩增受阻突变体系(ARMS)引物。
根据本发明的另一方面，提供了用于预测2型糖尿病易感性的引物，所述引物为基于图1A或图1B的序列设计的用于PCR扩增的特异引物，所述引物针对图中所示的SNP位点而设计，长度为18bp-28bp。优选地，所述引物选自SEQ ID NO1-17组成的一组，更优选地，所述引物为具有SEQ ID NO18-21所示序列的扩增受阻突变体系(ARMS)引物。
根据本发明的再一方面，提供了KCNJ11基因(内向整流钾离子通道，J亚基，11号)作为糖尿病易感基因在制备用于糖尿病诊断的诊断剂中的应用，KCNJ11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO22所示。
图1A示出本发明的SNP位点(R)所在的KCNJ11基因区域的核苷酸序列。
图1B为图1A序列的互补序列定义单核苷酸多态性(SNP)主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。
基因分型及等位基因频率分布同一种群生物中，相同等位基因核苷酸序列顺序分析，在此表示相同SNP位点在不同个体中的组成成分的确定，为基因分型。等位基因频率是指所研究的同一种类等位基因里，所期望出现的等位基因占的比例，也就是出现变化的等位基因的所占比例。
疾病易感性(糖尿病易感性)人群对疾病容易感受的程度。
扩增受阻突变体系(amplification refractory mutation system，ARMS)又称等位基因特异性PCR(ASPCR)或特异性等位基因PCR扩增(PASA)，该方法基于耐热Taq DNA聚合酶缺乏3′→5′外切校正活性的特点，设计3′端的特异碱基分别互补于野生型和突变型等位基因的相对应碱基的引物，通过PCR反应和凝胶电泳即可检测出DNA序列中已知点突变的一种新方法。其特点为快速、可重复性高、成本低且便于自动化。
病例-对照关联分析是一种由因及果的回顾性研究。它是先按疾病状态确定调查对象，分为病例和对照组，通过比较病例组与对照组间所研究的遗传标志出现频率的差异而获得该标志与疾病间关联的信息。
参数连锁分析和非参数连锁分析根据基因的重组率来计算两个基因之间的染色体图距即连锁分析，用分类变量(离散变量)来进行分析，把测量指标按某一标准归类，计数，然后进行分析为参数分析，用实际测量后的结果进行的分析为非参数连锁分析。
KATP(ATP敏感性钾通道)是受细胞内ATP浓度调控的一种内向整流钾离子通道，通过与细胞代谢和生物电活动相耦联，在分泌及肌肉收缩过程中发挥重要的生理和病理生理学功能。通过对克隆表达和天然型KATP特性的对比研究表明，KATP可分为以下5种类型①胰腺型，Kir6.2/SUR1②心肌和骨骼肌型，Kir6.2/SUR2A③血管平滑肌型，Kir6.2/SUR2B④肾脏型，Kir1.1/CFTR⑤线粒体型，Kir6.1/？。
本专利涉及的KCNJ11(potassium inwardly-rectifying channel，subfamily J，member 11)基因，又称为BIR或Kir6.2(Chandy andGutman(1993)命名法中)，其编码蛋白为一种内向整流钾离子通道，在胰腺高度表达，与磺脲类受体SUR1(一种广泛应用的降糖药物的作用靶点)共同组成上述的胰腺β细胞内的KATP，受G蛋白调控并在胰岛素的释放过程中起着重要的调节作用。KCNJ11的编码蛋白含有390个氨基酸，由2个疏水的跨膜区段(分别位于第74～95和第145～166个氨基酸残基之间)和H5区组成(位于第119～135氨基酸残基之间)，后者也是由甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸组成。其胞内羧基末端有2个PKA依赖的磷酸化位点(分别为第224位的苏氨酸和363位的丝氨酸)，其胞内氨基和羧基末端共有5个PKC依赖的磷酸化位点(分别为第3，37，36位的丝氨酸和335，344位的苏氨酸)。它在胰腺高度表达，在心脏和骨骼肌相对低度表达。
KCNJ11的编码基因长4.5kb，Locus ID3767，与磺脲类受体SUR1的编码基因融合在一起，共定位于染色体11p15.1上，已证明KCNJ11基因的突变是家族遗传性婴儿低胰岛素高葡萄糖血症(PHHI)的重要病(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink/LocRpt.cgi？l＝3767)。在对欧洲白人的研究中发现，KCNJ11的E23K突变与2型糖尿病相关。
具体实施例方式
目前有多个公共数据库储存了几百万条SNP信息，人们可以通过多种方式，如以基因名、登记号、染色体号、功能级别等，进行查寻。但是，这些数据库中的SNP绝大多数只是“候选者”，而非经过验证的真正SNP。它们是利用计算机在对多个克隆序列进行比对时发掘出来的，其中必然存在一部分假阳性SNP。另外，这些SNP大多数是利用高加索人和黑人测序寻找的SNP，在中国人群中的分布有些不一定相同，我们利用中国汉族人群的糖尿病患者和正常对照，重新测序寻找SNP。并利用我们在中国汉族糖尿病人群中发现的高频的SNP进行基因分型。
为寻找2型糖尿病易感基因，本发明人根据美国国家生物信息学(National Center for Biotechnology Information)中心公布的信息，尝试从本组先前发现的6个中国汉族人2型糖尿病易感基因(PRKCZ，UTS2，CASP9，CDC212，PGD，SAC)所处通路中的功能相关基因及共表达基因中选择了18个中国汉族人群2型糖尿病候选基因，对这些基因的外显子，Promotor区2kb，以及临近的内含子的区域进行测序筛查中国北方汉族人群中的SNP。并对其中部分高频的SNP进行基因分型，通过ARMS反应、序列测定等方法对其在病例组及对照组进行分型并进行病例-对照关联分析。
如以下实施例所详细讨论的，所选择的72个高频(等位基因频率≥15％)的SNP位点中，KCNJ11基因内选取了7个位点进行基因分型，发现本位点和糖尿病相关，它位于第二号外显子的764位处的一个SNP位点(R，即G/A)，NCBI中的编号是rs5215，其等位基因频率分布在病例组和对照组中的差异有统计学意义(P＜0.05)，提示这一SNP位点与2型糖尿病相关，进一步得出结论，其所在基因KCNJ11基因为中国汉族人群2型糖尿病的易感基因。
因此，本发明的一个方面涉及糖尿病易感基因KCNJ11基因在预测糖尿病易感性中的应用。基于KCNJ11基因，可以获得各种诊断剂和试剂盒以用于预测糖尿病易感性。
KCNJ11所在基因组序列如SEQ ID NO22所示，全长为6,458bp，本发明所揭示的SNP位点(R)位于该序列的3,870-4,730位之间，这一区域的核苷酸序列如图1A所示，图中R为SNP位点，其代表碱基G/A多态性，即该位点可以为G，也可以为A。这一区域的互补序列如图1B所示，图中Y代表本发明的SNP位点的互补碱基，其代表碱基C/T。
本发明还涉及用于预测糖尿病易感性的引物。优选地，所述引物基于图1A的序列而设计，由此，PCR扩增后的产物测序可以直接测得SNP位点。当然，本发明的引物也可以基于图1A的序列设计，这样PCR扩增后的产物测序得到SNP的互补碱基。优选地，本发明的引物具有SEQ ID NO1-17所示的序列，更优选地，所述引物为具有SEQ ID NO18-21所示序列的扩增受阻突变体系(ARMS)引物。表1举例示出了本发明的引物的一些组合，引物的解链温度(Tm)以及这些组合得到的产物大小。本领域技术人员能够理解，本发明的引物不限于这些列出的引物及其组合。
表1 SEQ ID NO1-17所示的引物序列
本发明进一步涉及包含本发明的一或多种引物的试剂盒，该试剂盒用于检测糖尿病的易感性。除了本发明的引物之外，所述试剂盒还包含运用PCR扩增而进行检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟悉这些常规组件和检测方法。
以下将参照实施例进一步描述本发明。
实施例1、中国汉族人群2型糖尿病易感基因KCNJ11的鉴定及该基因内SNP的相关研究1、中国汉族人群2型糖尿病患者及正常对照标本的收集本发明所用2型糖尿病组和正常组人群外周血样(10ml)主要来自北京协和医院内分泌科门诊。糖尿病病例可为散发，也可为糖尿病家系的成员(但此时每一家系中通常只有一个患者入选，同一家系中没有任何血缘关系的成员可以选择一个以上)；正常对照来自正常人群，要求其家庭三代以内没有糖尿病患者(包括I型糖尿病)，对照组与患病组年龄及性别相匹配。
2型糖尿病的诊断严格按照WHO于1985年颁发的标准执行。即空腹血葡萄糖浓度≥7.8mmol/L或餐后2小时血糖≥11.1mmol/L为糖尿病。OGTT的判断标准为服糖后2小时血葡萄糖浓度＜7.8mmol/L为正常，≥11.1mmol/L为糖尿病，在7.8-11.1mmol/L之间为糖耐量低减(impaired glucose tolerance，IGT)。
入选的每个成员记录一般情况，包括性别、出生年月、籍贯、身高、体重、心率、呼吸、血压等项目，调查并在必要时行特殊检查，以排除合并有高血压、心脏病、动脉粥样硬化等疾病。除上述项目外，对糖尿病患者还记录发病年龄、既往最高体重、血脂、糖化血红蛋白及糖尿病并发症等项目，对正常对照组还测量空腹血糖并排除有糖尿病家族史者。
采集血样前确保所有成员都了解采血目的，即有知情权，并在“知情同意书”上签字。将收集的资料严格保密，不对外公布供血成员的姓名、年龄、疾病等所有资料。
共采集到547份标本，其中病例组269份，对照组278份。两组在性别、年龄上相匹配，糖尿病患者的平均年龄为53.01岁，正常对照采样时的平均年龄为50.68岁。在所有成员中，男女的比例为271∶276，病例组男性145人，女性124人；对照组男性131人，女性147人。两组成员的年龄分布情况如表2表2 患病组和对照组成员的年龄构成
2、候选基因的确定及候选基因中用于基因分型的SNP位点的选择基于本组先前发现的6个中国汉族人2型糖尿病易感基因(PRKCZ，UTS2，CASP9，CDC212，PGD，SAC)，本发明人根据美国国家生物信息学中心(National Center for Biotechnology Information)公布的信息，在此6个基于所涉及通路中的功能相关基因及共表达基因中选择了18个中国汉族人群2型糖尿病候选基因，对这些基因的外显子、Promotor区2kb、临近的内含子的区域以及3’非翻译区进行测序筛查中国北方汉族人群中的SNP。并对其中72个高频(等位基因频率≥15％)的SNP通过ARMS反应、序列测定等方法进行基因分型。
3、SNP位点基因分型分析主要采用2种方法进行SNP的分型扩增受阻突变体系(amplificationrefractory mutation system，ARMS)分型及测序分型。
1).扩增受阻突变体系(amplification refractory mutation system，ARMS)1.1)引物设计与合成利用Tetra-primet ARMS-PCR软件进行引物设计(http//cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/primerl.html)，针对KCNJ11基因中的7个SNP位点中的每一个SNP位点设计4条引物，分别为正向内部引物、反向内部引物、正向外部引物、反向外部引物。
ARMS-PCR引物设计原则引物长度在18～30base之间，Tm值在55～80℃之间。最适内部PCR产物长度350bp，两条内部PCR产物长度之比为1.3-2。
1.2)ARMS PCR反应及产物鉴定针对KCNJ11基因中的每一个高频SNP位点进行Tetra-primer ARMS-PCR，反应体系15μl，各组分如表3表3 ARMS PCR反应体系
注所使用的Q-solution、buffer、Mgcl2、HotstarTaq均由QIAGEN公司的HotstarTaq试剂盒提供采用Touch-down PCR，其程序如下94℃、12分钟后，进行12个循环的94℃30秒、(Tm+2℃)60秒(每一循环温度下降0.5℃)、72℃50秒，随后30个循环的94℃30秒、(Tm-3℃)30秒、72℃45秒，最后72℃10分钟1次。反应结束后用2％琼脂糖电泳鉴定，在UV灯下观察产物情况，并用紫外凝胶成像仪拍照，记录时间、位点名称、样品号等。
1.3)基因型判定及数据整理根据条带数量及位置判定SNP基因型。将各位点分型结果整理为Excel格式以进行统计处理。
(2)测序分型对于不适合用上述ARMS方法分型或分型结果不理想的位点进行测序分型。
以上各SNP位点的分型均先在96个随机选取的正常对照个体中进行。
在病例组和对照组中，上述72个分型的SNP位点均符合Hardy-Weinberg平衡。鉴于KCNJ11基因序列较短6,458bp，对其进行全基因测序，筛查得到高频SNP位点7个，采用上述2中方法进行基因分型，经SPSS统计软件11.0版(免费下载于http//linkage.rockefeller.edu/soft/)分析，有1个SNP位点位于KCNJ11基因第二个外显子的第764位，在NCBI的SNP数据库中的编号是(rs5215)，等位基因频率分布在两组中差异有统计学意义(P＜0.05)，如表4所示。
表4 病例组与对照组SNP分型SPSS统计分析结果等位基因SNP C T A G 总计P值病例组 301237538 0.040rs203849 对照组 345211556总计 6464481094位于KCNJ11基因中的1个SNP位点rs5215的等位基因频率在病例组和对照组存在显著差异，因此提示这一位点与2型糖尿病相关。进而提示KCNJ11基因为一种新的糖尿病易感基因。
KCNJ11的基因组序列如SEQ ID NO22所示，全长为6,458bp，所揭示的SNP位点(R)位于该基因的3,870-4,730位之间，这一区域的核苷酸序列如图1A所示，图中R为SNP位点，其代表碱基G/A多态性，即该位点可以为G，也可以为A。这一区域的互补序列如图1B所示，图中Y代表所述SNP位点的互补碱基，其代表碱基C/T。
基于这一SNP位点，可以设计适当长度的引物，用于经PCR扩增而预测糖尿病易感性。
实施例2 预测糖尿病易感性引物的设计及糖尿病易感性的预测1、ARMS-PCR引物ARMS-PCR引物设计遵循以下原则引物长度在18～30base之间，Tm值在55～80℃之间。最适内部PCR产物长度350bp，两条内部PCR产物长度之比为1.3-2。针对KCNJ11基因中的这一SNP位点设计4条引物，如下表5所示表5 SEQ ID NO18-21所示的引物序列
以此组Tetra-primer ARMS-PCR引物对待测个体基因组DNA进行ARMS-PCR反应检测SNP位点的序列。
2、普通PCR扩增引物根据SNP位点所在的序列(图1A和1B)，设计如SEQ ID NO1-17所示的引物。如表1所示进行各种组合。以所述组合为引物，以得自待测个体血样的基因组DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行测序检测所述SNP位点的单核苷酸多态性。
SEQUENCE LISTING<110>中国医学科学院基础医学研究所北京诺赛基因组研究中心有限公司<120>预测中国人2型糖尿病易感性的试剂盒及引物<130>I20031212CB<160>22<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1gtggcaacag catcttcctg gt22<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>2aggttcctgc tgaggccaga aata 24<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3gttcctgctg aggccagaaa ta22<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>4tgggtggcaa cagcatcttc ct22<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>5ggttcctgct gaggccagaa ata 23<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>6ttcctgctga ggccagaaat ag22<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>7ttcctgctga ggccagaaat agc 23
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权利要求
1.用于预测2型糖尿病易感性的引物，所述引物为基于图1A或图1B的序列而设计的用于PCR扩增的特异引物，所述引物针对图中所示的SNP位点R而设计，长度为18-28个核苷酸。
2.如权利要求1所述的引物，其包含选自SEQ ID NO1-17组成的一组的一种序列。
3.如权利要求2所述的引物，其为具有SEQ ID NO18-21所示的序列的ARMS-PCR引物。
4.用于预测2型糖尿病易感性的试剂盒，其包含如权利要求1-3任一项所述的引物。
5.KCNJ11基因在制备用于预测2型糖尿病易感性的诊断剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及用于预测2型糖尿病易感性的试剂盒及引物，更具体地，本发明涉及利用新鉴别的2型糖尿病易感基因KCNJ11的一个单核苷酸多态性(SNP)位点设计的预测2型糖尿病易感性的试剂盒和引物。本发明还涉及KCNJ11基因在制备预测2型糖尿病易感性的诊断剂中的应用。
文档编号C12Q1/68GK1721550SQ200410068959
公开日2006年1月18日 申请日期2004年7月15日 优先权日2004年7月15日
发明者刘卓, 张永伟, 李云峰, 左瑾, 孟雁, 方福德, 沈岩, 强伯勤 申请人:中国医学科学院基础医学研究所, 北京诺赛基因组研究中心有限公司